Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu thành phần Protein của hạt và nhân gien Chaperonin của một số giống đậu tương (Glycine Max (L.) Merrill) sưu tập tại vùng núi Tây Bắc Việt Nam.
28(3): 71-76 Tạp chí Sinh học 9-2006 Nghiên cứu thành phần protein hạt nhân gien chaperonin số giống đậu tơng (Glycine max (L.) Merrill) su tập vùng núi tây bắc việt nam chu hoàng mậu, Lê Thị Thanh Hơng, NGUYễN PHú HùNG Đại học Thái Nguyên Trần đình long Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Cây đậu tơng (Glycine max (L.) Merrill) công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế hàm lợng dinh dỡng cao Hạt đậu tơng chứa tõ 38 - 40% protein, 12 - 24% lipit, c¸c loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin, xystin, lơxin ) nhiều loại vitamin (B1, B2, C, A, D, E, K, PP) [1] Protein dự trữ hạt đậu tơng chủ yếu -conglyxinin glyxin [6] Các tiểu đơn vị protein dự trữ hạt có tính bảo thủ cao, liên quan đến đặc tính chống chịu chất lợng hạt giống Việt Nam, nguồn gien đậu tơng đa dạng phong phú; giống đậu tơng nhập nội, giống lai tạo giống đột biến, có tập đoàn giống địa phơng Những giống đậu tơng địa phơng thờng có chất lợng hạt khả chống chịu với điều kiện bất lợi ngoại cảnh nh nóng, hạn, mặn, rét, úng vợt trội so với giống đậu tơng khác; đó, khả chịu nóng, chịu hạn giống đậu tơng đợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [3, 4, 8, 9] Tuy nhiên, tác giả tập trung nghiên cứu giống đậu tơng trồng tỉnh trung du đồng bằng, nguồn gien đậu tơng miền núi nói chung vùng núi Tây Bắc nớc ta nói riêng đa dạng, có nhiều đặc tính quý, đợc đồng bào dân tộc thiểu số a trồng, lại cha đợc quan tâm nghiên cứu i phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu 10 giống đậu tơng sử dụng nghiên cứu Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Đậu đỗ - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, đợc chia làm nhóm: nhóm gồm giống đậu tơng có nguồn gốc vùng núi Tây Bắc nh: vàng Mờng Khơng, azuki, BátXát, xanh Bắc Hà, Hà Giang cán Viện chuyên gia Nhật Bản su tập đồng bào dân tộc thiểu số thuéc hai tØnh Lµo Cai vµ Hµ Giang; nhãm gồm giống đậu tơng đợc trồng phổ biến miền Bắc nớc ta nh: AK06, ĐT12, ĐT93, M54, cúc vàng, lơ 75 Phơng pháp - Xác định hàm lợng protein tan theo phơng pháp Lowry dựa mô tả Nguyễn Văn Mùi [7]; xác định hàm lợng lipit theo phơng pháp chiết ête dầu hỏa (petroleum ether) - Phân tích phổ điện di protein dự trữ hạt theo phơng pháp Laemmli (1970) gel polyacrylamit 12,5% chøa SDS [5] - T¸ch chiÕt ADN tổng số từ mầm đậu tơng theo phơng pháp miniprep có cải tiến - Phát gien chaperonin kỹ thuật PCR với cặp mồi đợc sử dụng MC1 MC2 đợc tổng hợp từ hãng Invitrogien theo Trần Thị Phơng Liên [2, 3] MC1: > GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C MC2: ’ > CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATA TCA TC Chu kú nhiƯt cđa ph¶n øng PCR: 94oC - phót, 55oC - phót, 72oC - phút 20 giây; lặp lại 32 chu kú, 72oC - 10 phót; b¶o qu¶n ë 4oC - 71 ii Kết thảo luận Trọng lợng 100 hạt, hàm lợng protein lipit hạt giống đậu tơng Trọng lợng hạt đậu tơng tiêu quan trọng để đánh giá suất giống Kết bảng cho thấy hạt ba giống đậu tơng Bát Xát, AK06 ĐT12 to có trọng lợng 100 hạt cao hẳn so với giống đậu tơng azuki, xanh Bắc Hà vàng Mờng Khơng; cao giống đậu tơng Bát Xát (17,90 g), thấp giống đậu tơng azuki (6,78 g) Bảng Trọng lợng 100 hạt, hàm lợng protein lipit hạt giống đậu tơng Trọng lợng 100 hạt Hàm lợng protein Hàm lợng lipit Giống đậu tơng (g) (%) (%) Vàng Mờng Khơng 9,92 20,34 21,28 Azuki 6,78 20,90 5,78 Bát Xát 17,90 18,87 24,17 Hà Giang 12,80 21,26 16,85 Xanh Bắc Hà 7,80 22,80 7,74 AK06 15,67 22,59 18,06 Cúc vàng 11,54 19,48 18,80 ĐT12 15,82 22,19 16,18 ĐT93 12,00 19,53 15,69 Lơ 75 8,29 19,58 17,84 Đậu tơng đợc xếp vào loại trồng cung cấp nhiều protein lipit Kết bảng cho thấy hàm lợng protein tan hạt giống đậu tơng cao, dao động khoảng 18,87 - 22,80%; hàm lợng lipit hạt giống chênh lệch nhau, dao động từ 5,78 24,17% Các giống đậu tơng azuki, xanh Bắc Hà Hà Giang có hàm lợng lipit thấp, thấp giống azuki (5,78%) Giống cho hàm lợng lipit cao giống Bát Xát (24,17%) Các giống đậu tơng ĐT12, AK06 xanh Bắc Hà có hàm lợng protein cao, cao giống xanh Bắc Hà (22,80%) nhng hàm lợng lipit lại có 7,74%; ngợc lại, giống đậu tơng Bát Xát có hàm lợng protein thấp (18,87%), nhng lại có hàm lợng lipit cao (24,17%) Nh vậy, hàm lợng protein lipit hạt giống đậu tơng có mối tơng quan nghịch Phổ điện di protein hạt giống đậu tơng Hạt đậu tơng đợc bóc vỏ, nghiền nhỏ tới dạng bột mịn chiết protein theo hai cách: protein đợc chiết NaCl 1M protein đợc chiết H2O khử ion Dịch chiết protein đợc tiến hành phân tích điện di gel polyacrylamit 12,5% có SDS (hình 1) 72 Kết phân tích phổ điện di protein dự trữ chiết NaCl 1M bao gồm hầu hết albumin globulin Hình cho thấy phổ điện di protein giống đậu tơng có số băng điện di dao động từ 16 - 28 băng Từ kết phân tích hình ảnh điện di protein, dựa thang protein chuẩn, kích thớc băng điện di đợc xác định, rõ băng tơng ứng với tiểu phần globulin dự trữ hạt, bao gồm tiểu đơn vị: , , , --conglyxinin tơng ứng với khối lọng phân tử 55-78 kDa; γconglyxinin (kho¶ng 67 kDa); A3-glyxinin (47 kDa); nhãm vạch trùng A1a, A1b, A2, A4glyxinin (39 kDa); A6, A7-glyxinin (kho¶ng 36 kDa); nhãm B1a, B1b, B2, B4-glyxinin (21 kDa) tiểu đơn vị có khối lọng phân tử nhỏ A5glyxinin (14,4 kDa) Nhìn chung, tiểu đơn vị globulin phân bố giống đậu tơng giống Tuy nhiên, đáng ý sù kh¸c biƯt râ rƯt cđa gièng azuki so víi giống lại giống azuki không thấy xuất hai tiểu đơn vị , -conglyxinin Theo Phan Hữu Tôn cs thiếu hụt đồng thời hai tiểu đơn vị , -conglyxinin gien lặn (ký hiƯu lµ a, cã alen tréi lµ A) quy định, phân ly theo tỷ lệ bất thờng là: 3AA: 4Aa: 1aa [6] kDa M 94 67 43 Lipoxygenaza α’β-conglyxinin α’β-conglyxinin γ-conglyxinin β-amylaza β-β-conglyxinin γ-β-conglyxinin A3-glyxinin A1a-A1b-A2-A4 glyxinin A6-A7-glyxinin 20 B3-glyxinin B1a-B1b-B2-B4 glyxinin A5-glyxinin 14,4 kDa M A 94 67 43 20 14,4 B Hình Phổ điện di protein chiết b»ng NaCl 1M (A) vµ H20 (B) cđa gièng đậu tơng Ghi chú: M thang protein chuẩn; Bát Xát - Lào Cai; vàng Mờng Khơng; azuki; Hà Giang; xanh Bắc Hà; Cúc vàng; ĐT93; ĐT12; AK06; băng điện di xuất hiện; Nh vậy, giống đậu tơng azuki có kiểu gien đồng hợp lặn (aa) tính trạng Đặc biệt, nhận thấy giống đậu tơng azuki thiếu hụt tiểu đơn vị B3-glyxinin tơng ứng với kích thớc khoảng 20 kDa, tiểu đơn vị cấu trúc G4 (A5A4B3) [4, 6] Điều cho thấy protein dự trữ hạt giống đậu tơng azuki loại glyxinin Kết thu đợc phù hợp với tác giả Kitamura nghiên cứu giống đậu tơng Nhật Bản [4] Ngợc lại, khoảng kích thớc phân tử từ 14 - 35 kDa, giống đậu tơng azuki, xuất tiểu đơn vị đặc trng thuộc nhóm glyxinin, nhng kích thớc chúng lại có chênh lệch so với tiểu đơn vị tơng ứng giống khác Nh vậy, sản phẩm băng điện di protein không xuất locut đa alen Ngoài ra, nhận thấy hai giống đậu tơng Bát Xát vàng Mờng Khơng có thiếu hụt tiểu đơn vị nằm khoảng kích thớc phân tử 43 - 67 kDa; hai giống ĐT12 AK06, xuất thêm tiểu đơn vị có kích thớc phân tử ớc lợng 20 - 30 kDa Các protein thuộc nhóm albumin có băng vạch đợc xác định tơng ứng với tiểu đơn vị lipoxygenaza (khối lợng phân tử 94 kDa) -amylaza (58 kDa) Kết mà nhận đợc phù hợp với công bố Trần Thị Phơng Liên cs (1999) [4] Tuy nhiên, nghiên cứu này, nhận thấy giống đậu tơng azuki có tiểu đơn vị 73 lipoxygenaza nhạt nhiều so với giống khác Lipoxygenaza loại enzim oxy hóa axit béo không no, tạo mùi vị đặc biệt làm hạn chế khả sử dụng đậu tơng công nghiệp thực phẩm Đây u điểm mặt chất lợng giống đậu tơng azuki Mặt khác, lipoxygenaza có vai trò làm tăng hàm lợng jasmonat - chất có liên quan đến khả chịu nóng, chịu hạn thực vËt [8] Vµ nh− vËy, rÊt cã thĨ gièng azuki giống đậu tơng chịu nóng Điều phù hợp với nguồn gốc su tập giống azuki Sa Pa-Lào Cai Phổ điện di protein chiết H2O bao gồm chủ yếu albumin phần globulin Do tế bào có ion hợp chất hữu với khối lợng phân tử thấp dễ tan nớc, nên chiết nớc, chúng tạo thành dung dịch muối loãng, đủ để hòa tan phần globulin Nhìn chung, phổ điện di protein chiết nớc có đa hình rõ rệt so với phổ điện di protein chiết muối Trong khoảng kích th−íc ph©n tư tõ 67 - 94 kDa, ë hai giống Bát Xát vàng Mờng Khơng xuất tiểu đơn vị protein đặc trng mà giống khác Ngợc lại, khoảng kích thớc này, giống azuki lại thiếu tiểu đơn vị protein Tơng tự nh vậy, khoảng kích thớc phân tử từ 43 - 67 kDa, giống azuki thiếu tiểu đơn vị protein, hai giống ĐT12 AK06 thiếu tiểu đơn vị protein so với giống lại Ngoài ra, giống azuki thể khác biệt so với giống lại xuất tiểu đơn vị protein đặc trng có kích thớc phân tử nhỏ 14,4 kDa tiểu đơn vị khoảng kích thớc phân tử từ 14,4 - 20 kDa Mặt khác, khoảng kích thớc phân tử từ 14,4 - 20 kDa ứng với protein thuộc nhóm glyxinin giống đậu tơng, xuất nhiều băng điện di phụ so với phổ điện di protein chiết muối; đồng thời băng ®iƯn di chÝnh cđa nã còng cã ®é ®Ëm nÐt hẳn Điều chứng tỏ tính hoà tan nớc tiểu đơn vị protein tăng lên Nh vậy, từ kết phân tích phổ điện di protein cho thấy protein dự trữ hạt giống đậu tơng nghiên cứu biểu đa hình Đặc biệt, nhận thấy thành phần protein dự trữ giống azuki có khác biệt lớn so với giống khác Đây xem nh đối tợng cần đợc quan tâm nghiên cứu sâu mức độ phân tử Tách chiết ADN tổng số nhân gien chaperonin phản ứng PCR ADN tổng số đợc tách chiết từ mầm đậu tơng ngày tuổi theo phơng pháp miniprep có cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm; sản phẩm đợc kiểm tra cách điện di gel agaroza 0,8% (hình 2) xác định hàm lợng phơng pháp quang phổ hấp thụ Kết cho thấy hàm lợng ADN thu đợc dao động khoảng từ 120,09 - 179,63 ng/àl có băng điện di nhất, không đứt gãy Từ nồng độ ADN gốc, tiến hành pha loãng với hệ số khác để thực phản ứng PCR Kết cho thấy, nồng độ ADN khuôn tối u đợc sử dụng cho phản ứng PCR đậu tơng khoảng 5-15 ng Hình Hình ảnh điện di ADN tổng số AK06; vàng Mờng Khơng; ĐT12; xanh Bắc Hà; azuki; ĐT93; M54; cúc vàng 74 Trên sở xác định đợc nồng độ ADN khuôn tối u cho phản ứng PCR, tiến hành nhân gien chaperonin giống đậu tơng, có giống thuộc vùng núi Tây Kb M 2,0 1,5 Bắc (azuki, vàng Mờng Khơng, xanh Bắc Hà) hai giống ĐT93, M54 Sản phẩm PCR đợc kiểm tra điện di gel agaroza 0,8% (hình 3) 1,6 0,6 Hình Hình ảnh điện di gien chaperonin giống đậu tơng M thang ADN chuẩn; ĐT 93; vàng Mờng Khơng; azuki; M54; xanh Bắc Hà Kết hình cho thấy giống đậu tơng thu đợc sản phẩm PCR đặc hiệu, với kích thớc phân tử khoảng ~ 1,6 kb Kích thớc phân tử sản phẩm PCR nhận đợc kích thớc phân tử cDNA gien chaperonin giống đậu tơng Nhật Bản [2] Điều chứng tỏ giống đậu tơng nghiên cứu có mặt gien chaperonin intron cấu trúc gien Kết nghiên cứu phù hợp với kết luận Trần Thị Phơng Liên cs (1999) [4] Sản phẩm PCR thu đợc đáp ứng cho nghiên cứu IV Kết luận Đã xác định đợc hàm lợng protein, hàm lợng lipit 10 giống đậu tơng Hàm lợng protein hàm lợng lipit có mối tơng quan nghịch Giống đậu tơng xanh Bắc Hà có hàm lợng protein tan cao nhÊt (22,80%) Phỉ ®iƯn di protein dự trữ hạt gel polyacrylamit 12,5% chứa SDS có biểu sai khác số tiểu đơn vị protein giống đậu tơng Trong đó, sai khác thể rõ giống đậu tơng vùng núi Tây Bắc Đặc biệt, giống azuki có số lợng băng điện di thấp (18 băng) phổ điện di protein dự trữ hạt giống azuki có sai khác tiểu đơn vị -conglyxinin glyxinin so với giống khác ADN tổng số đợc tách chiết từ mầm đậu tơng có khả hoạt động tốt phản ứng PCR Bằng kỹ thuật PCR, nhân thành công gien chaperonin tế bào chất có kích thớc phân tử 1,6 kb giống đậu tơng: azuki, vàng Mờng Khơng, xanh Bắc Hà, ĐT93 M54 Tài liệu tham khảo Nguyễn Văn Bình cs., 1996: Giáo trình Cây công nghiệp: 5-36 Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nong V H et al., 2000: Japanese journal of Biochemistry: 201-300 Trần Thị Phơng Liên cs., 1998: Tạp chí Khoa học Công nghệ, 36(5): - 14 Trần Thị Phơng Liên, 1999: Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tơng có khả chịu nóng, chịu hạn ë ViƯt Nam Ln ¸n tiÕn sü 75 sinh häc, Hµ Néi Laemmli U K., 1970: Natural, 227: 680688 Phan Hữu Tôn, 1997: Tạp chí Di truyền học ứng dụng, 3: 34-38 Hà Nội Nguyễn Văn Mùi, 2001: Thực hành hóa sinh học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Hoàng Thị Thu Yến cs., 2003: Những vấn đề nghiên cứu khoa häc sù sèng: 1073-1076, Nxb Khoa häc vµ Kü thuật, Hà Nội Hoàng Thị Thu Yến cs., 2004: Những vấn đề nghiên cứu khoa häc sù sèng: 723-727 Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi STUDY OF THE SEED PROTEIN COMPOSITION AND THE AMPLIFICATION OF THE CYTOSOLIC CHAPERONIN GENE FROM SOME SOYBEAN CULTIVARS OF THE NORTH-WEST MOUNTAINOUS REGION, VIETNAM CHU HOANG MAU, LE THI THANH HUONG, NGUYEN PHU HUNG, TRAN DINH LONG Summary The seeds of some soybean cultivars of the North-West mountainous region, Vietnam (vang Muong Khuong, azuki, Bat Xat, Ha Giang, xanh Bac Ha, AK06, Cuc vang, DT12, DT93, Lo 75 and M54) were used to study of the seed protein composition and the amplification of the cytosolic chaperonin gene; among them, the vang Muong Khuong, azuki, Bat Xat-Lao Cai, Ha Giang and xanh Bac Ha cultivars were local ones These seeds were used to extract lipid and storage proteins The total protein content in the seeds of these soybean cultivar was from 18.87 - 22.80% of dry weight and this value was highest in the xanh Bac Ha cultivar (22.80%) The total lipid content was from 5.78 - 24.17% of dry weight and especially the azuki cultivar had the lowest lipid percentage (5.78%) The seed protein fractions of some soybean cultivars were analyzed by 12.5% - SDS polyacrylamide gel electrophoresis The analytic result showed that the storage proteins of some local soybean cultivars had the polymorphism Especially, the result showed the difference in β-conglycinin and glycinin subunits distribution of the azuki cultivar in comparison with other cultivars The total genomic DNAs from the soybean seedlings have been isolated The cytosolic chaperonin gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with the molecular weight about 1.6 kb from five soybean cultivars Ngµy nhËn bµi: 15-5-2005 76 ... protein dự trữ hạt gel polyacrylamit 12,5% chứa SDS có biểu sai khác số tiểu đơn vị protein giống đậu tơng Trong đó, sai khác thể rõ giống đậu tơng vùng núi Tây Bắc Đặc biệt, giống azuki có số. .. tiểu đơn vị protein tăng lên Nh vậy, từ kết phân tích phổ điện di protein cho thấy protein dự trữ hạt giống đậu tơng nghiên cứu biểu đa hình Đặc biệt, nhận thấy thành phần protein dự trữ giống azuki... lợng 100 hạt cao hẳn so với giống đậu tơng azuki, xanh Bắc Hà vàng Mờng Khơng; cao giống đậu tơng Bát Xát (17,90 g), thấp giống đậu tơng azuki (6,78 g) Bảng Trọng lợng 100 hạt, hàm lợng protein