NGHIÊN cứu sự đa DẠNG DI TRUYỀN của một số GIỐNG đậu TƯƠNG có KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH gỉ sắt KHÁC NHAU

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Vũ Thanh Trà NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Chu Hoàng Mậu 2. TS. Trần Thị Phương Liên Thái Nguyên - 2012 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả đã được công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận án Vũ Thanh Trà ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải và các cán bộ Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS. Nguyễn Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết và các cán bộ Bộ môn Miễn dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh. Công trình được thực hiện và hoàn thành với việc sử dụng các trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các từ viết tắt v Danh mục các bảng vii Danh mục các hình viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Cây đậu tương và và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 4 1.1.1. Cây đậu tương 4 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 5 1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 9 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 9 1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương 13 1.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương 17 1.3.1. Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái 17 1.3.2. Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học 18 1.3.3. Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA 20 1.4. Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 26 1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương 29 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Vật liệu 33 2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh 33 2.1.2. Hóa chất 37 2.1.3. Máy mọc và thiết bị 37 2.1.4. Mồi của phản ứng RAPD và SSR 38 2.2. Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo 40 iv 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa sinh 43 2.2.3. Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA 44 2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein 48 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương nghiên cứu 53 3.2. Phân tích đặc điể̉m hóa sinh hạt của các giống đậu tương nghiên cứu 58 3.2.1. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid trong các hạt của các giống đậu tương nghiên cứu 58 3.2.2. Phân tích tính hàm lượng và thành phần amino acid trong hạt của một số giống đậu tương 61 3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt 64 3.3.1. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử RAPD 64 3.3.2. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR 70 3.4. Phân tích tính đa hình protein lá của một số giống đậu tương phản ứng khác nhau vớ́i bệnh gỉ sắt 76 3.4.1. Kết quả phân tích sự đa hình protein ở lá của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE 77 3.4.2. Lập bản đồ hệ protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều 79 3.4.3. Nghiên cứu tính đa hình protein của các giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều 90 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99 1. Kết luận 99 2. Đề nghị 100 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µl Microliter 2DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều AFLP Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân đoạn được nhân bản APS Ammonium persulfate AUDPC Area Under Disease Progress Curve Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan Bp Base pair CHAPS 3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio] Cm Centimeter CTAB Cetylmethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamine tetra acetic acid ESI-Q TRAP Elecspray ionization Q Trap - Phương pháp khối phổ sử dụng tính năng bẫy ion kết hợp nguồn ion hóa bằng cách phun chùm điện tử EtBr Ethidium bromide HPLC High-performance liquid chromatography-Sắc ký lỏng hiệu năng cao IAA Indole-3-acetamide IEF Isoelectric Focusing – Phương pháp điện di theo điểm đẳng điện IMA Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria INTSOY International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế, Hoa Kỳ IPG Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định IRRI International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc tế, Philippin Kb Kilo base vi kDa Kilo Dalton mA MiliAmpe MAS Marker Assisted Selection -Ch ọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử ml Mililiter MS/MS Mass spectrometry/ Mass spectrometry - khối phổ liên tục NST Nhiễm sắc thể OD Optical Density - Mật độ quang học PCR Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase PEG Polyethylene glycol PIC Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình PMSF Phenylmethanesulphonylfluoride PR protein Pathogenesis-related protein - protein liên quan đến mầm gây bệnh. QTL Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng R gen Resistant gen – gen kháng bệnh R protein Resistant protein - protein kháng bệnh RAPD Ramdom amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên RFLP Restriction fragment length polymorphism - đa hình về chiều dài phân đoạn cắt hạn chế RNA Ribonucleic acid SAR Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống SDS Sodium dodecyl sulfate SDS- PAGE SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis -Điện di biến tính trên gel polyacrylamide có SDS SSR Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản TAE Tris acetate EDTA TCA Trichloracetic acid TEMED N,N,N’,N’ Tetramethylethylenediamine UPGMA Phương pháp phân nhóm V Volt w/v Weight/volume vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu 33 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD 38 Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR 39 Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến 46 Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide 49 Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt 53 Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit trong hạt của 50 giống đậu tương 59 Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giống đậu tương 63 Bảng 3.4. Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu 67 Bảng 3.5. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR 72 Bảng 3.6. Danh sách các protein của lá đậu tương giống DT2000 được nhận diện bằng phương pháp khối phổ 84 Bảng 3.7. Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh (DT12 và VMK) 92 Bảng 3.8. Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau giữa thí nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh DT12 và VMK 93 Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và giống kháng (DT2000, CBU8325) 96 Bảng 3.10 . Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm với và giống kháng bệnh gỉ sắt 97 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (A) 10 Hình 1.2. Hình ảnh nấm gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương P. pachyrhizi chụp dưới kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.3. Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm 14 Hình 1.4. Sơ đồ phân tách protein bằng diện di 2DE 19 Hình 2.1. Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm 42 Hình 2.2. Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry 43 Hình 3.1. Lá của các giống đậu tương với 3 mức độ phản ứng với bệnh gỉ sắt 57 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 65 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18 66 Hình 3.4. Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân nhóm UPGMA 69 Hình 3.5. Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C) Satt 005 (D) của 50 giống đậu tương 71 Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR 74 Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá đậu tương VMK, CBU8325 đối chứng và nhiễm bệnh ở hai giống đậu tương DT12 và VMK 9 ngày tuổi 78 ix Hình 3.8. Hình ảnh điện di 2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu tương giống DT2000 ở thời điểm 6 (A) ngày và 9 ngày (B) 79 Hình 3.9. So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống DT12, DT2000, CBU8325 và VMK 81 Hình 3.10. Kết quả phân tích và nhận diện protein catalase bằng sắc ký - khối phổ 83 Hình 3.11. Phân nhóm chức năng hệ protein lá đậu tương giống DT2000 89 Hình 3.12. So sánh đa dạng protein lá đậu tượng đối chứng và thí nghiệm của 2 giống sau khi gây nhiễm bệnh 9 ngày (DT12 và VMK) 91 Hình 3.13. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9 ngày của hai giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và 2 giống kháng bệnh gỉ sắt (DT2000 và CBU8325) 95 [...]... triển bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt. .. chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau 2 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Đánh giá được khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh. .. đậu tương với bệnh gỉ sắt nhằm phát hiện các giống kháng và nhiễm mới 2.2 Xác định được sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA của các giống đậu tương nghiên cứu 3 2.3 So sánh đa hình protein, lập được bản đồ điện di protein lá đậu tương, sơ bộ rút ra được nét đặc trưng về protein giữa giống kháng và giống nhiễm 3 Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương - Xác định... của các giống đậu tương nghiên cứu - Phân tích sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR - Lập bản đồ điện di protein lá đậu tương và định danh hệ protein lá bằng phương pháp điện di một chiều, hai chiều và nhận di n protein trên hệ sắc ký-khối phổ Đồng thời phân tích, so sánh sự đa dạng thành phần protein lá của một số giống đậu tương nhiễm và kháng bệnh. .. tôi mong muốn nghiên cứu tìm hiểu và lập bản đồ hệ protein của lá đậu tương, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo 1.2 Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương Hầu hết... gen kháng bệnh và các hệ thống bảo vệ là rất phức tạp do có sự tham gia của nhiều gen khác nhau Một số nghiên cứu sàng lọc giống đã được tiến hành để phát hiện các giống đậu tương có khả năng kháng/ chống chịu với nấm gây bệnh P pachyrhizi [58], [79] Các nghiên cứu về gen cho thấy năm gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 và Rpp5 đã được phát hiện và mô tả là có khả năng liên quan đến tính kháng đối với một số. .. hạt, đáp ứng được nhu cầu đậu tương trong nước cũng như phục vụ xuất khẩu Do đó, nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương mới có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao là một giải pháp mang tính chiến lược cho sự phát triển bền vững Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào... nhiên chưa có một giống đậu tương nào có phổ kháng rộng với tất cả các chủng nấm P pachyrhizi và hiện nay phần lớn các giống đậu trên thị trường được trồng ở Mỹ đều khá mẫn cảm với bệnh gỉ sắt [102] 1.2.2.2 Tính kháng một phần bệnh gỉ sắt ở đậu tương Các dòng mang tính kháng một phần hoặc các dòng chậm bị bệnh gỉ sắt đã được xác định và mô tả dựa trên thời gian ủ bệnh và số lượng cụm bào tử hạ có trong... Nhật Bản, 1 giống có nguồn gốc từ Triều Tiên Giống Tainung 4 có sức kháng bệnh nhiều hơn các giống khác trong điều kiện đồng ruộng, số lượng vết bệnh ít hơn [6] Ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ kết hợp Phòng thí nghiệm Nghiên cứu bệnh thực vật và AVRCD đã khởi động một dự án hợp tác nghiên cứu dịch tễ học của bệnh gỉ sắt đậu tương năm 1978 Dự án này kéo dài đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt được tiếp... ở cây đậu tương Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về gỉ sắt [32], [52], [77], [81] Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt gây thiệt hại nghiêm trọng đến cây đậu tương và làm hạn chế năng xuất đậu tương vụ xuân Trung tâm Rau màu Châu Á (AVRCD) của Đài Loan đã tiến hành so sánh 1080 giống, kết quả có 9 mẫu giống kháng bệnh trung bình, trong đó có 4 mẫu giống có nguồn gốc từ Trung Quốc, 3 giống có nguồn . hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này. Việc nghiên cứu sự đa dạng. PHẠM Vũ Thanh Trà NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN. tạo giống có chất lượng cao. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác