NGHIÊN cứu sự đa DẠNG DI TRUYỀN của một số GIỐNG đậu TƯƠNG có KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH gỉ sắt KHÁC NHAU

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều AFLP Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân đoạn được nhân bản AUDPC Area

Vũ Thanh Trà

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN

CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG

KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 70 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

1 PGS.TS Chu Hoàng Mậu

2 TS Trần Thị Phương Liên

Thái Nguyên - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Chu Hoàng Mậu và TS Trần Thị Phương Liên Các

số liệu trình bày trong luận án là trung thực Một số kết quả đã được công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong

luận án này

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2012

Tác giả luận án

Vũ Thanh Trà

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Mậu và

TS Trần Thị Phương Liên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nông Văn Hải và các cán bộ Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS Nguyễn

Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết và các cán bộ Bộ môn Miễn

dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án

Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ

và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh

Công trình được thực hiện và hoàn thành với việc sử dụng các trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên)

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt v

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cây đậu tương và và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 4

1.1.1 Cây đậu tương 4

1.1.2 Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 5

1.2 Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 9

1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 9

1.2.2 Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương 13

1.3 Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương 17

1.3.1 Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái 17

1.3.2 Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học 18

1.3.3 Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA .20

1.4 Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương .26

1.5 Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương .29

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Vật liệu 33

2.1.1 Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh 33

2.1.2 Hóa chất 37

2.1.3 Máy mọc và thiết bị 37

2.1.4 Mồi của phản ứng RAPD và SSR 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1 Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo 40

2.2.2 Các phương pháp phân tích hóa sinh 43

2.2.3 Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA 44

2.2.4 Các phương pháp phân tích đa hình protein 48

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương nghiên cứu 53

3.2 Phân tích đặc điể̉m hóa sinh hạt của các giống đậu tương nghiên cứu 58

3.2.1 Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid trong các hạt của các giống đậu tương nghiên cứu .58

3.2.2 Phân tích tính hàm lượng và thành phần amino acid trong hạt của một số giống đậu tương 61

3.3 Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt 64

3.3.1 Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử RAPD 64

3.3.2 Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR .70

3.4 Phân tích tính đa hình protein lá của một số giống đậu tương phản ứng khác nhau vớ́i bệnh gỉ sắt 76

3.4.1 Kết quả phân tích sự đa hình protein ở lá của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE 77

3.4.2 Lập bản đồ hệ protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều 79

3.4.3 Nghiên cứu tính đa hình protein của các giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều 90

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99

1 Kết luận 99

2 Đề nghị 100

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO 102

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

2DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều

AFLP Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các

phân đoạn được nhân bản

AUDPC Area Under Disease Progress Curve

Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh

AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát

triển rau màu Châu Á, Đài Loan

CHAPS 3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio]

CTAB Cetylmethylammonium bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

Elecspray ionization Q Trap - Phương pháp khối phổ sử dụng tính

năng bẫy ion kết hợp nguồn ion hóa bằng cách phun chùm điện tử

EtBr Ethidium bromide

HPLC High-performance liquid chromatography-Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IAA Indole-3-acetamide

IEF Isoelectric Focusing – Phương pháp điện di theo điểm đẳng điện IMA Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria

INTSOY International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu

tương Quốc tế, Hoa Kỳ

IPG Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định

IRRI International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc

tế, Philippin

kDa Kilo Dalton

OD Optical Density - Mật độ quang học

PCR Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase PEG Polyethylene glycol

PIC Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình

PMSF Phenylmethanesulphonylfluoride

PR protein Pathogenesis-related protein - protein liên quan đến mầm gây bệnh QTL Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng

R gen Resistant gen – gen kháng bệnh

R protein Resistant protein - protein kháng bệnh

RAPD Ramdom amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân

bản ngẫu nhiên RFLP Restriction fragment length polymorphism - đa hình về chiều dài

phân đoạn cắt hạn chế RNA Ribonucleic acid

SAR Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis -Điện di biến tính trên gel polyacrylamide có SDS

SSR Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản

TAE Tris acetate EDTA

TCA Trichloracetic acid

TEMED N,N,N’,N’ Tetramethylethylenediamine

UPGMA Phương pháp phân nhóm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu 33

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD .38

Bảng 2.3 Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR 39

Bảng 2.4 Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến 46

Bảng 2.5 Thành phần gel polyacrylamide 49

Bảng 3.1 Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt .53

Bảng 3.2 Hàm lượng protein và lipit trong hạt của 50 giống đậu tương 59

Bảng 3.3 Thành phần của các amino acid của 20 giống đậu tương 63

Bảng 3.4 Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu 67

Bảng 3.5 Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR 72

Bảng 3.6 Danh sách các protein của lá đậu tương giống DT2000 được nhận diện bằng phương pháp khối phổ 84

Bảng 3.7 Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh (DT12 và VMK) 92

Bảng 3.8 Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau giữa thí nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh DT12 và VMK 93

Bảng 3.9 Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và giống kháng (DT2000, CBU8325) 96

Bảng 3.10 Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm với và giống kháng bệnh gỉ sắt 97

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh

bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (A) 10

Hình 1.2 Hình ảnh nấm gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương P pachyrhizi chụp

dưới kính hiển vi điện tử 12

Hình 1.3 Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm 14 Hình 1.4 Sơ đồ phân tách protein bằng diện di 2DE 19 Hình 2.1 Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng

thí nghiệm .42 Hình 2.2 Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry 43 Hình 3.1 Lá của các giống đậu tương với 3 mức độ phản ứng với bệnh

gỉ sắt 57

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 65

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18 66

Hình 3.4 Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương

đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân

nhóm UPGMA 69 Hình 3.5 Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C) Satt

005 (D) của 50 giống đậu tương 71 Hình 3.6 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản

ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR 74 Hình 3.7 Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá

đậu tương VMK, CBU8325 đối chứng và nhiễm bệnh ở hai

giống đậu tương DT12 và VMK 9 ngày tuổi .78

Hình 3.8 Hình ảnh điện di 2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu

tương giống DT2000 ở thời điểm 6 (A) ngày và 9 ngày (B) 79 Hình 3.9 So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống

DT12, DT2000, CBU8325 và VMK 81 Hình 3.10 Kết quả phân tích và nhận diện protein catalase bằng sắc ký -

khối phổ 83 Hình 3.11 Phân nhóm chức năng hệ protein lá đậu tương giống DT2000 89 Hình 3.12 So sánh đa dạng protein lá đậu tượng đối chứng và thí nghiệm

của 2 giống sau khi gây nhiễm bệnh 9 ngày (DT12 và VMK) 91 Hình 3.13 So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9

ngày của hai giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và 2

giống kháng bệnh gỉ sắt (DT2000 và CBU8325) 95

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có

giá trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt

có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau Hạt đậu tương chứa 30-55% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế (lysine, leucine, tryptophan, methionine, cysteine…), 12-25% lipid và các vitamin (B1, B2, C, D, E, K…) cần thiết cho cơ thể Các sản phẩm từ đậu tương được

sử dụng rộng rãi cho các mục đích khác nhau như làm thức ăn, dầu ăn, thực

phẩm chức năng, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R

Japonicum sống cộng sinh trên rễ cây tạo thành các nốt sần Vì thế, việc trồng cây đậu tương không chỉ mang lại hiệu quả kinh tế cao mà còn có tác dụng cải tạo đất Do đó, cây đậu tương đã được quan tâm trồng và phát triển mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới Ở Việt Nam, đậu tương là nhóm cây trồng chính được ưu tiên khuyến khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc

Việt Nam từng là một nước “xuất khẩu” đậu tương vào những năm

1980 theo hạng mục tiểu ngạch, tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành

nước nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn hàng triệu tấn khô dầu đậu tương đang được nhập khẩu hàng năm Mặc dù diện tích gieo trồng có tăng hàng năm nhưng năng suất thấp và sản lượng đạt được không ổn định, khả năng

chống chịu bệnh và các stress kém Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới diện tích gieo trồng và làm giảm năng suất, chất lượng hạt đậu tương, gây tổn thất lớn về kinh tế

Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra và đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tương gây thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất lượng đậu tương ở

nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam Yêu cầu đặt ra hiện nay là cần phải chuyển giao các tiến bộ khoa học kỹ thuật đặc biệt là tạo ra những giống cây có năng suất cao, có khả năng chống chịu bệnh để đưa vào sản xuất mở

rộng diện tích gieo trồng và nâng cao chất lượng hạt, đáp ứng được nhu cầu đậu tương trong nước cũng như phục vụ xuất khẩu Do đó, nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương mới có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao là một giải pháp mang tính chiến lược cho sự phát triển bền vững

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trình phát triển bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này Việc nghiên

cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối

với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có

chất lượng cao

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng

kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Đánh giá được khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh gỉ

sắt nhằm phát hiện các giống kháng và nhiễm mới

2.2 Xác định được sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA của các giống đậu tương nghiên cứu

2.3 So sánh đa hình protein, lập được bản đồ điện di protein lá đậu tương, sơ

bộ rút ra được nét đặc trưng về protein giữa giống kháng và giống nhiễm

3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương

- Xác định hàm lượng protein, lipid và thành phần amino acid trong hạt của các giống đậu tương nghiên cứu

- Phân tích sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR

- Lập bản đồ điện di protein lá đậu tương và định danh hệ protein lá bằng phương pháp điện di một chiều, hai chiều và nhận diện protein trên hệ

sắc ký-khối phổ Đồng thời phân tích, so sánh sự đa dạng thành phần protein

lá của một số giống đậu tương nhiễm và kháng bệnh gỉ sắt

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây đậu tương và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương

1.1.1 Cây đậu tương

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây thuộc họ đậu (Fabaceae) Chi Glycine có hai chi ph ụ là Glycine và Soja Chi phụ Soja có hai loài là

G.max (L.) Merrill và G soja Sieb et Zucc Glycine soja là dạng mọc leo hoang dại, hạt nhỏ, cứng và sản lượng thấp nên không được sử dụng trong nông nghiệp Glycine max không thấy mọc hoang dại

Về nguồn gốc, đậu tương có nguồn gốc từ Đông Á, có thể mọc hoang

dại từ thung lũng sông Dương Tử, các tỉnh phía Bắc và Đông Bắc Trung

Quốc, hoặc các vùng kế cận của Cộng hòa liên bang Nga, Triều Tiên và Nhật

Bản Hầu hết các giống đậu tương địa phương đang trồng tại nước ta hiện nay đều du nhập từ Trung Quốc [8]

V ề đặc điểm hình thái, cây đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá

mầm (lá tử diệp), lá nguyên (lá đơn) và lá kép, mỗi lá kép có từ 3 - 4, thậm chí đến 5 lá chét, mọc so le Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng cánh bướm, có màu sắc tuỳ từng giống khác nhau: màu trắng, tím, tím nhạt

Tỷ lệ đậu quả 20 - 30% tuỳ từng vụ Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông (có khả năng quang hợp do có

diệp lục) khi chín có màu nâu Tuỳ điều kiện canh tác mỗi cây con cho từ 20 -

400 quả Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt có giá trị dinh dưỡng cao Hạt to, nhỏ tuỳ theo các giống khác nhau, khối lượng 1000

hạt thay đổi trung bình từ 100 - 200g Màu sắc rốn hạt ở các giống khác nhau

là một biểu hiện đặc trưng của giống [9]

V ề đặc điểm di truyền, đậu tương Glycine max có bộ nhiễm sắc thể

(NST) lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo

Những nghiên cứu về hệ gen (genome) đậu tương cho thấy, bộ gen đậu tương

có từ 1,29 x 109 đến 1,8 x 109bp cho bộ đơn bội Trong số đó có khoảng 40 - 65% trình tự lặp lại (những trình tự này có kích thước nhỏ hơn 0,3 - 0,4kb), các trình tự không lặp lại chiếm khoảng 35 - 60% (có chiều dài 1,1 - 1,4kb) được xếp xen kẽ với trình tự lặp lại [95]

Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm

(từ 75 - 78 ngày); chín trung bình (từ 80 - 100 ngày) và chín muộn (từ 110

- 120 ngày) Thời gian sinh trưởng là yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây

trồng luân canh hay xen vụ Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và các mầm bệnh, các giống thường thích hợp với từng vụ khác nhau [3]

1.1.2 Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương

1.1.2.1 Thành phần protein trong hạt đậu tương

Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm từ 12-55% Thực tế cho

thấy, tuy kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong hạt của loài thực vật này nhưng chúng vẫn lớn hơn hàm lượng protein của nhiều loài thực vật khác [6] Protein được dự trữ trong bào quan có chức năng cung cấp nguồn amino acid và nitơ hoặc là các enzyme tham gia vào quá trình

nảy mầm của hạt Loại potein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin

Dựa vào hệ số lắng, người ta chia protein của hạt đậu thành 3 loại: 11S

- legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin Những loại protein chính trong hạt đậu tương là: protein dự trữ (chiếm 70% tổng số protein), các enzyme, các chất ức

chế protease và lectin Thành phần của protein gồm có albumin (9,5%), globulin tan trong nước (75,8%), globulin tan trong NaCl là 3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7%

Protein dự trữ trong hạt đậu tương bao gồm hai thành phần: conglyxinin (7,9S) và glyxinin (12,2S) Conglyxinin là vixilin của đậu tương,

có hệ số lắng là 7,9S, là protein dự trữ phổ biến trong hạt Conglyxinin tách

biệt ra trong các thể protein và được dự trữ trong suốt quá trình phát triển của

hạt Nó được thuỷ phân sau khi hạt nảy mầm để cung cấp nguồn carbon và nitơ cho hạt phát triển -conglyxinin là một trong những cấu tử của conglyxinin, có khối lượng phân tử là 140 - 180 kDa -conglyxinin gồm có nhiều tiểu phần khác nhau, trong đó có 3 tiểu phần chính là  (76 kDa), ’ (72 kDa),  (53 kDa) Ngoài ra, còn có các tiểu phần nhỏ khác hiếm hơn đã được mô tả là ’, ,  [94] Thành phần thứ hai là glyxinin với hệ số lắng 12,2S và là dạng legumin của đậy tương Glyxinin là protein chứa nhiều nhất trong đậu tương Glyxinin là một hexamer protein gồm 5 tiểu phần Mỗi tiểu

phần bao gồm một chuỗi polypeptide có tính acid (trọng lượng phân tử xấp xỉ

31 - 45 kDa) ký hiệu là A1a, A1b, A2, A3, A4 và chuỗi polypeptide có tính

kiềm (khối lượng phân tử xấp xỉ 18 - 20 kDa) ký hiệu là B1b, B1a, B2, B3, B4, được nối với nhau bằng cầu nối disulfide [114] Các giống đậu tương khác nhau cũng khác nhau về thành phần các chuỗi polypeptide cấu tạo nên glyxinin Glyxinin của các giống khác nhau đã được chứng minh là khác nhau

về thành phần amino acid, trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện (isoelectric

point-pI) Tỷ lệ giữa glyxinin và -conglyxinin là 1,6: 1,0 (biến thiên từ tỉ lệ 3,0: 1,0 đến 1,0: 1,0 tuỳ giống) Glyxinin là nguồn dự trữ carbon và nitơ và được tích trữ trong quá trình hình thành phôi

Protein của cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng được coi

là có chất lượng tốt nhất trong các loại protein của thực vật, bởi vì chúng chứa tất cả các amino acid không thay thế và cần thiết cho cơ thể Hơn nữa protein

của cây họ đậu còn có hàm lượng lysine rất cao so với protein từ các loại ngũ

cốc khác Tuy vậy, hàm lượng các amino acid chứa gốc SH như methionine, cysteine vẫn còn thấp [3]

1.1.2.2 Lipid, vitamin và một số chất khác trong hạt đậu tương

Lipid là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không có khả năng hoà tan trong nước, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, benzen, toluen, ete, dầu hoả Lipid còn là thành phần quan trọng của màng sinh học, là nguồn năng lượng cung cấp cho cơ thể Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là vitamin E (200 mg/100g lipid) Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một

số chất khác như carbohydrade, muối khoáng, nucleic acid, kích thích sinh trưởng [3] Nói chung, hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng rất cao Giá trị của

nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipid, trong đó hàm lượng protein dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quyết định, làm cho

hạt đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người và làm thức

ăn cho gia súc Hạt đậu tương có thể chế biến ra 600 sản phẩm khác nhau Bên cạnh đó, đậu tương còn được dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là

hạt đậu tương có màu đen

1.1.2.3 Protein lá và hệ protein lá đậu tương

Protein là các đại phân tử có ở lượng lớn trong tất cả các loại tế bào và các bào quan Protein lá đậu tương rất đa dạng, có hàng nghìn loại với kích thước phân tử khác nhau, từ những peptide nhỏ đến những phân tử với khối lượng lớn Protein có nhiều vai trò khác nhau về chức năng sinh học, nhưng chủ yếu đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp giúp tổng hợp chất dinh dưỡng từ nguồn năng lượng ánh sáng mặt trời

Hệ protein (Proteome) là phần bổ trợ của hệ gen (Genome), hệ protein

lá đậu tương bao gồm tất cả các protein có mặt trong tế bào lá ở một thời điểm nhất định Trong lá có các protein liên quan đến chu trình quang hợp,

các protein tham gia vào phản ứng quang hóa, các protein dự trữ, các enzyme, các chất đề kháng, chất oxi hóa Ở các mô khác nhau, các giai đoạn khác nhau hệ protein lại có sự khác nhau Vì hệ protein lá rất phong phú, đa dạng

và không ổn định như hệ gen của cây đậu tương cho nên nghiên cứu hệ protein lá không hề đơn giản và đòi hỏi sự kết hợp của rất nhiều công nghệ và

có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid

hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, stress như ascorbate peroxidase, catalase

1.1.2.4 Một số nghiên cứu về hệ protein lá đậu tương

Gần đây, các nghiên cứu về hệ protein thực vật sử dụng phương pháp điện di 2 chiều (Two dimension electrophoresis-2DE) đã được công bố [33], [58], [74], [86], [92] Một số nghiên cứu tập trung vào hệ protein của các bào quan như lục lạp [47], [72], ty thể [33], một số lại tập trung vào các mô thực vật như lá ngô [92], lá đào [101] Các nghiên cứu trên rễ đậu tương [116]

hoặc trên hạt đậu tương đã thu được một số kết quả đáng kể [58], [83], [86], tuy nghiên các nghiên cứu về protein ở lá đậu tương vẫn đang ở mức sơ khai Trong nghiên cứu của Sarma và cộng sự, các tác giả đã thành công trong việc phân tách hàng trăm các protein của các mô như lá, hạt và rễ đậu tương khi sử dụng phương pháp tách chiết protein và điện di 2 chiều [100] Trong khi đó, Krishnan và cộng sự đã nghiên cứu hệ protein lá đậu tương bằng phương pháp điện di 2 chiều và khối phổ, các tác giả đã phát hiện được 28 loại phosphoprotein trong lá [68] Tương tự trong nghiên cứu của Xu và cộng sự,

bằng phương pháp điện di và khối phổ các tác giả đã phân tách được 119 điểm protein trong đó đã nhận diện được 71 protein ở lá đậu tương [113] Đây

là hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn, bằng việc áp dụng các kỹ thuật proteomics (kỹ thuật nghiên cứu, phân lập, tách chiết, phân tách và nhận diện cấu trúc,

chức năng của hệ protein) các tác giả đã gợi ý các ứng dụng trong việc xác định các protein kháng bệnh

Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế Đặc biệt trong vấn đề phân tích, nhận dạng và lập bản đồ hệ protein lá đậu tương còn ít được công bố [113] Từ thực tiễn đó, trong khuôn khổ luận án này chúng tôi mong muốn nghiên cứu tìm hiểu và lập bản đồ hệ protein của lá đậu tương, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

1.2 Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương

1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương

Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những

bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng

kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương Hầu hết các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tương địa phương

Bệnh gỉ sắt (soybean rust) được phát hiện đầu tiên vào năm 1902 ở Nhật Bản sau

đó lan nhanh sang hầu hết các nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ [80] và Mỹ

[102] Các phát hiện về bệnh gỉ sắt ở Hawaii năm 1994 [67], Zimbabwe năm

1998 [69], Nigeria năm 1999 [28], Nam Mỹ năm 2001 [93], và Argentina năm

2002 [99] cho thấy nấm P pachyrhizi vẫn đang lan tràn sang các vùng địa lý

mới và ảnh hưởng nghiêm trọng đến mùa màng Bệnh gỉ sắt được coi là mối đe

dọa chính đối với năng suất đậu tương tại Mỹ [102] Ở Brazil, bệnh này gây thiệt hại 1,2 tỷ đô la chỉ riêng trong năm 2003 [115] Tại các nước bệnh đã trở thành

dịch, năng suất đậu tương có thể giảm từ 10% đến 80% [90]

Về mầm bệnh, bệnh gỉ sắt ở đậu tương do hai loài nấm là P pachyrhizi

và P meibomiae gây ra Loài n ấm gỉ sắt ở Châu Á P pachyrhizi Sydow là

loài gây hại nhất cho đậu tương và có độc tính cao hơn loài P Meibomiae (hình 1.2) Nấm gỉ sắt là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên toàn thế giới cũng như ở Việt Nam Nấm gỉ sắt là loại nấm ký sinh phá huỷ lớp tế bào bao bọc làm cho cây bị thoát hơi nước mạnh, các bộ phận cung cấp nước không thể tiếp tế đủ số nước bị mất đi, dẫn đến mất cân bằng giữa lượng nước hút vào và lượng nước thoát hơi, kết quả cây đậu tương bị héo

Hình 1.1 Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bào tử

nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B) [118]

Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: Nấm gỉ sắt phát triển trên tế bào và có

mặt ở hầu hết các vụ cây trồng, nhưng bệnh chỉ phát sinh và phá hại nặng

nhất trong vụ đậu tương xuân Bệnh gây hại nặng nhất ở lá, nhưng cũng có

thể ở trên thân, cành và quả Biểu hiện sớm nhất của bệnh là những chấm màu trong ở phiến lá, cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới kích thước từ 2-5mm với hình đa dạng, có góc cạnh (Hình 1.1A) Các vết

bệnh có thể phát triển rộng và liên kết với nhau thành từng mảng, làm cho phiến lá bị rách nát Ở mặt dưới phiến lá, nơi có vết bệnh, xuất hiện lớp bột màu nâu đó là các bào tử hạ của nấm Khi bị nấm tấn công, trong mỗi đốm lá

bị tổn thương có nhiều vết nứt, hoặc các ổ bào tử hạ (uredinia) màu nâu đỏ bên trong chứa các bào tử hạ (urediniospore) hình oval, màu sẫm, bề mặt có nhiều gai nhỏ (hình 1.1B và 1.2) Các thể bào tử sẽ được giải phóng từ các lỗ nhỏ hoặc vết nứt trên mặt lá Bệnh gỉ sắt phát sinh ở các lá già gần mặt đất, sau lan lên các bộ phận khác ở phía trên của cây Tác hại của bệnh gỉ sắt là làm cho

lá cây đậu tương giảm hoặc mất khả năng quang hợp, gây rụng lá hàng loạt dẫn đến giảm năng suất quả, tỷ lệ hạt lép cao Từ khi cây đậu tương có 5-6 lá và

nhất là khi bắt đầu ra hoa, bệnh xâm nhiễm mạnh nhất và sau đó phát triển kéo dài tới khi thu hoạch Nấm xâm nhiễm cả vào quả làm cho hạt không thể phát triển bình thường.Do đó, năng suất và phẩm chất hạt đậu tương bị giảm sút nghiêm trọng Những ruộng bị bệnh nặng hầu như không cho thu hoạch Bệnh

gỉ sắt thường tập trung cao điểm vào tháng 3 và tháng 4 khi nhiệt độ đạt từ 20 -

280C và cây đậu có từ 3 lá kép đến khi thu hoạch quả Đặc điểm này liên quan

tới sự tích luỹ và biến động hàm lượng protein và amino acid trong các giai đoạn sinh trưởng ở các tuổi cây khác nhau [6]

Hình 1.2 Hình ảnh nấm gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương P pachyrhizi chụp dưới

kính hiển vi điện tử [118]

Vòng đời và quá trình nhiễm bệnh: Ở loài nấm P Pachyrhizi có hai

dạng bào tử là bào tử hạ (urediniospore) và bào tử đông (telliospore) [37] Bào tử hạ là dạng phổ biến được phát hiện thấy ở các mùa vụ, chúng phát tán, lây lan trên đồng ruộng Giai đoạn bào tử hạ có thể lặp lại nhiều lần tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh Khi gặp điều kiện không thuận lợi hoặc vào cuối giai đoạn sinh trưởng của cây, trên vết bệnh có thể hình thành ổ bào tử đông màu đen Bào tử đông đơn bào, hình oval hoặc hình cầu có núm, vỏ dày, kích thước 24-35µm x 20-29µm Bào tử đông đóng vai trò là nguồn bệnh bảo tồn cho vụ sau Quá trình nhiễm bệnh bắt đầu khi bào từ hạ nảy mầm để hình thành một ống mầm phát triển trên bề mặt lá (đường kính 5-400 µm) cho đến khi sợi áp (appressorium) hình thành Ổ bào tử hạ

thường phát triển từ 5-8 ngày, tối đa lên đến 4 tuần sau khi lây nhiễm, quá trình sinh bào tử có thể kéo dài đến 3 tuần Từ khi lây nhiễm cho đến khi hình thành bào tử có thể kéo dài đến 15 tuần Thậm chí dưới điều kiện khô hạn, quá trình này còn diễn ra dài hơn

1.2.2 Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương

Bản chất của hiện tượng kháng là sự tương tác giữa cây trồng và vật gây hại trong môi trường sống Sự tương tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo

mô hình tương tác gen đối gen (gen for gen) [49] Theo đó, để xuất hiện tính kháng bệnh ở cây cần có gen trội hoặc bán trội ở cây (dominant resistance gene) và cả gen không gây hại cũng mang tính trội (dominat avirulence gene)

ở vật ký sinh Tuy nhiên cho đến nay, cơ chế kháng bệnh gỉ sắt và sự tương tác giữa mầm bệnh và cây chủ vẫn cần nhiều nghiên cứu để làm sáng tỏ

Theo giả thiết, sau khi bị nhiễm bệnh gỉ sắt, cây đậu tương sẽ có các

phản ứng tự vệ Hiện tượng tự vệ có thể do hệ thống SAR (Systemic acquired resistance) với sự tham gia của nhiều nhóm protein liên quan đến mầm bệnh (Pathogenesis-related protein - protein PR) hoặc protein kháng (Resistant protein - protein R) đảm nhận [44] Cụm gen R đã được phát hiện ở nhiều loài như lúa [105], Arabidopsis [34], [78], ngô [60], và đậu tương [51], [54], [66]

Cho đến nay, có nhiều nhóm protein PR với các chức năng khác nhau đã được phát hiện [73] Các protein này thường xuất hiện trong mô tế bào sau khi lây nhiễm bệnh từ vài phút đến vài giờ, chúng đều là các chất kháng khuẩn, kháng nấm và tham gia vào bảo vệ tế bào thực vật khỏi các tác động của mầm

bệnh [10], [44] Khi có sự tương tác giữa nấm và tế bào thực vật, các protein Avr (avirulence protein) được hình thành từ sợi nấm và từ giác mút sẽ được chuyển vào nguyên sinh chất của tế bào thực vật bằng các con đường khác nhau [44],[64], [73] Protein Avr có nhiều loại và là các protein nhỏ có trong giác mút của sợi nấm được tiết vào tế bào thực vật cùng với các protein khác qua các màng giác mút Protein R trong nguyên sinh chất của cây chủ nhận

biết protein Avr và hoạt hóa hệ thống tín hiệu bảo vệ của tế bào thực vật [39]

Ở cây lanh (Linum usitatissimum) kháng nấm gây bệnh gỉ sắt, protein

AvrL567 của nấm gây bệnh được nhận biết bằng các protein kháng của cây

chủ như protein L4, protein L6 và protein L7, hoặc các protein AvrM, AvrP4 của nấm được nhận biết bằng các protein M và P4 của cây chủ [46] Ngoài ra,

từ sợi nấm, protein Avr cũng có thể xâm nhập vào nguyên sinh chất và tương tác với protein R theo các cách khác nhau như hình 1.3

Hình 1.3 Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm

Tại Trung tâm phát triển Rau màu Châu Á (AVRDC), việc xác định tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương là một mục tiêu quan trọng với hơn 9000 dòng đậu tương đã được sàng lọc Cả tính kháng làm giảm tốc độ phát triển, tính kháng chuyên biệt và tính chống chịu đều xuất hiện trên chất

mầm (germ plasm) của cây đậu tương [79]

Đặc tính kháng bệnh gỉ sắt của đậu tương là không ổn định và khá phức tạp [79] Chúng có thể do một hoặc một số gen trội quyết định và được di truyền cho thế hệ sau theo các quy luật di truyền cơ bản hoặc có thể là di truyền theo qui luật tương tác đa gen Ví dụ, trong 3 cặp lai (UPSL 13 x Brogg, UPSL 85 x Harelec, UPSL - 3 x Clacrk 63), các giống làm mẹ là

những giống kháng cả bệnh gỉ sắt và bệnh virus gây vàng lá, các giống làm bố

là các giống năng suất cao và mẫn cảm với bệnh Sự phân ly ở F2 cho kết quả

có một quần thể tuân theo tỷ lệ 3:1 (3 kháng: 1 nhiễm), hai quần thể khác

không theo tỷ lệ lưỡng gen Một số thí nghiệm khác lại chỉ ra rằng các cây lai

ở F1 đều có khả năng kháng bệnh, còn các cây lai ở F2 phân ly theo tỷ lệ 9 kháng: 7 nhiễm Điều này chứng tỏ rằng có 2 gen trội tác động qua lại cùng quyết định tính kháng bệnh Do đó, có thể nói, việc xác định tính kháng của cây đậu tương với bệnh gỉ sắt là khá phức tạp và cần thêm nhiều công trình nghiên cứu để làm sáng tỏ

1.2.2.1 Tính kháng bệnh gỉ sắt chuyên biệt ở đậu tương

Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy có năm gen chính liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tương bao gồm: gen Rpp1 [56], [57] [76]; gen Rpp2 [59]; gen Rpp3 [37]; gen Rpp4 [56]; gen Rpp5 [52] Các

phản ứng kháng qua trung gian ở các locus Rpp2, Rpp3, Rpp4 và locus Rpp5

làm hạn chế sự sinh trưởng, phát triển của bào tử nấm thông qua sự hình thành các thể tổn thương màu nâu đỏ [36], [37], [52], [56] Trong khi đó, phản ứng kháng của gen Rpp1 là hình thành các phản ứng miễn dịch ở cây chủ [36]

Các phản ứng kháng bệnh của gen Rpp2 đã được nghiên cứu rộng rãi bằng kỹ thuật microarray [107] Theo đó mức độ biểu hiện của các gen tăng mạnh trong vòng 12 tiếng sau khi gây nhiễm ở cả thực vật kháng bệnh và nhiễm bệnh Sau đó mức độ biểu hiện trở lại trạng thái bình thường sau khoảng 72

giờ Các phản ứng này được phát hiện ở cả các giống nhiễm và giống kháng

Ở ba dòng đậu tương Tainung-4, PI459024, PI459025 và một dòng G soja

(PI 339871) được ghi nhận là có thêm các gen kháng chuyên biệt khác [58] Tính kháng chuyên biệt cũng đã được xác nhận ở các loài Glycine spp

hoang dại và một vài trong số đó đã được dùng làm cây ký chủ để xác định các kiểu gây bệnh gỉ sắt Việc xác định các giống kháng bệnh đã được tiến hành từ nhiều năm nay ở nhiều nước trên thế giới, tuy nhiên số giống kháng được phát hiện chưa nhiều [52]

Nhiều nhà khoa học đã tìm cách phân lập các gen kháng bệnh để nghiên cứu tính chất sinh hóa và chức năng của những protein tương ứng

[58], [79], [106] Trên thực tế, việc phát hiện các gen kháng bệnh và các hệ

thống bảo vệ là rất phức tạp do có sự tham gia của nhiều gen khác nhau Một

số nghiên cứu sàng lọc giống đã được tiến hành để phát hiện các giống đậu

tương có khả năng kháng/chống chịu với nấm gây bệnh P pachyrhizi [58],

[79] Các nghiên cứu về gen cho thấy năm gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 và

Rpp5 đã được phát hiện và mô tả là có khả năng liên quan đến tính kháng đối

với một số chủng nấm P pachyrhizi Tuy nhiên chưa có một giống đậu tương

nào có phổ kháng rộng với tất cả các chủng nấm P pachyrhizi và hiện nay

phần lớn các giống đậu trên thị trường được trồng ở Mỹ đều khá mẫn cảm với bệnh gỉ sắt [102]

1.2.2.2 Tính kháng một phần bệnh gỉ sắt ở đậu tương

Các dòng mang tính kháng một phần hoặc các dòng chậm bị bệnh gỉ

sắt đã được xác định và mô tả dựa trên thời gian ủ bệnh và số lượng cụm bào

tử hạ có trong phần thương tổn [58] Đánh giá khả năng kháng bệnh bằng sự theo dõi, quan sát, liệt kê một số dòng mang tính kháng một phần được xác định dựa trên số lượng nốt Trở ngại chính trong phát triển các dòng đậu tương mang tính kháng là làm thế nào để đánh giá được các dòng này từ các

quần thể phân ly hoặc từ các dòng có tính trưởng thành khác nhau

Ngoài những khác biệt sinh lý khi cây trưởng thành, các điều kiện môi trường cũng có thể gây ảnh hưởng khi cây trưởng thành trong các khoảng thời gian khác nhau

1.2.2.3 Tính chống chịu bệnh gỉ sắt ở đậu tương

Tính chống chịu ở đây được hiểu là khả năng cây cho năng suất tương đối dưới áp lực của bệnh gỉ sắt Để so sánh năng suất tương đối, người ta so sánh một dòng được trồng trên ô được và không được bảo vệ bằng thuốc trừ

nấm Mặc dù cần có thêm diện tích ruộng, tính chống chịu cần được đánh giá vào mỗi mùa vụ

Ở Đài Loan và Thái Lan, nhiều dòng đã được chọn và sàng lọc thử nghiệm tính chống chịu bệnh gỉ sắt [88] Dựa trên phần trăm gia tăng năng suất khi so sánh giữa các dòng, người ta đã xác định được các dòng mang tính chống chịu cao hoặc có thể kháng một phần Thiệt hại năng

suất của các dòng chống chịu này thường ít hơn so với các dòng có năng suất cao khác Xu hướng tương tự cũng xảy ra ở những dòng bị giảm sút

ở chỉ tiêu trọng lượng 100 hạt Các dòng mang khả năng chống chịu bệnh

gỉ sắt có diện tích lá bị bệnh nhỏ nhất hoặc có tính kháng một phần dựa trên số lượng vết bệnh trên mắt lá Gần đây, cùng với mức độ phần trăm tăng năng suất thì chỉ tiêu chống chịu stress đã được áp dụng trong đánh giá tính chống chịu bệnh gỉ sắt bằng cách sử dụng các ô ba chiều để chia các nguyên liệu khảo nghiệm ra thành bốn nhóm Mặt phẳng X-Y (X: tính độc bệnh, Y: năng suất phần trăm) được chia thành bốn đoạn bằng cách vẽ các đường phần cắt tại điểm chính giữa của trục X và trục Y

Trục Z thể hiện mức độ chống chịu stress mà một dòng có được ở bất kỳ nhóm nào trong bốn nhóm

1.3 Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương

Trong phân tích tính đa dạng di truyền của thực vật người ta có thể

tiến hành thực hiện ở các cấp độ và phương pháp khác nhau, từ các đặc điểm hình thái, sinh lý và hoá sinh đến đặc điểm của phân tử DNA, protein Phân tích đa dạng di truyền ở đậu tương dựa trên một số phương pháp như

chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh và chỉ thị phân tử DNA

1.3.1 Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái

Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thường được biểu hiện dưới dạng một tính trạng được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ như các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ Mặc dù chỉ thị hình thái được

sử dụng như một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong

chọn giống gặp phải nhiều hạn chế bởi chúng luôn chịu ảnh hưởng của các nhân tố di truyền như sự tương tác giữa các sản phẩm của gen Các nhân tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm cũng có tác động qua lại giữa kiểu gen và kiểu hình, gây ảnh hưởng không nhỏ đến các giai đoạn phát triển của thực vật

Biểu hiện khả năng kháng và nhiễm bệnh về mặt hình thái ở thực vật được xác định theo các tiêu chí nhất định Đây là chỉ thị quan trọng để tìm

kiếm và tạo giống kháng bệnh Ví dụ như bệnh gỉ sắt được xác định trên cơ

sở đánh giá vết bệnh trên lá, mức độ tạo quầng, mức độ tạo bào tử, từ đó có thể phân biệt được các giống đậu tương kháng tốt, kháng trung bình và mẫn

cảm với bệnh

Hơn nữa, một số tính trạng trội được tạo ra theo ý muốn của con người thông qua đột biến Các tác nhân này gây ra một số hiện tượng như lùn, bạch

tạng có hại cho cơ thể của thực vật Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của các chỉ

thị phân tử DNA và chỉ thị hoá sinh học, những khó khăn trên đang từng bước được giải quyết

1.3.2 Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học

Các chỉ thị hoá sinh có trong hầu hết các protein đa hình như isozyme

và các protein dự trữ (stograge protein) Các isozyme có thể được phân tách theo trọng lượng, kích thước phân tử và các chất mang Nhờ vậy, bằng kỹ thuật điện di trên gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, người ta có thể phát

hiện ra các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, ví dụ như isozyme amylase, esterase… Các biến dạng này có thể cung cấp thông tin như là một

loại chỉ thị đồng trội

Hình 1.4 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE

Phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và đơn giản hơn phân tích DNA Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen, số lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định trong quá trình phát triển của cá thể Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác một phần bản chất di truyền

Hiện nay, các nghiên cứu về hệ gen (genomics) và hệ protein (proteomics) thực vật đang được quan tâm và ngày càng phát triển mạnh [40] Kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional electrophoresis) là kỹ thuật phân tách protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ nhất) và theo trọng lượng phân tử (chiều thứ hai) (hình 1.4) Kỹ thuật này ngày càng trở thành

một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và cơ thể [53], [55] Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là cách tiếp cận proteomics thường được sử dụng nhất [27], [35], [48], [50], [55] Tùy

Chi ều 1 IEF

thuộc vào kích thước gel và dải gradient pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein (lên đến 5000 điểm protein), và có thể phát hiện

vệt protein với lượng <1ng có mặt trong mẫu cùng một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của chúng ở các mẫu phân tích để tìm các chỉ thị liên quan đến bệnh [84]

1.3.3 Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA

Chỉ thị phân tử DNA trong thời gian đầu chủ yếu là RFLP, dựa trên cơ

sở mẫu dò đặc hiệu Sau khi phát minh ra PCR, người ta phát triển tiếp các chỉ thị dựa trên phương pháp này như RAPD, AFLP, SSR, SNP, Bên cạnh

đó, QTL (Quantitative Trait Loci) - bản đồ locus các tính trạng số lượng xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một số tính trạng số lượng cũng đang được các nhà khoa học quan tâm

1.3.3.1 Chỉ thị RAPD

Kỹ thuật RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và cộng sự [112] RAPD đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đang dạng di truyền của cùng một loài hoặc sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau [15], [25] Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những

sợi oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên Các sản phẩm RAPD được phân tách bằng cách điện di trên gel agarose Hệ gen của các đối tượng khác nhau hoặc của hai loài sẽ cho sự khác nhau về

những phân đoạn DNA, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các đối tương nghiên cứu

Về nguyên tắc, kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction), bằng cách sử dụng những mồi ngắn có trình tự biết trước, bắt

cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các mồi Mồi (primer) là những đoạn oligonucleotide ngắn, một mạch

(khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lượng G+C cao (từ 60-70%) và không có đầu tự bổ sung Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA của hệ gen Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việc nghiên cứu đa dạng và

lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Thiết kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn nhân bản trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyền và thiết lập sơ đồ quan hệ di truyền của các đối tương nghiên cứu

Các sinh vật cùng loài có kiểu gen hoàn toàn giống nhau thì các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước giống nhau, khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào trong phản ứng PCR-RAPD Với các sinh vật khác loài, khi

sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD, các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau Để tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên với số lượng lớn

Ứng dụng của chỉ thị RAPD

Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu tính đa dạng

di truyền các giống, phát hiện khả năng di truyền liên quan đến một tính trạng

hoặc thiết lập bản đồ di truyền [43], [70], [96], [110] Trong chương trình cải thiện giống, nhà chọn giống thường quan tâm đến những tính trạng mà nó

biểu hiện bên ngoài (phynotype) Các tính trạng đó có thể là tính kháng sâu

bệnh, tính chống chịu phèn, mặn hoặc stress… Nhưng nếu việc phân tích di truyền chỉ dựa trên kiểu hình thường kết quả dễ bị sai lệch, do kiểu hình là kết

quả của sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường Chính vì thế, nhà chọn

giống cần phải biết tính trạng đó liên kết với kiểu gen như thế nào và phương pháp RAPD sẽ trợ giúp phát hiện được điều này

Sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học của giống cây

có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang, Nguyễn Hữu Hiệp và nhóm nghiên cứu đã sử dụng các mồi ngẫu nhiên, kết quả có 49 dấu phân tử được ghi nhận Từ đó vẽ được giản đồ phả hệ của các giống cây này [5] Barakat và

cộng sự ứng dụng kỹ thuật RAPD đã phân tích và nhận dạng được các chỉ thị liên quan đến tính kháng bệnh đốm trắng ở lá ngô [32] Trong khi đó, Paulo (2004) đã sử dụng 32 mồi để xác định mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô Brazil, kết quả thu được 225 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có

184 phân đoạn DNA thể hiện tính đa hình (chiếm 72,2%) [91] Năm 2003, Jorge và cộng sự đã đánh giá sự tương đồng di truyền giữa 7 giống chè ở Hy

Lạp nhờ kỹ thuật RAPD Sử dụng 25 mồi ngẫu nhiên các tác giả đã nhân bản được 282 phân đoạn DNA, trong đó có 195 phân đoạn thể hiện tính đa hình [65] Ngoài ra, Dey và cộng sự (2005) nghiên cứu tính đa dạng di truyền của

38 dòng lúa thơm và 2 dòng đối chứng bằng kỹ thuật RAPD, kết quả khuếch đại được 44 phân đoạn DNA và có 41 phân đoạn thể hiện tính đa hình [43] 1.3.3.2 Chỉ thị SSR

Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản) do

Litt và Luty (1989) phát hiện lần đâu tiên trên đối tượng người [71] Nghiên

cứu này đã chỉ ra rằng, ở người trình tự lặp lại đơn là TG với tần số lặp lại là 10-60 lần, chúng phân bố rải rác trong hệ gen tạo nên có khoảng 50.000 bản sao Bằng kỹ thuật PCR, người ta đã phát hiện ra trình tự SSR ở gen tổng hợp actin của người và xác định được 12 alen trên 37 kiểu gen được nghiên cứu và

nhận thấy các SSR này là những yếu tố trội di truyền theo quy luật của Mendel

SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide nào đó

Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có

thể thay đổi từ 1 đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ

2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn [20] Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucleotide như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài động và thực vật Phương thức lặp lại được phân thành 3 loại chính:

lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một số nucleotide khác); lặp lại phức tạp (sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau)

Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Phân lập đoạn SSR từ thư viện hệ gen; (ii) Xác định trình tự của vùng có SSR; (iii) Xác định các cặp mồi đặc trưng là các trình tự DNA bảo thủ giới hạn hai đầu của đoạn SSR; (iv) Nhân vùng gen tương ứng bằng PCR sử dụng các mồi đặc trưng; (v) Phân tích kích thước của

sản phẩm PCR nhằm xác định được sự có mặt của các alen SSR

Phản ứng PCR - SSR với mồi được thiết kế dựa trên hệ gen của từng loài, nên chỉ thị SSR cho kết quả đa hình cao hơn là các chỉ thị phân tử khác

Kỹ thuật này chỉ đòi hỏi một lượng nhỏ DNA mẫu nhưng lại cho phép phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể trong cùng một giống Phản ứng không mất nhiều thời gian Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị phân tử khác và cho kết quả nhanh và đáng tin cậy hơn chỉ

thị RAPD Chỉ thị SSR với các locus đặc trưng, đa alen và cung cấp nhiều thông tin nên chúng hết sức có ích trong việc thay đổi trình tự hiếm [67] Đây chính là những ưu điểm chính của kỹ thuật SSR Nói chung, chỉ thị SSR tương đối đơn giản hơn so với chỉ thị RFLP hay AFLP Vì vậy, chỉ thị này được quan tâm hơn trong ứng dụng vào chọn giống thực vật [95]

Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình Ngoài ra, việc xây dựng các

cặp mồi đặc hiệu đòi hỏi phải tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn DNA bộ gen chứa SSR [74] Vì vậy, số lượng các mồi chưa được phát triển ở nhiều loại thực vật

Ứng dụng của kỹ thuật SSR

Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, SSR được áp dụng để nghiên cứu

đa dạng trên cả đối tượng động vật và thực vật vì nó cho độ đa hình cao và đáng tin cậy Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên một số loài cây như lạc, mơ, lúa mì [32], [75] và đang phát triển ở các giống cây

trồng khác như đậu tương [111] Trong việc nghiên cứu tạo giống mới, chỉ thị SSR liên quan đến một số tính trạng đã được xác định như chọn giống nhờ chỉ

thị (marker-assisted selection) Các chỉ thị SSR đã được dùng để chọn dòng kháng bệnh khảm do virus ở cây đậu tương [29], chọn các dòng lúa có năng suất cao và hàm lượng protein dự trữ cao hoặc để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống cây trồng ở một số đối tượng như lúa, mía, đậu tương, cà chua hoặc xây dựng bản đồ di truyền liên kết tính trạng ở cà chua và lúa và

xác định giới tính thực vật trên đối tượng đu đủ

1.3.3.3 Các chỉ thị RFLP và AFLP

Các chỉ thị phân tử như RFLP (Restriction Fragment length

Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng

được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa hình DNA

Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu (trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu Kỹ thuật RFLP được tiến hành như sau: các endonuclease cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA bộ gen ở trình tự

nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng loạt các phân đoạn nhỏ có kích thước khác nhau Số lượng các phân đoạn này phụ thuộc vào điểm nhận biết trong bộ gen Sản phẩm của quá trình cắt sẽ được điện di, sau đó được chuyển nguyên

vị và cố định trên màng lai Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn sẽ được phát

hiện bằng sự kết hợp giữa mẫu dò đã được đánh dấu (bằng phóng xạ hoặc

bằng phương pháp hoá học) và các đoạn DNA của mẫu cần phân tích (được

tạo ra từ cùng một locus theo nguyên tắc bổ sung)

Trong khi đó, AFLP là một kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa vào nguyên

lý của PCR để nhân các đoạn được cắt hạn chế bởi enzyme giới hạn Cũng như các chỉ thị phân tử khác, AFLP khám phá hiện tượng đa hình qua sự khác nhau về độ dài của các đoạn DNA được nhân Kỹ thuật này gồm 3 bước: cắt DNA bộ gen bằng enzyme giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter), nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn và phân tích trên gel các đoạn DNA được nhân lên

Chỉ thị AFLP ít phức tạp hơn RFLP, với ưu điểm là độ đa hình cao

nhận dạng tới cá thể, thông qua đó có thể tìm được những chỉ thị liên kết rất chặt và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền [103]

Các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử ở đậu tương sử dụng chỉ thị RAPD đôi khi cho kết quả tính đa hình thấp Vì thế, gần đây việc thiết kế mồi SSR chuyên dụng cho đậu tương đã và đang được một số Viện nghiên cứu trên thế giới tiến hành [62] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng

chỉ thị SSR trong nghiên cứu tính chịu nóng, chịu hạn ở thực vật nói chung và đậu tương nói riêng còn rất hạn chế, đặc biệt là trên đối tượng đậu tương có

phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và cây thực phẩm Việt Nam, hàng trăm mẫu

giống đậu tương nhập nội và giống đậu tương địa phương đã được đánh giá

về khả năng chịu nóng, chịu hạn, kháng sâu bệnh Việc chọn tạo giống chủ

yếu dựa trên những phương pháp thủ công truyền thống trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, nông sinh học mà chưa đi sâu vào chọn lọc dựa trên những đặc điểm di truyền phân tử Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương là rất cần thiết

1.3.3.4 Bản đồ QTL

Bản đồ các locus kiểm soát tính trạng số lượng QTL (Quantitative Trait Loci) xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng số

lượng đang được quan tâm Từ bản đồ QTL ta có thể xác định được những vùng trên NST có liên quan đến một tính trạng hay không Các bước để lập

bản đồ QTL như: (i) xác định cặp lai có tính trạng đối kháng nhau; (ii) lai và

tạo quần thể cho lập bản đồ (300-600 cá thể); (iii) theo dõi sự phân ly của các

chỉ thị trong quần thể; (iv) xử lý thống kê và lập bản đồ

Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí gen, hiệu quả và hoạt động của các locus liên quan trong mối tương tác giữa các sản phẩm của gen và tương tác QTL với môi trường, từ đó chọn lọc được các dòng với tính trạng mong

muốn nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted Selection) Năm 2002, các nghiên cứu lập bản đồ QTL liên kết với tính trạng qui định

khối lượng [61] hoặc tính chịu hạn ở đậu xanh [103] đã được mô tả

1.4 Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về gỉ sắt [32], [52], [77], [81] Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt gây thiệt hại nghiêm trọng đến cây đậu tương và làm hạn chế năng xuất đậu tương vụ xuân Trung tâm Rau màu Châu

Á (AVRCD) của Đài Loan đã tiến hành so sánh 1080 giống, kết quả có 9 mẫu

giống kháng bệnh trung bình, trong đó có 4 mẫu giống có nguồn gốc từ Trung

Quốc, 3 giống có nguồn gốc từ Nhật Bản, 1 giống có nguồn gốc từ Triều Tiên

Giống Tainung 4 có sức kháng bệnh nhiều hơn các giống khác trong điều kiện đồng ruộng, số lượng vết bệnh ít hơn [6] Ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ kết hợp Phòng thí nghiệm Nghiên cứu bệnh thực vật và AVRCD đã khởi động một dự

án hợp tác nghiên cứu dịch tễ học của bệnh gỉ sắt đậu tương năm 1978 Dự án này kéo dài đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt được tiếp tục tiến hành cho đến năm 1992 Ở Thái Lan, chương trình quốc gia của Thái Lan đã và đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương với các mục tiêu lai

giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua [88] Ở Indonesia, phần lớn các giống đậu tương đều bị nhiễm bệnh cho nên bệnh gỉ sắt được xem là loại bệnh

nghiêm trọng nhất trên cây đậu tương và đã lan rộng cả ở mùa mưa và mùa khô Các hoạt động nghiên cứu ở Indonesia bao gồm cải thiện tính kháng cây

ký chủ, thử nghiệm thuốc trị nấm, quản lý bệnh gỉ sắt thông qua trồng thử nghiệm và các nghiên cứu về sự phát tán bào tử Trong khi đó ở Úc, bệnh gỉ sắt

đã được nghiên cứu sâu, tuy nhiên kinh phí bị giới hạn nên các nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào việc sàng lọc các quần thể hồi giao bằng cách lai

Glycine max và Glycine tomentella

Bằng kỹ thuật phân tử, những biến đổi ở mức độ alen và tính di truyền được tìm thấy ở đậu tương [45] Verma và cộng sự (1996) đã công bố về những biến đổi alen của SSR ở mức độ cao trong sinh chất mầm đậu tương [109] Theo ông, có 28 alen SSR được nhắc lại trong nhóm 96 kiểu gen đậu tương Akkaya và cộng sự (1992) đã lập bản đồ 40 locus SSR ở đậu tương cùng với 118 chỉ thị RFLP và RAPD Có 18 trong 29 nhóm liên kết chứa ít

nhất một locus SSR được phân bố khá ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương [29] Năm 1995, Maughan nghiên cứu trên 94 giống đậu tương đã xác định đ-ược 79 alen trên 5 locus [74] Navel và cộng sự (2000) khi nghiên cứu 40

giống đậu tương trong tập đoàn đậu tương và 39 giống cao sản đã sử dụng 74

chỉ thị SSR và nhận được 379 alen trên 74 locus [85] Ngoài ra, Abe và cộng

sự (2003) đã phân tích 20 locus SSR của 131 giống đậu tương từ 14 nước Châu Á và nhận thấy rằng trung bình trên mỗi locus SSR có đến 11,2 alen [26] Họ cũng đã nhận ra sự khác nhau về nguồn gốc di truyền giữa tập đoàn

giống đậu tương ở Nhật Bản và Trung Quốc Các phát hiện của của nhóm nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các giống đậu tương của các nước Đông Nam

Á và Trung Á phần lớn bắt nguồn từ Trung Quốc Trong khi đó, Cregan và

cộng sự (1999) đã sử dụng đồng thời các chỉ thị SSR, RAPD, AFLP và thiết

lập được bản đồ gen với 20 nhóm gen liên kết ở đậu tương trên cơ sở ba quần thể lai của các trường đại học Iowa, Utah và Nebraska [42]

Để xác định gen kháng bệnh gỉ sắt trên các giống đậu tương của Mỹ và Brazil, sử dụng phương pháp lập bản đồ liên kết chỉ thị phân tử (map-based cloning) các nhà khoa học đã phát hiện một số chỉ thị SSR liên kết gần với các gen từ Rpp1 đến Rpp5: Rpp1và Rpp4 thuộc nhóm liên kết G trên NST số 18; Rpp3 thu ộc nhóm liên kết C2 trên NST số 6; Rpp3 thuộc nhóm J trên NST

đa hình với giá trị PIC (Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình) dao động từ 0,11 đến 0,6, trong đó có 3 mồi có tính đa hình cao (PIC>0,5) Ngoài ra, tác giả cũng cho rằng các giống có tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường như giống HL92 (kháng bệnh xoăn lá và thối quả) và HL203 (chống chịu khá với sâu bệnh) đều nằm trong cùng nhóm phụ III và có hệ số sai khác di truyền 0,114 Hoặc hai giống M103 (chịu nóng) và

giống DT84 (chịu lạnh và chịu úng) đều nằm trong nhóm phụ II và có hệ số sai khác di truyền 0,082 [17]

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số thành tựu đáng kể: Trung tâm đậu đỗ Định Tường đã khảo sát 500 mẫu giống, trong đó giống G8587 có

sức kháng khá, các giống 7608-25-4, SJ4, SJ5, DT78, Pand, Provar có thể

hiện mức độ kháng bệnh Phạm Văn Biên và cộng sự thuộc Viện kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam khi nghiên cứu về nguồn gen kháng gỉ sắt đã cho thấy

các giống Hoà An, MTD3, Prover, Cao quả địa hoa trắng, Đen Bắc Hà, Đen Cao Bằng, MTD4, Nhật 12, 13, 16, 17, 20 có tính kháng với bệnh gỉ sắt [1]

Những năm gần đây, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và cây thực phẩm đã nghiên cứu, lai tạo và kiểm định được một số

giống có khả năng kháng với bệnh gỉ sắt như: DT2000, CBU8325, DT95 Giống DT2000 được công nhận là giống Quốc gia có khả năng kháng cao đối

với gỉ sắt ở các mùa vụ khác nhau Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu tính đa dạng di truyền các giống đậu tương đã có kết quả bước đầu khả quan [21], [22] Như vậy, do các đoạn SSR có mức độ đa hình cao và phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương nên chúng có thể cung cấp những

dẫn chứng chính xác và tin cậy trong nghiên cứu sinh học phân tử, di truyền học và lai tạo giống cây trồng

1.5 Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương

Nhằm phát triển tăng năng suất và chất lượng đậu tương một cách

mạnh mẽ, hàng loạt các tổ chức, các mạng lưới nghiên cứu và cải tạo giống đậu tương trên thế giới đã được thành lập như: Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế ở Hoa Kỳ (INTSOY - International Soybean Program), Viện Nông nghiệp nhiệt đới ở Nigeria (IMA - Institute of Tropical Agriculture), Trung tâm phát triển rau màu Châu Á (AVRDC - Asian Vegetable Research Devlopment Center) ở Đài Loan, Viện nghiên cứu lúa quốc tế ở Philippin (IRRI - International Rice Research Institute) Trong đó, Trung tâm phát triển rau màu Châu Á là nơi nghiên cứu và đánh giá tập đoàn gen đậu tương

sớm nhất thế giới Trung tâm này đã thiết lập được hệ thống đánh giá đậu tương và đã chọn lọc thành công 24 giống đậu tương có năng suất cao, có

khả năng chống bệnh gỉ sắt và thích ứng với điều kiện canh tác và sinh thái

ở nhiều quốc gia

Công tác nghiên cứu giống đậu tương trên thế giới hướng tới những

mục đích: (i) Nhập nội giống sau đó chọn lọc, thử nghiệm với điều kiện của các vùng sinh thái; (ii) Khảo nghiệm các giống ở các vùng sinh thái khác nhau

để tìm ra giống có khả năng thích ứng với các vùng sinh thái đó; (iii) Tạo tính trạng mới bằng lai hữu tính và dùng các tác nhân vật lý, hoá học nhằm chọn

lọc ra những dòng tốt nhất phục vụ cho sản xuất; (iv) Xác định các địa bàn

trồng đậu tương trên thế giới và các nước trồng đậu tương đạt năng suất và

sản lượng cao Với những mục đích trên, công tác này được tiến hành theo hai hướng chính:

(1) Thu thập và nghiên cứu nguồn gen đậu tương làm nguyên liệu cho lai tạo:

Tại Trung Quốc và Hoa Kỳ, người ta đã thu thập được tập đoàn giống đậu tương lớn trên thế giới từ nhiều nước khác nhau như: Australia, Brazil, Đức,

Nhật Bản, Ấn Độ, Thuỵ Điển, Nga… Tại Nhật Bản, từ năm 1960 một số

giống đậu tương đã được lai tạo thành công, ví dụ như giống đậu tương Norin-59 có chất lượng hạt tốt, chống chịu được tuyến trùng, chống đổ, năng

suất cao đã được lai tạo từ hai giống bố mẹ là Naugumitacodater và Tokokal

Ở Indonesia, các nhà nghiên cứu đã phân lập được một số giống có thời gian sinh trưởng ngắn từ 70-80 ngày như giống Kerinei, Rinani, MLg 254, B3334 Các giống này có thể trồng luân canh trên đất sau cây lúa trong điều kiện làm đất tối thiểu hoặc không làm đất vẫn đạt năng suất từ 1,5-1,7 tấn/ha Ngoài ra, Rafalski và các tác giả cũng đã chọn được các giống cứng cây, chống đổ tốt và chọn lọc thành công một số giống như Will đang được trồng

phổ biến ở Indonesia [95]

(2) Thi ết lập bản đồ gen đậu tương: Dự án đậu tương lớn nhất tại Hoa Kỳ đã

thống kê được 72 bản đồ gen phân tử (molecular genetic maps) và bản đồ gen cổ điển (genetic classical maps) [117] Các bản đồ gen này định vị được 44.326 locus, 481 gen và nhiều QTL, một phần trong số đó đã được