L ời cảm ơn
1.3.2.Phương phỏp sử dụng chỉ thị hoỏ sinh học
Cỏc chỉ thị hoỏ sinh cú trong hầu hết cỏc protein đa hỡnh như isozyme và cỏc protein dự trữ (stograge protein). Cỏc isozyme cú thể được phõn tỏch
theo trọng lượng, kớch thước phõn tử và cỏc chất mang. Nhờ vậy, bằng kỹ
thuật điện di trờn gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, người ta cú thể phỏt
hiện ra cỏc biến dạng khỏc nhau của phõn tử enzyme, vớ dụ như isozyme amylase, esterase… Cỏc biến dạng này cú thể cung cấp thụng tin như là một
Hỡnh 1.4. Sơ đồ phõn tỏch protein bằng điện di 2-DE
Phương phỏp phõn tớch isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và
đơn giản hơn phõn tớch DNA. Tuy nhiờn, isozyme là sản phẩm của gen, số lượng của chỳng cú hạn và chỳng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định
trong quỏ trỡnh phỏt triển của cỏ thể. Vỡ vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ỏnh
chớnh xỏc một phần bản chất di truyền.
Hiện nay, cỏc nghiờn cứu về hệ gen (genomics) và hệ protein
(proteomics) thực vật đang được quan tõm và ngày càng phỏt triển mạnh
[40]. Kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional electrophoresis) là kỹ
thuật phõn tỏch protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ nhất) và theo trọng lượng phõn tử (chiều thứ hai) (hỡnh 1.4). Kỹ thuật này ngày càng trở thành một cụng cụ được ứng dụng rộng rói nhằm phõn tỏch cỏc phức hợp protein
trong tế bào, mụ và cơ thể [53], [55]. Phương phỏp điện di hai chiều, thủy phõn protein trong gel, sau đú nhận dạng bằng khối phổ đang là cỏch tiếp
cận proteomics thường được sử dụng nhất [27], [35], [48], [50], [55]. Tựy
Chiều 1 IEF
Thanh gel Cõn bằng mẫu C h i ều 2 S D S -P A G E - + Mẫu protein
thuộc vào kớch thước gel và dải gradient pH sử dụng, điện di 2-DE cú thể
phõn tỏch hàng ngàn protein (lờn đến 5000 điểm protein), và cú thể phỏt hiện
vệt protein với lượng <1ng cú mặt trong mẫu cựng một lỳc, đồng thời so
sỏnh mức độ biểu hiện khỏc nhau của chỳng ở cỏc mẫu phõn tớch để tỡm cỏc
chỉ thị liờn quan đến bệnh [84].
1.3.3. Cỏc phương phỏp sử dụng chỉ thị phõn tử DNA
Chỉ thị phõn tử DNA trong thời gian đầu chủ yếu là RFLP, dựa trờn cơ
sở mẫu dũ đặc hiệu. Sau khi phỏt minh ra PCR, người ta phỏt triển tiếp cỏc
chỉ thị dựa trờn phương phỏp này như RAPD, AFLP, SSR, SNP, ... Bờn cạnh đú, QTL (Quantitative Trait Loci) - bản đồ locus cỏc tớnh trạng số lượng xỏc định mối liờn kết giữa cỏc chỉ thị phõn tử với một số tớnh trạng số lượng cũng đang được cỏc nhà khoa học quan tõm.
1.3.3.1. Chỉ thị RAPD
Kỹ thuật RAPD là phương phỏp khuếch đại ngẫu nhiờn DNA để phõn tớch sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này được phỏt hiện vào năm 1990 bởi Welsh và cộng sự [112]. RAPD đó được sử dụng rộng rói để nghiờn cứu sự đang dạng di truyền của cựng một loài hoặc sự khỏc biệt di truyền của những
loài khỏc nhau [15], [25]. Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những
sợi oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide cú trỡnh tự sắp xếp ngẫu nhiờn. Cỏc sản phẩm RAPD được phõn tỏch bằng cỏch điện di trờn gel agarose. Hệ
gen của cỏc đối tượng khỏc nhau hoặc của hai loài sẽ cho sự khỏc nhau về (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
những phõn đoạn DNA, từ đú cú thể so sỏnh sự đa dạng sinh học của cỏc đối tương nghiờn cứu.
Về nguyờn tắc, kỹ thuật RAPD dựa trờn phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction), bằng cỏch sử dụng những mồi ngắn cú trỡnh tự biết trước, bắt
cặp và nhõn bản ngẫu nhiờn những đoạn DNA cú trỡnh tự bổ sung với trỡnh tự
(khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp một cỏch ngẫu nhiờn, cú hàm lượng
G+C cao (từ 60-70%) và khụng cú đầu tự bổ sung. Cỏc mồi dựng trong RAPD
thường ngắn vỡ vậy dễ dàng tỡm được cỏc đoạn tương đồng trờn mạch đơn
DNA của hệ gen. Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việc nghiờn cứu đa dạng và lập bản đồ di truyền của cỏc locus đặc trưng bao gồm cỏc bước sau: (i) Thiết kế
mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn nhõn bản trờn gel agarose; (iv) Phõn tớch kết quả bằng phần mềm chuyờn dụng; (v) Xỏc
định hệ số đồng dạng di truyền và thiết lập sơ đồ quan hệ di truyền của cỏc đối tương nghiờn cứu.
Cỏc sinh vật cựng loài cú kiểu gen hoàn toàn giống nhau thỡ cỏc đoạn
DNA được khuếch đại sẽ cú kớch thước giống nhau, khi sử dụng bất kỳ mồi
ngẫu nhiờn nào trong phản ứng PCR-RAPD. Với cỏc sinh vật khỏc loài, khi sử dụng cỏc mồi ngẫu nhiờn trong phản ứng PCR-RAPD, cỏc đoạn DNA được khuếch đại sẽ cú kớch thước khỏc nhau. Để tỡm sự khỏc biệt giữa cỏc loài, người ta thường sử dụng cỏc mồi ngẫu nhiờn với số lượng lớn.
Ứng dụngcủa chỉthị RAPD
Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biến trong nghiờn cứu tớnh đa dạng
di truyền cỏc giống, phỏt hiện khả năng di truyền liờn quan đến một tớnh trạng
hoặc thiết lập bản đồ di truyền [43], [70], [96], [110]. Trong chương trỡnh cải
thiện giống, nhà chọn giống thường quan tõm đến những tớnh trạng mà nú biểu hiện bờn ngoài (phynotype). Cỏc tớnh trạng đú cú thể là tớnh khỏng sõu bệnh, tớnh chống chịu phốn, mặn hoặc stress… Nhưng nếu việc phõn tớch di
truyền chỉ dựa trờn kiểu hỡnh thường kết quả dễ bị sai lệch, do kiểu hỡnh là kết
quả của sự tương tỏc giữa kiểu gen và mụi trường. Chớnh vỡ thế, nhà chọn
giống cần phải biết tớnh trạng đú liờn kết với kiểu gen như thế nào và phương
Sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiờn cứu đa dạng sinh học của giống cõy
cú mỳi ở huyện Gũ Quao, tỉnh Kiờn Giang, Nguyễn Hữu Hiệp và nhúm nghiờn cứu đó sử dụng cỏc mồi ngẫu nhiờn, kết quả cú 49 dấu phõn tử được
ghi nhận. Từ đú vẽ được giản đồ phả hệ của cỏc giống cõy này [5]. Barakat và cộng sự ứng dụng kỹ thuật RAPD đó phõn tớch và nhận dạng được cỏc chỉ thị
liờn quan đến tớnh khỏng bệnh đốm trắng ở lỏ ngụ [32]. Trong khi đú, Paulo (2004) đó sử dụng 32 mồi để xỏc định mối quan hệ di truyền của 81 giống
ngụ Brazil, kết quả thu được 225 phõn đoạn DNA được nhõn bản, trong đú cú
184 phõn đoạn DNA thể hiện tớnh đa hỡnh (chiếm 72,2%) [91]. Năm 2003, Jorge và cộng sự đó đỏnh giỏ sự tương đồng di truyền giữa 7 giống chố ở Hy
Lạp nhờ kỹ thuật RAPD. Sử dụng 25 mồi ngẫu nhiờn cỏc tỏc giả đó nhõn bản
được 282 phõn đoạn DNA, trong đú cú 195 phõn đoạn thể hiện tớnh đa hỡnh [65]. Ngoài ra, Dey và cộng sự (2005) nghiờn cứu tớnh đa dạng di truyền của
38 dũng lỳa thơm và 2 dũng đối chứng bằng kỹ thuật RAPD, kết quả khuếch đại được 44 phõn đoạn DNA và cú 41 phõn đoạn thể hiện tớnh đa hỡnh [43]. 1.3.3.2 Chỉ thị SSR
Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trỡnh tự lặp lại đơn giản) do Litt và Luty (1989) phỏt hiện lần đõu tiờn trờn đối tượng người [71]. Nghiờn cứu này đó chỉ ra rằng, ở người trỡnh tự lặp lại đơn là TG với tần số lặp lại là 10-60 lần, chỳng phõn bố rải rỏc trong hệ gen tạo nờn cú khoảng 50.000 bản (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sao. Bằng kỹ thuật PCR, người ta đó phỏt hiện ra trỡnh tự SSR ở gen tổng hợp
actin của người và xỏc định được 12 alen trờn 37 kiểu gen được nghiờn cứu và nhận thấy cỏc SSR này là những yếu tố trội di truyền theo quy luật của Mendel.
SSR là một đoạn DNA cú sự lặp lại của một trật tự nucleotide nào đú.
Hiện tượng tồn tại cỏc SSR trong cơ thể sinh vật nhõn chuẩn là khỏ phổ biến.
Tuy nhiờn, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại cú
2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn [20]. Cỏc đoạn lặp lại hai, ba, bốn
nucleotide như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phõn bố rộng rói trong hệ gen của cỏc loài động và thực vật. Phương thức lặp lại được phõn thành 3 loại chớnh:
lặp lại hoàn toàn (cỏc đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại khụng hoàn toàn (xen kẽ vào cỏc đơn vị lặp lại là một số nucleotide khỏc); lặp lại phức tạp
(sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khỏc nhau).
Việc sử dụng cỏc chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của cỏc locus đặc trưng bao gồm cỏc bước sau: (i) Phõn lập đoạn SSR từ thư viện hệ gen;
(ii) Xỏc định trỡnh tự của vựng cú SSR; (iii) Xỏc định cỏc cặp mồi đặc trưng là
cỏc trỡnh tự DNA bảo thủ giới hạn hai đầu của đoạn SSR; (iv) Nhõn vựng gen
tương ứng bằng PCR sử dụng cỏc mồi đặc trưng; (v) Phõn tớch kớch thước của
sản phẩm PCR nhằm xỏc định được sự cú mặt của cỏc alen SSR.
Phản ứng PCR - SSR với mồi được thiết kế dựa trờn hệ gen của từng
loài, nờn chỉ thị SSR cho kết quả đa hỡnh cao hơn là cỏc chỉ thị phõn tử khỏc.
Kỹ thuật này chỉ đũi hỏi một lượng nhỏ DNA mẫu nhưng lại cho phộp phỏt
hiện nhanh sự khỏc biệt DNA giữa cỏc cỏ thể trong cựng một giống. Phản ứng
khụng mất nhiều thời gian. Hầu hết cỏc locus SSR ở thực vật cú sự đa hỡnh
cao hơn cỏc chỉ thị phõn tử khỏc và cho kết quả nhanh và đỏng tin cậy hơn chỉ
thị RAPD. Chỉ thị SSR với cỏc locus đặc trưng, đa alen và cung cấp nhiều
thụng tin nờn chỳng hết sức cú ớch trong việc thay đổi trỡnh tự hiếm [67]. Đõy
chớnh là những ưu điểm chớnh của kỹ thuật SSR. Núi chung, chỉ thị SSR tương đối đơn giản hơn so với chỉ thị RFLP hay AFLP. Vỡ vậy, chỉ thị này
được quan tõm hơn trong ứng dụng vào chọn giống thực vật [95].
Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kộm về tiền của và cụng sức trong việc
thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hỡnh. Ngoài ra, việc xõy dựng cỏc
cặp mồi đặc hiệu đũi hỏi phải tỏch dũng và đọc trỡnh tự một số lượng lớn cỏc đoạn DNA bộ gen chứa SSR [74]. Vỡ vậy, số lượng cỏc mồi chưa được phỏt
Ứng dụng của kỹ thuật SSR
Trong nghiờn cứu đa dạng di truyền,SSR được ỏp dụng để nghiờn cứu đa dạng trờn cả đối tượng động vật và thực vật vỡ nú cho độ đa hỡnh cao và
đỏng tin cậy. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đó được xỏc định trờn một số loài cõy như lạc, mơ, lỳa mỡ [32], [75] và đang phỏt triển ở cỏc giống cõy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trồng khỏc như đậu tương [111]. Trong việc nghiờn cứu tạo giống mới, chỉ thị SSR liờn quan đến một số tớnh trạng đó được xỏc định như chọn giống nhờ chỉ
thị (marker-assisted selection). Cỏc chỉ thị SSR đó được dựng để chọn dũng khỏng bệnh khảm do virus ở cõy đậu tương [29], chọn cỏc dũng lỳa cú năng
suất cao và hàm lượng protein dự trữ cao hoặc để xỏc định mối quan hệ họ
hàng giữa cỏc giống cõy trồng ở một số đối tượng như lỳa, mớa, đậu tương, cà chua hoặc xõy dựng bản đồ di truyền liờn kết tớnh trạng ở cà chua và lỳa và
xỏc định giới tớnh thực vật trờn đối tượng đu đủ . 1.3.3.3. Cỏc chỉ thị RFLP và AFLP
Cỏc chỉ thị phõn tử như RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng
được sử dụng rộng rói trong nghiờn cứu đa hỡnh DNA.
Nguyờn lý của kỹ thuật RFLP dựa trờn cơ sở sử dụng mẫu dũ đặc hiệu
(trỡnh tự DNA đó biết) để xỏc định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đú ở bộ
gen của cỏc cỏ thể cần nghiờn cứu. Kỹ thuật RFLP được tiến hành như sau:
cỏc endonuclease cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA bộ gen ở trỡnh tự
nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng loạt cỏc phõn đoạn nhỏ cú kớch thước khỏc
nhau. Số lượng cỏc phõn đoạn này phụ thuộc vào điểm nhận biết trong bộ
gen. Sản phẩm của quỏ trỡnh cắt sẽ được điện di, sau đú được chuyển nguyờn vị và cố định trờn màng lai. Đa hỡnh độ dài cỏc đoạn cắt giới hạn sẽ được phỏt
hiện bằng sự kết hợp giữa mẫu dũ đó được đỏnh dấu (bằng phúng xạ hoặc
bằng phương phỏp hoỏ học) và cỏc đoạn DNA của mẫu cần phõn tớch (được
Trong khi đú, AFLP là một kỹ thuật đỏnh dấu phõn tử dựa vào nguyờn lý của PCR để nhõn cỏc đoạn được cắt hạn chế bởi enzyme giới hạn. Cũng như cỏc chỉ thị phõn tử khỏc, AFLP khỏm phỏ hiện tượng đa hỡnh qua sự khỏc
nhau về độ dài của cỏc đoạn DNA được nhõn. Kỹ thuật này gồm 3 bước: cắt
DNA bộ gen bằng enzyme giới hạn và gắn cỏc đoạn oligonucleotide tiếp hợp
(adapter), nhõn một cỏch chọn lọc cỏc đoạn giới hạn và phõn tớch trờn gel cỏc
đoạn DNA được nhõn lờn.
Chỉ thị AFLP ớt phức tạp hơn RFLP, với ưu điểm là độ đa hỡnh cao nhận dạng tới cỏ thể, thụng qua đú cú thể tỡm được những chỉ thị liờn kết rất
chặt và vỡ thế là một kỹ thuật hữu ớch trong nghiờn cứu di truyền [103].
Cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu đa dạng di truyền phõn tử ở đậu tương sử
dụng chỉ thị RAPD đụi khi cho kết quả tớnh đa hỡnh thấp. Vỡ thế, gần đõy việc
thiết kế mồi SSR chuyờn dụng cho đậu tương đó và đang được một số Viện
nghiờn cứu trờn thế giới tiến hành [62]. Ở Việt Nam, việc nghiờn cứu sử dụng
chỉ thị SSR trong nghiờn cứu tớnh chịu núng, chịu hạn ở thực vật núi chung và
đậu tương núi riờng cũn rất hạn chế, đặc biệt là trờn đối tượng đậu tương cú
phản ứng khỏc nhau với bệnh gỉ sắt. Tại Trung tõm Nghiờn cứu và Phỏt triển đậu đỗ, Viện Cõy lương thực và cõy thực phẩm Việt Nam, hàng trăm mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
giống đậu tương nhập nội và giống đậu tương địa phương đó được đỏnh giỏ
về khả năng chịu núng, chịu hạn, khỏng sõu bệnh. Việc chọn tạo giống chủ
yếu dựa trờn những phương phỏp thủ cụng truyền thống trờn cơ sở phõn tớch đặc điểm hỡnh thỏi, sinh lý, nụng sinh học mà chưa đi sõu vào chọn lọc dựa
trờn những đặc điểm di truyền phõn tử. Vỡ vậy, việc sử dụng chỉ thị phõn tử
vào nghiờn cứu chọn tạo giống đậu tương là rất cần thiết.
1.3.3.4. Bản đồ QTL
Bản đồ cỏc locus kiểm soỏt tớnh trạng số lượng QTL (Quantitative Trait Loci) xỏc định mối liờn kết giữa cỏc chỉ thị phõn tử với một tớnh trạng số
lượng đang được quan tõm. Từ bản đồ QTL ta cú thể xỏc định được những vựng trờn NST cú liờn quan đến một tớnh trạng hay khụng. Cỏc bước để lập
bản đồ QTL như: (i) xỏc định cặp lai cú tớnh trạng đối khỏng nhau; (ii) lai và tạo quần thể cho lập bản đồ (300-600 cỏ thể); (iii) theo dừi sự phõn ly của cỏc
chỉ thị trong quần thể; (iv) xử lý thống kờ và lập bản đồ.
Lập bản đồ QTL nhằm xỏc định vị trớ gen, hiệu quả và hoạt động của
cỏc locus liờn quan trong mối tương tỏc giữa cỏc sản phẩm của gen và tương
tỏc QTL với mụi trường, từ đú chọn lọc được cỏc dũng với tớnh trạng mong
muốn nhờ sự trợ giỳp của chỉ thị phõn tử (MAS - Marker Assisted Selection).
Năm 2002, cỏc nghiờn cứu lập bản đồ QTL liờn kết với tớnh trạng qui định khối lượng [61] hoặc tớnh chịu hạn ở đậu xanh [103] đó được mụ tả.
1.4. Cỏc nghiờn cứu về bệnh gỉ sắt ở cõy đậu tương
Trờn thế giới, đó cú nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu về gỉ sắt [32], [52], [77], [81]. Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt gõy thiệt hại nghiờm trọng đến cõy đậu tương và làm hạn chế năng xuất đậu tương vụ xuõn. Trung tõm Rau màu Chõu Á (AVRCD) của Đài Loan đó tiến hành so sỏnh 1080 giống, kết quả cú 9 mẫu
giống khỏng bệnh trung bỡnh, trong đú cú 4 mẫu giống cú nguồn gốc từ Trung
Quốc, 3 giống cú nguồn gốc từ Nhật Bản, 1 giống cú nguồn gốc từ Triều Tiờn. Giống Tainung 4 cú sức khỏng bệnh nhiều hơn cỏc giống khỏc trong điều kiện đồng ruộng, số lượng vết bệnh ớt hơn [6]. Ở Mỹ, Bộ Nụng nghiệp Mỹ kết hợp Phũng thớ nghiệm Nghiờn cứu bệnh thực vật và AVRCD đó khởi động một dự
ỏn hợp tỏc nghiờn cứu dịch tễ học của bệnh gỉ sắt đậu tương năm 1978. Dự ỏn này kộo dài đến năm 1982 và cỏc nghiờn cứu về bệnh gỉ sắt được tiếp tục tiến hành cho đến năm 1992. Ở Thỏi Lan, chương trỡnh quốc gia của Thỏi Lan đó và
đang tiến hành cỏc nghiờn cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương với cỏc mục tiờu lai giống chủ động kộo dài hơn 10 năm qua [88]. Ở Indonesia, phần lớn cỏc giống