L ời cảm ơn
3.4.3. Nghiờn cứu tớnh đa hỡnh protein của cỏc giống đậu tương bằng kỹ
thuật điện di hai chiều
3.4.3.1 So sỏnh mức độ biểu hiện protein ở giống đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt
và VMK) để nghiờn cứu. Mẫu đối chứng là mẫu lỏ khụng bị lõy nhiễm cũn mẫu thớ nghiệm là mẫu lỏ đó lõy nhiễm và thấy cú hiện tượng nhiễm bệnh. Tiến hành so sỏnh mức độ biểu hiện của cỏc protein lỏ của 2 giống này chỳng tụi thu được kết quả như sau:
Trong nghiờn cứu này, protein lỏ của mẫu đối chứng và thớ nghiệm ở
cựng thời điểm 9 ngày sau khi lõy bệnh được phõn tỏch bằng 2-DE, sau đú gel
được nhuộm bằng coomassie G250 (Hỡnh 3.12). Kết quả cho thấy cỏc điểm
protein phõn bố chủ yếu ở vựng pH từ 5 đến 9, nhiều điểm protein tạo thành vệt cú cựng một khối lượng nhưng điện tớch khỏc nhau (cỏc dạng tương đồng). Điều này là do cựng một protein nhưng chỳng cú trạng thỏi điện tớch khỏc nhau nờn cú cỏc đồng phõn khỏc nhau.
Hỡnh 3.12. So sỏnh sự đa dạng protein lỏ đậu tương đối chứng và thớ nghiệm của 2 giống sau gõy nhiễm bệnh 9 ngày (DT12 và VMK)
Ở cả hai giống DT12 và VMK, mẫu thớ nghiệm cú 9 điểm protein cựng biểu thị mức độ thay đổi (tăng/giảm1,5 lần), trong đú 8 điểm (điểm 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 9) cú nồng độ tăng và một điểm (điểm số 8) cú mức độ biểu hiện giảm
khi so với đối chứng (Hỡnh 3.12 và Bảng 3.7). Đỏng chỳ ý, ngoài bốn điểm (2, 6, 8 và 9) cú hàm lượng protein lớn thỡ 5 điểm cũn lại (1, 3, 4, 5, 7) đều cú hàm lượng protein khỏ thấp.
Bảng 3.7. Đa dạng mức độ biểu hiện của cỏc protein giữa mẫu thớ nghiệm và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh (DT12 và VMK)
Tăng/giảm phõn tKớch thước ử ước tớnh (kDa) Tăng ~7,0 Tăng 19,5 Tăng 18,0 Tăng 21,0 Tăng 22,0 Tăng 26,0 Tăng 25,0 Giảm 39,5 Tăng 51,0
Trong lỏ đậu tương, cỏc protein chiếm hàm lượng lớn chủ yếu là cỏc protein tham gia vào quỏ trỡnh quang hợp (Rubisco và cỏc protein của hệ
thống quang húa) hoặc protein dự trữ ở lỏ. Việc tăng (hoặc giảm, thậm chớ
mất hẳn) nồng độ của một số protein ở mẫu thớ nghiệm so với đối chứng của
cỏc lỏ bị nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) chứng tỏ ở cỏc giống này đó cú sự
biến đổi về mức độ trao đổi chất, sự thay đổi hoạt động của cỏc gen dẫn đến hàm lượng của một số protein thay đổi khi cú quỏ trỡnh nhiễm bệnh xảy ra. Cú
thể sự biến đổi về hàm lượng của cỏc protein này cú liờn quan đến quỏ trỡnh nhiễm bệnh hoặc cỏc phản ứng sinh lý của cõy do hậu quả của việc nhiễm bệnh. Bằng phương phỏp sắc ký khối phổ ESI-Q-TRAP, cỏc điểm protein
khỏc biệt này đó được nhận diện ở bảng 3.8
Bảng 3.8. Nhận diện cỏc protein cú mức độ biểu hiện khỏc nhau giữa thớ nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh DT12 và VMK
T
T Tờn protein Spot Số đăng ký Điểm số Khối lượng kDa Chức năng Tăng/ Giảm
1 PSI PsaN subunit precursor 1 gi|5902586 212 15.4 Quang hợp Tăng
2 PSI reaction centre subunit
IV A 2 gi|5606709 179 16.3 Quang hợp Tăng
3 Chưa định danh được 3, 4, 5 Tăng
4 Stem 28 kDa protein 6 gi|169898 128 29.0 Dự trữ Tăng
5 Vegetative storage protein 7 gi|170088 122 32. Dự trữ Tăng
6 Ribose 5-phosphate
isomerase 8 gi|15285625 89 20.1 Trao đổi chất Tăng
7 Rubisco large subunit 9 gi|3114769 235 54.2
Tạo nặng lượng, tham gia trong quỏ
trỡnh cố định carbon
Kết quả nhận diện cho thấy, giữa mẫu đối chứng và mẫu nhiễm bệnh
của hai giống DT12 và VNK, cỏc protein được phỏt hiện là cỏc protein cú liờn
quan đến chu trỡnh quang hợp (PSI PsaN subunit precursor, PSI reaction centre subunit IV A, rubisco large subunit), cỏc protein dự trữ (stem 28 kDa protein, vegetative storage protein) hoặc protein liờn quan đến trao đổi chất
(ribose 5-phosphate isomerase). Đặc biệt ở cỏc điểm 3,4,5 khụng nhận diện được trờn cơ sở dữ liệu protein.
Hiện nay đó cú một số nghiờn cứu về protein lỏ đậu tương [14], [86], [113], tuy nhiờn cỏc kết quả so sỏnh cỏc protein lỏ nhiễm bệnh với lỏ chưa lõy nhiễm hầu như cũn hạn chế. Do vậy, theo hiểu biết của chỳng tụi, việc cỏc protein quang hợp và cỏc protein dự trữ trong lỏ tăng, chứng tỏ chỳng hoạt
động mạnh tại thời điểm 9 ngày sau lõy nhiễm, trong khi đú protein liờn quan
đến trao đổi chất lại giảm. Như chỳng ta đó biết, khi bị nhiễm nấm thỡ cõy đậu
sẽ trưởng thành sớm và hậu quả là quỏ trỡnh quang hợp giảm, lỏ bị đốm vàng,
rụng và năng suất hạt kộm. Tuy nhiờn, trong giai đoạn 9 ngày lõy nhiễm, theo hiểu biết của chỳng tụi, rất cú thể cõy cú những thay đổi về sinh lý, húa sinh
như quỏ trỡnh quang hợp lại diễn ra mạnh, protein dự trữ được tổng hợp tăng
cường trong một thời gian nhất định để cõy trưởng thành sớm. Bằng chứng là nồng độ cỏc protein tham gia vào quỏ trỡnh quang hợp như PSI PsaN subunit
precursor, PSI reaction centre subunit IV A, rubisco large subunit và cỏc protein dự trữ như stem 28 kDa protein, vegetative storage protein tăng. Hiện nay, chưa thấy cú nghiờn cứu nào ghi nhận sự biến đổi của nồng độ cỏc protein lỏ ở giai đoạn 9 ngày lõy nhiễm. Do đú, cỏc nghiờn cứu của chỳng tụi đó cung cấp những dẫn liệu ban đầu đồng thời gợi ý hướng nghiờn cứu về hệ protein lỏ
để cú thể tiếp cận gần hơn với cơ chế bệnh, ngoài hướng nghiờn cứu về gen.
Đõy là cỏc thụng tin ban đầu và rất hữu ớch cho việc nghiờn cứu bệnh gỉ
sắt ở mức độ protein. Vỡ vậy, cần cú những nghiờn cứu tiếp theo để khẳng định tỏc động của bệnh gỉ sắt đến cơ chế trao đổi chất của cõy đậu tương nhiễm bệnh.
3.4.3.2. So sỏnh mức độ biểu hiện protein giữa giống đậu tương nhiễm bệnh
và khỏng bệnh gỉ sắt
Nhằm tỡm hiểu những thay đổi của cỏc protein giữa một số giống đậu tương nhiễm bệnh và khỏng bệnh, chỳng tụi đó lựa chọn và tiến hành phõn tớch 02 giống nhiễm (DT12 và VMK) và 02 giống khỏng (DT2000 và CBU8325). Kết quả cho thấy, cú 06 điểm protein lỏ ở giống nhiễm cú hàm
lượng tăng so với giống khỏng (Hỡnh 3.13).
Hỡnh 3.13. So sỏnh sự đa dạng protein lỏ đậu tương sau gõy nhiễm 9 ngày
của 2 giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và 2 giống khỏng bệnh gỉ sắt
(DT2000 và CBU8325)
Toàn bộ 6 điểm protein cú mức độ biểu hiện tăng ở giống nhiễm (DT12 và VMK) so với giống khỏng (DT2000 và CBU8325) cho thấy trong quỏ trỡnh nhiễm bệnh, đó cú sự thay đổi về quỏ trỡnh trao đổi chất và chuyển húa của
cỏc protein trong lỏ, tuy nhiờn sự tổng hợp cỏc protein trong giống khỏng dường như khụng thay đổi. Kết quả ở bảng 3.9 thể hiện mức độ so sỏnh
tăng/giảm của cỏc điểm protein được so sỏnh.
Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khỏc nhau giữa giống nhiễm bệnh gỉ
sắt (DT12, VMK) và giống khỏng (DT2000, CBU8325)
Bằng phương phỏp phõn tớch khối phổ, chỳng tụi đó tiến hành nhận
điện cỏc điểm protein này, kết quả như ở bảng 3.9. Phõn tớch cho thấy, ở cỏc giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12 và VMK) trong 6 điểm đem phõn tớch thỡ cú 4
protein đó được nhận dạng và cú mức độ biểu hiện tăng là Rubisco large subunit , Rubisco small subunit rbcS2, PSI reaction centre subunit IV A, Glyceraldehyde-3-phosphate. Đặc biệt cú hai điểm 3 và 4 khụng nhận diện được protein. Cú thể đõy là những protein chưa được đăng ký trờn cơ sở dữ
liệu protein nờn chưa phỏt hiện được.
Bảng 3.10. Nhận diện cỏc protein cú mức độ thay đổi giữa giống nhiễm
và giống khỏng bệnh gỉ sắt
TT Tờn protein Spot Số đăng ký Điểm số Khối lượng kDa Chức năng Tăng/ Giảm
1 Rubisco small subunit
rbcS2 1 gi|10946377 169 20.2
Tạo nặng lượng, tham gia
trong quỏ trỡnh cố định carbon
Tăng
2 PSI reaction centre
subunit IV A 2 gi|5606709 179 16.3 Quang hợp Tăng
3 Chưa định danh được 3, 4 Tăng
4
Glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase A subunit
5 gi|12159 238 42.7
Tham gia vào chu trỡnh đường
phõn
Tăng
5 Rubisco large subunit 6 gi|3114769 348 53.2
Tạo nặng lượng, tham gia
trong quỏ trỡnh cố định carbon
Tăng
Qua quỏ trỡnh nghiờn cứu sự đa hỡnh mức độ biểu hiện protein giữa cỏc
giống nhiễm và đối chứng, giữa giống nhiễm và giống khỏng, chỳng tụi đó
bước đầu ghi nhận sự thay đổi về hàm lượng protein trong quỏ trỡnh bị nhiễm
protein (protein tham gia vào quỏ trỡnh quang hợp và dự trữ) đều cú hiện tượng tăng cao hơn so với khi chưa lõy nhiễm hoặc so với giống khỏng. Điều này đó chứng tỏ, sự lõy nhiễm bệnh gỉ nấm đó ảnh hưởng đến quỏ trỡnh sinh húa trong cõy, làm tăng mức độ hoạt động của một số gen kiểm soỏt cỏc protein quang hợp và protein dự trữ như bảng 3.9 và bảng 3.10. Hay núi cỏch khỏc, mức độ biểu hiện protein lỏ của giống khỏng bệnh và lỏ khi chưa bị lõy nhiễm là khỏ giống nhau. Theo hiểu biết của chỳng tụi, điều này khỏ hợp lý, vỡ khi đó khỏng bệnh, cõy ớt chịu ảnh hưởng tỏc động của bệnh cho nờn cỏc quỏ trỡnh sinh trưởng và phỏt triển của cõy diễn ra khỏ bỡnh thường như là ở
giống chưa bị nhiễm bệnh, cho nờn hàm lượng cỏc protein khụng bị ảnh hưởng rừ rệt, khỏc với khi cõy bị nhiễm bệnh. Đõy mới là những số liệu cơ sở ban đầu, là tiền đề để phõn tớch, tỡm hiểu sõu hơn vai trũ của chỳng trong quỏ
trỡnh khỏng bệnh gỉ sắt của cõy đậu tương.
Sự kết hợp nghiờn cứu đa dạng di truyền DNA và đa dạng protein ngày càng trở nờn cấp thiết. Sự đa dạng nguồn gen đảm bảo cho việc tồn tại những
gen chủ chốt trong tập đoàn và khả năng tỡm kiếm cú hiệu quả. Trờn thức tế,
cú nhiều gen tồn tại trong hệ gen nhưng khụng được kớch hoạt để biểu hiện,
hoặc biểu hiện ở mức độ rất yếu. Cỏc tớnh trạng chống chịu với điều kiện
ngoại cảnh bất lợi cũng như tớnh khỏng bệnh ở cõy trồng phụ thuộc vào sự
kớch hoạt biểu hiện những gen đúng vai trũ chủ chốt trong quỏ trỡnh này. Hệ
protein tổng thể trong từng trường hợp là bức tranh hoàn hảo để đỏnh giỏ khả năng biểu hiện của cỏc gen chống chịu cũng như khỏng bệnh. Tuy nhiờn, đõy là phương phỏp với những kỹ thuật hiện đại, mà trong đú vai trũ quyết định
bao gồm nhiều khõu chuẩn bị: chọn giống khỏng và giống mẫn cảm với bệnh đặc hiệu, tỡm được thời điểm thớch hợp để nhiễm bệnh, thu mẫu sau khi
nhiễm. Quy trỡnh tỏch chiết mẫu ban đầu đũi hỏi phải cú sự nghiờn cứu dày cụng tiếp theo. Kết quả bước đầu của chỳng tụi mở ra hướng nghiờn cứu về
proteomics cú hiệu quả đối với đặc tớnh chống chịu bệnh và stress của cõy đậu tương núi riờng và thực vật núi chung.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ