L ời cảm ơn
2.2.4.Cỏc phương phỏp phõn tớch đa hỡnh protein
2.2.4.1 Tỏch chiết protein từ lỏ đậu tương
Tỏch chiết protein từ lỏ đậu tương để tiến hành điện di SDS-PAGE và
điện di 2-DE theo phương phỏp được mụ tả sau đõy [14]:
- Lỏ đậu tương của cỏc lụ đối chứng và xử lý gõy nhiễm bệnh sau khi nhiễm bệnh 6; 9 ngày được chọn để nghiờn cứu. Lỏ được làm sạch và cất giữ ở -80oC cho đến khi sử dụng.
- Nghiền mẫu lỏ trong nitơ lỏng.
- Làm đồng nhất trong 5 thể tớch 10% TCA trong acetone cú chứa 0,07%
(w/v) DTT ủ ở -20oC trong 2 giờ. Ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 30 phỳt ở 4oC. - Cặn ly tõm được rửa lại bằng acetone cú chứa 0,07% (w/v) DTT, 1mM PMSF, 2mM EDTA: làm đồng nhất trong dung dịch , ủ -20oC trong khoảng 20 phỳt. Ly tõm 13 000 vũng/phỳt, trong 30 phỳt ở 4oC (Mỗi lần ly tõm xong, đổ bỏ dung dịch bờn trờn, đảo đều cặn, khụng để vún cục, bổ sung dung dịch aceton và khuấy đều).
- Để bay hơi cho hết acetone ở nhiệt độ phũng sau khi đó làm tơi cặn,
khoảng 20-30 phỳt.
- Cặn được hũa vào dung dịch 0,1 Tris-HCl pH 7 để điện di SDS- PAGE. Để tiến hành điện di 2-DE, cặn được hũa vào dung dịch cú chứa: 9,0
M urea, 4% CHAPS, 100 mM DTT và 2% IPG buffer (1,6% Bioampholite 5/7 + 0,4 % Bioampholite3/10) theo tỉ lệ:cặn thu được từ 0,5g lỏ hũa vào 400 l dung dịch.
- Để ở nhiệt độ phũng 10 phỳt, sau đú siờu õm 2 lần, mỗi lần 20 phỳt
trong đỏ lạnh, mẫu được giữ ở -80oC.
2.2.4.2. Điện di SDS-PAGE
Điện di protein trờn gel SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là phương phỏp phõn tỏch protein hoặc polypeptide dựa vào tốc độ dịch chuyển khỏc nhau của chỳng trong điện trường.
Phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide cú chứa SDS được tiến
hành theo mụ tả trong cụng trỡnh của Trần Thị Phương Liờn và cộng sự
(1996) [11]. 15 g protein lỏ của cỏc giống đậu tương được lựa chọn phõn
tớch được hũa vào đệm điện di và biến tớnh ở 100oC trong 10 phỳt, sau đú mẫu được ly tõm 12.000 vũng/phỳt trong 10 phỳt để loại cặn.
Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide Cỏc thành phần Gel cụ đặc (4%) Gel phõn tỏch (12,5%) Nước cất (ml) 1,2 2,5 Tris HCL0,5M (ml) pH6,8 0,5 - Tris HCL1,5M (ml) pH8,8 - 2,25 Acrylamide/Bis (ml) 0,27 4,15 SDS10% (l) 20 90 APS 10% (l) 10 45 TEMED (l) 2 4,5
Điện di được tiến hành trờn mỏy điện di của hóng Bio-Rad với kớch thước gel 9x5,5cm; độ dày 0,75mm. Ở đõy chỳng tụi sử dụng gel cụ mẫu là 4% (Tris 0,125M; pH 6,8), gel tỏch mẫu là 12,5 % (Tris 0,375M, pH 8,8). Thành phần điện di được mụ tả như bảng 2.5
Điện di được tiến hành trong dung dịch đệm Tris - glyxin (Tris 0,025M; glyxin 0,193M) cú chứa SDS 1%, pH 8,3; hiệu điện thế 90V trong 4 giờ. Sau đú, bản gel được nhuộm bằng dung dịch Coomasie G-250 0,1% trong 30 phỳt rồi rửa bằng dung dịch tẩy màu (20% methanol, 7% axetic acid).
Bộ thang protein chuẩn (Fermentas): bao gồm - galactosidase (116,0 kDa), bovine serum albumin (66,2 kDa), ovalbumin (45,0 kDa), lactate dehydrogenase (35,0 kDa), restriction endonuclease Bsp98l (25,0 kDa), - lactoglobulin (18,4 kDa), lysozyme (14,4 kDa).
2.2.4.3. Điện di hai chiều – 2-DE
Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyờn lý phõn tỏch khỏc nhau. Theo chiều thứ nhất, cỏc phõn tử protein được phõn tỏch dựa theo điểm đẳng điện pI bởi nguyờn lý hội tụ theo điểm đẳng điện IEF (isoelectric focusing) trờn một thanh cố định gradient pH (vớ dụ dải pH 3-10). Chiều thứ
hai, cỏc phõn tử protein được phõn tỏch trờn điện di trờn gel polyacrylamide
(như điện di SDS-PAGE). Do đú, thực chất 2-DE là phương phỏp phõn tỏch protein theo 2 chiều, chiều thứ nhất theo điện tớch và chiều thứ hai theo trọng lượng phõn tử.
Điện di chiều 1 được thực hiện trờn mỏy điện di đẳng điện PROTEAN
IEF với thanh cố định gradient pH (ReadyStrip IPG strip); 7cm; pH 3-10 của
Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Mỹ) sử dụng cỏc qui trỡnh và húa chất như đó được mụ tả [14]. Gel 2-DE được chụp, phõn tớch và so sỏnh hỡnh ảnh với
Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
110 g protein lỏ cỏc mẫu DT12, VMK, CBU8325, DT2000 ở cỏc thời điểm 9 ngày được hũa trong 120 l đệm mẫu (9M urea, 2% CHAPS, 50 mM
DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte và Bromophenol Blue). Cỏc thanh
được đỳc sẵn tạo giải pH chớnh xỏc và thuận tiện khi sử dụng. Mẫu được thấm qua đờm vào trong cỏc thanh cố định gradient pH 3-10, dài 7cm. Sau đú, cỏc thanh này được tiến hành điện di chiều một trờn hệ PROTEAN IEF (Bio-Rad)
theo chương trỡnh hiệu điện thế: (i) 250V trong 30 phỳt; (ii) 4000V trong 3
giờ; (iii) 4000V sao cho VHOUR cuối cựng đạt 11000V.
Cõn bằng gel
Sau quỏ trỡnh điện di đẳng điện, protein trờn gel được khử bằng dung
dịch khử (6 M urea, 20% glycerol, 2% SDS và 37,5 mM Tris-HCl pH 8.8, 2% DTT w/v) và alkyl húa bằng dung dịch (6 M urea, 2% SDS 37.5 mM Tris- HCl pH 8.8, glycerol 20% and 40 mM IAA).
Điện di chiều hai
Protein trong thanh pH 3-10 sau khi điện di chiều thứ nhất và cõn bằng được tiến hành chạy chiều thứ hai (SDS-PAGE) trờn gel polyacrylamide 12,5% với điện thế 80V trong 10 phỳt, 120V trong 30 phỳt và 150V trong 2 giờ.
2.2.4.4. Nhuộm protein và phõn tớch hỡnh ảnh gel
Protein sau khi điện di 2-DE được cố định 30 phỳt trong dung dịch acetic acid 5%. Sau đú được nhuộm bằng dung dịch thuốc nhuộm Coomassie
G250 (0.05% coomassie blue G-250, 50% methanol, 10% acetic acid). Gel 2-
DE được chụp lại và phõn tớch hỡnh ảnh với sự hỗ trợ của phần mềm Progenesis SameSpots (Nonlinear Dynamics, Anh). Cỏc điểm protein được so
sỏnh vị trớ tương đồng và định lượng mức độ biểu hiện. Cỏc thớ nghiệm so sỏnh bằng điện di được lặp lại 3 lần.
2.2.4.5. Nhận diện protein trờn bản điện di 2DE bằng khối phổ
Cỏc điểm protein được lựa chọn trờn bản điện di 2-DE được cắt ra từ
bản gel polyacrylamide, gel được rửa, xử lý và thủy phõn bằng enzyme trypsin sau đú phõn tớch trờn hệ thống khối phổ ESI-Q TRAP của hóng Bruker. Quỏ trỡnh phõn tớch và nhận diện protein trờn gel 2-DE được thực
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN