L ời cảm ơn
3.3.1. Phõn tớch tớnh đa hỡnh DNA của cỏc giống đậu tương bằng chỉ thị phõn
thị phõn tử RAPD
Việc ứng dụng chỉ thị phõn tử trong nghiờn cứu sự đa dạng về mức độ
phản ứng đối với bệnh gỉ sắt của cỏc giống đậu tương đó khắc phục được
những thiếu sút và hạn chế của phương phỏp truyền thống trước đõy [8]. Trong thớ nghiệm này, 20 mồi RAPD (bảng 2.2) đó được sử dụng để nghiờn cứu sự đa dạng trong hệ gen của 50 giống đậu tương trồng tại Việt Nam cú
phản ứng khỏc nhau đối với bệnh gỉ sắt nhằm cung cấp thụng tin cú giỏ trị cho
cụng tỏc chọn tạo giống đậu tương.
Kết quả nhõn bản và tỷ lệ xuất hiện cỏc phõn đoạn DNA
Phản ứng RAPD với 20 mồi ngẫu nhiờn được thực hiện và sản phẩm
RAPD được điện di trờn gel agarose 1,8%, nhuộm gel, chụp ảnh và phõn tớch tớnh đa hỡnh DNA (Hỡnh 3.2 và Hỡnh 3.3).
Kết quả nhõn bản cỏc phõn đoạn DNA bằng phản ứng RAPD từ hệ
gen của 50 giống đậu tương cho thấy trong 20 mồi đó cú 15 mồi biểu hiện tớnh đa hỡnh. Với mỗi mồi ngẫu nhiờn, số lượng cỏc phõn đoạn DNA được
Tổng số phõn đoạn DNA nhõn bản được từ hệ gen của 50 giống đậu tương là
3380 phõn đoạn, trong đú mồi M14 cú số đoạn DNA nhõn bản là nhiều nhất
(335 phõn đoạn DNA) (hỡnh 3.2) và ớt nhất là mồi M8 (9 phõn đoạn).
Hỡnh 3.2. Hỡnh ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14
(M: Thang chuẩn DNA kớch thước 1kb; 1-50: thứ tự tương ứng
Hỡnh 3.3. Hỡnh ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18
(M: Thang chuẩn DNA kớch thước 1 kb; 1-50: thứ tự tương ứng
với tờn của 50 giống đậu tương ở bảng 3.1)
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, tổng số phõn đoạn DNA đa hỡnh của 20 mồi ngẫu nhiờn trong phản ứng PCR - RAPD là 113 đoạn. Trong đú cú 73
phõn đoạn đa hỡnh (chiếm 64,6%) và 40 đoạn khụng cú tớnh đa hỡnh (chiếm
35,4%). Bảy mồi (M2, M3, M4, M9, M10, M13 và M18) cú tớnh đa hỡnh
hoàn toàn (100%) và năm mồi (M5, M8, M12, M16 và M17) khụng cho
tớnh đa hỡnh (0%). Trong đú cú 14/20 mồi cú số phõn đoạn đa hỡnh trờn 50%, mồi M14 cú số phõn đoạn đa hỡnh bằng 50% (Hỡnh 3.2), mồi M18 số phõn đoạn đa hỡnh là 100% (Hỡnh 3.3). 1 kb 500 bp 1 kb 750 bp 500 bp 1 kb 750 bp 500 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 M M 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 M 750 bp
Kết quả này cũng phự hợp khi phõn tớch hàm lượng thụng tin đa hỡnh thể hiện ở giỏ trị PIC (bảng 3.4). Cụ thể, giỏ trị PIC của mồi M14 là 0,27 (tỷ
lệ đa hỡnh là 50%) và giỏ trị PIC của mồi M4 là 0,86 (đa hỡnh cao nhất), trong
đú 13/20 mồi cho giỏ trị PIC ≥ 0,5.
Tớnh đa hỡnh thể hiện ở sự xuất hiện hay khụng xuất hiện phõn đoạn
DNA khi so sỏnh giữa cỏc giống khi phõn tớch với mỗi mồi RAPD. Chẳng
hạn tại vị trớ khoảng 0,25 - 0,5 kb tại giếng 3 (PI462312), và 30 (CV) đó xuất
hiện phõn đoạn DNA mới khi phõn tớch với mồi số 14, hay tại vị trớ khoảng
1,5 kb giếng 6 (CBU8325), 7 (DT95), 16 (PHCB), 42 (MT2), 43 (MH) và 44
(DL) phõn đoạn DNA khụng xuất hiện khi phõn tớch với mồi TRA4.
Bảng 3.4. Tỉ lệ phõn đoạn đa hỡnh và giỏ trị PIC của cỏc mẫu nghiờn cứu
STT Mồi PIC
Tổng số đoạn đa hỡnh
% đoạn
đa hỡnh STT Mồi PIC
Tổng số đoạn đa hỡnh % đoạn đa hỡnh 1 M1 0,74 6 83,3 11 M11 0,80 6 83,3 2 M2 0,76 5 100,0 12 M12 0,00 3 0,0 3 M3 0,67 6 100,0 13 M13 0,80 5 100,0 4 M4 0,86 4 100,0 14 M14 0,27 8 50,0 5 M5 0,00 2 0,0 15 M15 0,35 6 83,3 6 M6 0,85 8 37,5 16 M16 0,00 4 0,0 7 M7 0,79 7 85,7 17 M17 0,00 3 0,0 8 M8 0,00 4 0,0 18 M18 0,50 4 100,0 9 M9 0,84 10 100 19 M19 0,77 8 87,5 10 M10 0,75 4 100 20 TRA4 0,82 10 80,0 Tổng 113 64,6
Mối quan hệ di trưyền của 50 giống đậu tương phản ứng khỏc nhau với
bệnh gỉ sắt
Để cú bức tranh tổng quỏt về mối quan hệ giữa 50 giống đậu tương
nghiờn cứu ở mức độ phõn tử trờn cơ sở phõn tớch RAPD với 20 mồi ngẫu
nhiờn, chỳng tụi đó thiết lập được sơ đồ hỡnh cõy của 50 giống đậu tương
(Hỡnh 3.4). Kết quả cho thấy 50 giống đậu tương phõn bố làm 2 nhỏnh lớn (nhỏnh I và nhỏnh II).
Nhỏnh I chỉ cú 2 giống VK2 và DT12, cú khoảng cỏch di truyền so với
48 giống cũn lại là 21% (1 - 0,79).
Nhỏnh II gồm 48 giống đậu tương cũn lại cú khoảng cỏch di truyền dao động từ 0% đến 15%. Đỏng lưu ý là hầu hết cỏc giống cú cựng nguồn gốc địa
lý lập thành một nhúm nhỏ trờn cõy phõn loại. Điển hỡnh, cú 4 mẫu PI200492, PI230970, PI462312, PI459025 cú nguồn gốc từ Nhật, Ấn Độ và Trung Quốc lập thành một nhúm phụ. Trong phạm vi nghiờn cứu này, chỳng tụi chưa phỏt
hiện được sự sai khỏc giữa hai giống DT95 và HSP1.
So sỏnh với nghiờn cứu của tỏc giả Nguyễn Đức Thuận và cộng sự
(2006) được tiến hành trờn 30 giống đậu tương (từ Viện Lỳa Đồng bằng sụng
Cửu Long) với 13 cặp mồi RAPD, kết quả cho thấy cú 9 mồi thể hiện sự đa
hỡnh, đồng thời cú 4 nhúm (nhúm A, B, C, D) được phõn chia với hệ số tương đồng từ 0,8-0,98 [21]. Hệ số này giao động khỏ hẹp so với nghiờn cứu của chỳng tụi (hệ số tương đồng 0,27-0,86). Như vậy, với 20 mồi ngẫu nhiờn, chỳng tụi cho thấy độ đa dạng của cỏc giống nghiờn cứu cao hơn so với nghiờn cứu của tỏc giả Nguyễn Đức Thuận và cộng sự (2006). Ngoài ra, kết quả phõn tớch tớnh đa hỡnh DNA bằng kỹ thuật RAPD cũn tỡm thấy ở cụng bố của Đinh
Thị Phũng và cộng sự (2008) [18] và của Vũ Thị Anh Đào (2011) [4].
Như vậy, sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu nhiờn để phõn tớch
DNA hệ gen của 50 giống đậu tương chỳng tụi đó cho thấy mức độ đa dạng di truyền giữa cỏc giống đậu tương nghiờn cứu. Kết quả cú 15 mồi biểu hiện tớnh đa hỡnh với giỏ trị PIC dao động từ 0,27 (mồi M14) đến 0,86 (mồi M4), trong
đú 13 mồi cho giỏ trị PIC ≥ 0,5. Khoảng cỏch di truyền và biểu đồ hỡnh cõy (dendrogram) được thiết lập dựa trờn hệ số tương đồng di truyền và phương
phỏp phõn nhúm UPGMA, 50 giống đậu tương nghiờn cứu được phõn bố ở
cỏc nhúm thuộc 2 nhỏnh trong cõy phỏt sinh. Nhỏnh I chỉ cú 2 giống VK2 và DT12, cú hệ số sai khỏc di truyền so với 48 giống cũn lại khoảng 21%. Xột về khả năng phản ứng khỏc nhau với bệnh gỉ sắt, chỳng tụi nhận thấy sự phõn nhỏnh của cỏc giống đậu tương khỏ ngẫu nhiờn, chưa theo đặc tớnh khỏng bệnh một cỏch rừ nột.
Từ những dữ liệu trờn cho thấy, tớnh đa hỡnh DNA của 50 giống đậu
tương trong phạm vi 20 cặp mồi RAPD đó minh chứng cho sự khỏc nhau trong cấu trỳc DNA của cỏc giống đậu tương nghiờn cứu.
Hỡnh 3.4. Sơ đồ hỡnh cõy của 50 giống đậu tương dựa trờn hệ số tương đồng di truyền xỏc định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phõn nhúm UPGMA
Nhỏnh thứ hai