L ời cảm ơn
3.3.2.Phõn tớch tớnh đa hỡnh DNA của cỏc giống đậu tương bằng chỉ thị
phõn tử SSR
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) - một chỉ thị đồng trội biểu thị tớnh đa hỡnh cao được sử dụng rộng rói và hiệu quả trong nghiờn cứu cấu trỳc
di truyền, nghiờn cứu quỏ trỡnh tiến húa, làm rừ độ thuần của vật liệu tạo
giống... Chỉ thị SSR được phỏt triển mạnh và cú ưu thế trong nghiờn cứu về
tớnh đa dạng di truyền, lập bản đồ gen ở đậu tương [12], [18], [24], [26]. Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng 15 cặp mồi SSR (Bảng 2.3) trong phản ứng PCR-SSR để nhõn bản cỏc phõn đoạn DNA từ hệ gen của 50
giống đậu tương, kết quả phõn tớch hỡnh ảnh điện di sản phẩm SSR của 15 cặp
mồi (hỡnh 3.5A, hỡnh 3.5B, hỡnh 3.5C và hỡnh 3.5D). Sản phầm PCR-SSR được
kiểm tra trờn gel agarose 1,5%. Sau đú, cỏc phõn đoạn PCR-SSR được phõn tỏch trờn điện di polyacrylamide 15% và nhuộm bạc. Trong số 15 chỉ thị SSR
sử dụng để phõn tớch sự đa dạng di truyền của 50 giống đậu tương thỡ cú 14 chỉ
thị cho tớnh đa hỡnh di truyền (trừ chỉ thị Satt460 cú kết quả khụng đa hỡnh). Thống kờ cỏc phõn đoạn DNA được nhõn bản, chỳng tụi đó phỏt hiện được 81 alen tại 14 locus, số alen đa hỡnh tại mỗi locus biến động từ 4 đến 8 và đạt trung bỡnh là 6 alen (bảng 3.5). Chỉ thị Satt489 cho số lượng alen nhiều
nhất là 8 alen. Giỏ trị PIC (Hàm lượng thụng tin đa hỡnh) của cỏc chỉ thị SSR
biến động từ 0,473 đến 0,798, đạt trung bỡnh 0,729 và biờn độ dao động của
hệ số đa dạng giữa cỏc chỉ thị là tương đối hẹp (0,473 - 0,798) (bảng 3.5). Kết
quả này cho tớnh đa hỡnh cao hơn khi so sỏnh với nghiờn cứu của Trần Thị Ph-
ương Liờn và cộng sự trờn cựng đối tượng (0,6326) [13]. So sỏnh với một số
tỏc giả khỏc trờn thế giới, kết quả phõn tớch đa hỡnh di truyền DNA trờn cỏc giống đậu tương của chỳng tụi tiệm cận với nghiờn cứu của Abe và cộng sự
(2003) trờn tập đoàn 131 giống đậu tương từ 14 nước Chõu Á (hệ số đa dạng
trung bỡnh 0,782), cao hơn so với nghiờn cứu của Narvel và cộng sự (2000) trờn 74 giống đậu tương ở Bắc Mỹ (hệ số đa dạng trung bỡnh 0,56) [85].
A
B
C
D
Hỡnh 3.5. Cỏc alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C) Satt 005 (D) của 50 giống đậu tương
Trong 15 cặp mồi SSR, cú 7 cặp mồi thường được sử dụng để nghiờn cứu đa dang di truyền là Satt-042, Satt-005, Satt-146, Satt-173, Satt-175, Satt-009 và Satt-431, chỳng thường cho nhiều allen: từ 7-11 allen [26], [85]. Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cho thấy cỏc chỉ thị này cho số allen dao động từ 4-7 alen. Mức đa hỡnh tương ứng với độ biến động di truyền giữa
cỏc mẫu giống đậu tương đó chứng tỏ sự đa dạng di truyền tồn tại ở cỏc
phỏt hiện giữa giống đậu tương SL và HG1 là 0,97. Mối quan hệ này được
hỗ trợ bằng sơ đồ hỡnh cõy qua kết quả phõn tớch nhúm (Hỡnh 3.6).
Giỏ trị tương đồng cao chứng tỏ sự tồn tại dũng chung chuyển gen và
trao đổi gen và mức độ chọn lọc ở đậu tương khỏ cao. Hệ số tương đồng thấp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhất (0,68) được xỏc định giữa cỏc giống nhiễm bệnh gỉ sắt đối với cỏc giống
cú phản ứng trung gian và khỏng bệnh gỉ sắt. Tuy nhiờn, trờn cựng một nhúm
nhiễm bệnh gỉ sắt được biểu hiện trờn biểu đồ hỡnh cõy, giống VK2 cú phản ứng trung gian với bệnh gỉ sắt nhưng lại cú xu hướng nghiờng về nhúm nhiễm
bệnh gỉ sắt.
Bảng 3.5. Kết quả phõn tớch sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR
STT SSR Dạng SSR Liờn kết Số alen PIC
1 Satt005 (ATT)19 D1b 7 0,770 2 Satt009 (ATT)14 N 5 0,690 3 Satt042 (ATT)27 A1 4 0,473 4 Sat_064 (AT)34 G 5 0,767 5 Satt146 (ATT)17 F 7 0,798 6 Sct_187 (CT)10 G 6 0,757 7 Satt150 (ATT)20 M 5 0,686 8 Satt173 (ATT)18 O 5 0,767 9 Satt175 (ATT)16 M 7 0,798 10 Satt373 (ATT)21 L 6 0,753 11 Satt431 (ATT)21 J 5 0,692 12 Satt489 (ATT)23(GTT) C2 8 0,784
13 Satt557 (ATT)17GAT C2 5 0,707
14 Satt567 (ATT)14 M 6 0,757
Phõn tớch sơ đồ hỡnh cõy ở hỡnh 3.6 cho thấy 50 giống đậu tương
nghiờn cứu được chia thành hai nhỏnh rừ rệt, khoảng cỏch di truyền giữa hai nhỏnh là 29% (1-0,71):
(1) Nhỏnh thứ nhất, bao gồm cỏc giống nhiễm bệnh gỉ sắt và một giống trung
gian VK2, cú thể phõn tiếp thành hai nhỏnh phụ. Nhỏnh phụ thứ nhất (nhúm I) gồm 9 giống DBBT, CV, CSGL, DL, HG, QHCB, HG1, SL và VX93 cú khoảng cỏch di truyền gần nhau, với hệ số tương đồng dao động từ 0,802 đến
0,975. Nhỏnh phụ thứ hai lại chia ra hai nhỏnh nhỏ bao gồm: (i) nhỏnh nhỏ 1
cú cỏc giống (nhúm II) như HTDT, MH, DTBT, VMK, LVG, HN, CBD, ND, V79, DT84, DT12, và (ii) nhỏnh nhỏ 2 cú cỏc giống (nhúm III): MD, MT2, CB7, VX92, TTHT và VK2, cú hệ số tương đồng từ 0,65 đến 0,95.
(2) Nhỏnh thứ hai bao gồm cỏc giống khỏng bệnh và cỏc giống trung gian.
Trong nhỏnh này, cũng cú 2 nhỏnh phụ: nhỏnh phụ thứ nhất gồm cỏc giống
(nhúm IV) như DT96, CT2, HG2, VK3, MT1, CT1, PS, NS, M103, PT và PHCB với hệ số tương đồng từ 0,75 - 0,95; trong khi đú nhỏnh phụ thứ hai
lại phõn chia làm 2 nhỏnh phụ nhỏ. Nhỏnh phụ nhỏ 1 cú cỏc giống (nhúm V)
như CBU8325, ZG, CNB, HSP1, PI462312 với hệ sống tương đồng từ 0.82- 0,95, nhỏnh phụ nhỏ 2 cú cỏc giống (nhúm VI) như MTD65, DT2000, HSP2,
PI230970, PI459025, PMTQ, DT95, PI200492 với khoảng cỏch di truyền trong khoảng 0,68-0,95.
Sự phõn nhỏnh chi tiết trờn sơ đồ hỡnh cõy cho thấy cỏc giống đậu tương nghiờn cứu cú sự tương đồng cao với cỏc giống khỏng bệnh chuẩn như: cỏc giống DT95 và PMTQ với cỏc giống PI200492 (Rpp1), PI459025 (Rpp4); cỏc giống HSP2, DT2000, MTD65 với giống PI230970 (Rpp2), cỏc giống HSP1, CNB, ZG, CBU8325 với giống PI462312 (Rpp3). Cỏc giống kể
trờn cú chứa cỏc gen khỏng tương ứng hay khụng là vấn đề rất lý thỳ và cần được tiếp tục nghiờn cứu.
Hỡnh 3.6. Sơ đồ hỡnh cõy về mối quan hệ của 50 giống đậu tương cú phản ứng khỏc nhau với bệnh gỉ sắt dựa trờn chỉ thị phõn tử SSR
Một số cụng trỡnh nghiờn cứu lập bản đồ QTL liờn quan đến tớnh
khỏng bệnh gỉ sắt ở cỏc giống đậu tương của Mỹ, Brazil đó phỏt hiện thấy
một số chỉ thị SSR liờn kết gần với gen quy định tớnh trạng khỏng bệnh gỉ sắt
trờn nhiễm sắc thể: Sat-064, Sct-187 liờn kết với Rpp1 trong nhúm liờn kết G trờn NST số 18; Sat-460 liờn kết với Rpp3 trong nhúm liờn kết C2 trờn NST số 6. Gen Rpp4 cũng đó được định vị thuộc nhúm liờn kết G trờn NST 18, cũn Rpp3 thuộc nhúm liờn kết J trờn NST 16 và Rpp5 thuộc nhúm N trờn NST số 3 [77], [81]. Xu hướng trờn thế giới hiện nay là lai cỏc giống khỏng chứa cỏc gen khỏng khỏc nhau để tạo ra giống mang đồng thời mang cỏc gen khỏng đú. Vỡ vậy, việc khảo sỏt tỡm kiếm cỏc nguồn giống mang gen khỏng chuyờn biệt là rất cần thiết. Với cỏc cặp mồi SSR Sat-064, Sct-187, Sat-460, Satt-009, Satt-431, Satt-489; Satt-557 trong cỏc nhúm liờn kết G, J, C2, N, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhỏnh thứ nhất Nhỏnh thứ hai Nhỏnh phụ I Nhỏnh phụ II Nhỏnh phụ II Nhỏnh phụ I I II III IV V VI
cựng kết hợp với cỏc cặp mồi đa dạng, chỳng tụi đó bước đầu nhận được kết
quả đa dạng di truyền liờn quan đến tớnh khỏng bệnh gỉ sắt.
Sơ đồ hỡnh 3.6 cho thấy cỏc giống đậu tương khỏc nhau về mặt di
truyền phõn bố theo khả năng khỏng bệnh gỉ sắt. Như vậy, cũng giống như
cỏc chỉ thị phõn tử khỏc, kỹ thuật SSR cho phộp xỏc định nhanh mối quan hệ
di truyền giữa cỏc giống đậu tương tham gia thớ nghiệm, điều này rất cú ý
nghĩa kinh tế trong việc chọn tạo giống cõy trồng. Túm lại, trong số 15 cặp
mồi SSR được sử dụng cho 50 giống đậu tương cú phản ứng khỏc nhau với
bệnh gỉ sắt, cú 14 cặp mồi biểu hiện tớnh đa hỡnh. Đó cú 81 phõn đoạn DNA được nhõn bản, số lượng phõn đoạn DNA được nhõn bản từ mỗi cặp mồi SSR dao động từ 4 đến 8 phõn đoạn. Giỏ trị PIC biến động từ 0,473 (Satt042) đến
0,798 (Satt175), đạt trung bỡnh là 7,29. Trong 15 cặp mồi cú 10 cặp mồi cho tớnh đa hỡnh cao nhất với hệ số đa dạng di truyền trờn 0,7. Phõn tớch đa dạng di truyền trờn sơ đồ hỡnh cõy cho thấy khoảng cỏch di truyền giữa hai nhỏnh
là 29%. Những thụng tin này là cơ sở cho việc tuyển chọn giống đậu tương
khỏng bệnh gỉ sắt phục vụ sản xuất, đồng thời cũng là cơ sở cho việc lựa chọn
cặp bố mẹ khỏc xa nhau về mặt di truyền phục vụ cụng tỏc lai tạo giống.
Mối tương quan giữa chỉ thị RAPD và SSR khi phõn tớch đa hỡnh ở đậu tương
Bằng việc ỏp dụng cỏc chỉ thị phõn tử RAPD và SSR, chỳng tụi đó
đỏnh giỏ được sự đa dạng của 50 giống đậu tương Việt Nam. Để so sỏnh mối
tương quan của hai loại chỉ thị phõn tử RAPD và SSR với kết quả phõn tớch
đa hỡnh trờn 50 giống đậu tương nghiờn cứu, chỳng tụi nhận thấy sử dụng chỉ thị RADP cú 15/20 (chiếm 75%) mồi biểu hiện tớnh đa hỡnh trong khi đú ở chỉ thị SSR là 14/15 mồi (chiếm 93.3%), biểu thị tớnh đa hỡnh cao hơn. Kết quả
này cú thể giải thớch bằng kớch thước ngắn và tớnh ngẫu nhiờn của 20 mồi RAPD, do đú chỳng chỉ bắt cặp một cỏch rất ngẫu nhiờn với DNA hệ gen.
Trong khi đú vỡ cỏc trỡnh tự SSR là trỡnh tự lặp lại, đó được nghiờn cứu và biết trước, chỳng lặp lại rất nhiều lần trong cơ thể, do vậy mức độ đa hỡnh của chỉ
Về giỏ trị PIC, ở chỉ thị RAPD chỉ số PIC giao động từ 0,27 đến 0,86
trong khi đú ở chỉ thị SSR chỉ số này biến động từ 0,473 đến 0,798. Như vậy sử dụng chỉ thị SSR thỡ biờn độ dao động của hệ số đa dạng là tương đối hẹp hơn so với chỉ thị RAPD. Mặt khỏc, khi sử dụng sơ đồ hỡnh cõy để phõn tớch tớnh đa dạng di truyền, chỳng tụi nhận thấy ở cả 2 chỉ thị RAPD và SSR, 50 giống đậu tương đều được phõn thành 2 nhỏnh lớn với khoảng cỏch di truyền lần lượt là 21% và 29%, hệ số sai khỏc di truyền ở chỉ thị SSR là cao hơn so
với chỉ thị RAPD. Kết quả này cũng thể hiện ở sự phõn nhỏnh lớn và nhỏnh
phụ của 50 giống đậu tương khi sử dụng hai loại chỉ thỉ thị khỏc nhau. Kết
quả ở chỉ thị RAPD thỡ 50 giống chỉ được phõn làm 2 nhúm chớnh, trong khi
đú ở chỉ thị SSR thỡ 50 giống được phõn thành 5 nhúm nhỏ (I, II, III, IV, V) với hệ số tương đồng khỏc nhau (hỡnh 3.6).
Điều thỳ vị là, khi sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 cặp mồi thỡ sự phõn nhúm ở cõy phõn loại (hỡnh 3.4) chưa cho thấy mối liờn hệ chặt chẽ với khả năng phản ứng khỏc nhau với bệnh gỉ sắt. Tuy nhiờn, khi sử dụng kỹ thuật SSR với 15 cặp mồi, chỳng tụi đó nhận thấy bước đầu cú sự phõn nhỏnh theo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khả năng khỏng bệnh gỉ sắt (hỡnh 3.6). Cõy phõn loại được phõn thành 2 nhỏnh lớn trong đú nhỏnh thứ nhất gồm cỏc giống nhiễm bệnh và một giống trung gian, nhỏnh thứ hai bao gồm cỏc giống khỏng bệnh và cỏc giống trung gian. Kết quả này một lần nữa khẳng định, sử dụng phương phỏp SSR cú độ đa hỡnh cao hơn và tin cậy hơn, đõy là cơ sở ban đầu mở ra khả năng tỡm kiếm
cỏc giống đậu tương Việt Nam mang từng gen khỏng chuyờn biệt.
3.4. Phõn tớch tớnh đa hỡnh protein lỏ của một số giống đậu tương phản ứng khỏc nhau vớ́i bệnh gỉ sắt