L ời cảm ơn
2.2.1. Phương phỏp nhiễm bệnh nhõn tạo
Thớ nghiệm được bố trớ theo phương phỏp khối ngẫu nhiờn hoàn chỉnh
(RCBD-Randomized complete Block design) với ba lần nhắc lại trong khu
cỏch biệt để đỏnh giỏ khả năng khỏng bệnh.
Kỹ thuật lõy nhiễm: Khi lõy nhiễm, rửa bào tử trực tiếp trờn lỏ với nư-
ớc cất vụ trựng, lọc qua 1 lần vải để loại bỏ cặn bẩn, xỏc định mật độ bào tử
trong dịch vẩn bằng buồng đếm Goriaev dưới kớnh hiển vi và điều chỉnh bằng phương phỏp pha loóng. Dịch vẩn bào tử với mật độ 5 x 104bào tử/ml được đưa đều lờn hai mặt lỏ bằng bỡnh phun với lượng phun 0,5 ml/dm2 lỏ.
Trỡnh tự nhiễm bệnh được tiến hành như sau:
- Cỏc giống đậu tương được gieo trong nhà lưới trờn cựng một nền đất và được chăm súc với cựng một điều kiện. Khi cõy cú một lỏ kộp đó mở hoàn toàn, việc lõy nhiễm mới được thực hiện.
- Dịch vẩn bào tử với mật độ 5 x 104 bào tử/ml được đưa đều lờn hai mặt lỏ bằng bỡnh phun với lượng phun 0,5 ml/dm2 lỏ.
Độ ẩm bóo hoà được tạo ra trong thời gian 24 giờ bằng cỏch chụp tỳi nylon lờn cõy. Trước đú, cõy được tưới đẫm nước, đồng thời mặt trong của tỳi
được giữ ở chỗ mỏt, khụng cú ỏnh sỏng trực tiếp. Sau đú, cỏc cõy được để trong điều kiện phỏt triển bỡnh thường, hoặc được che nắng (trong thời kỡ tiềm
dục) và tưới nước thường xuyờn để tạo độ ẩm cao.
Sau 3 tuần lõy nhiễm, việc tiến hành đỏnh giỏ đặc điểm của vết bệnh,
mức độ tạo quầng và mức độ hỡnh thành bào tử theo phương phỏp của
Nguyễn Thị Bỡnh (dựa trờn phương phỏp cơ sở của AVRDC) [2]. Song song với phương phỏp trờn, số lượng vết bệnh trờn tổng diện tớch lỏ cũng được đỏnh giỏ theo thang 4 điểm: điểm 1 (khụng cú vết bệnh); điểm 2 (từ 1 vết
bệnh đến 20% tổng diện tớch lỏ bị bệnh); điểm 3 (21 đến 50% tổng diện tớch lỏ
bị bệnh); điểm 4 (trờn 50% diện tớch lỏ bị bệnh). Từ thang 4 điểm, chỳng tụi
tớnh chỉ số tớch lũy bệnh theo thời gian AUDPC (Area Under Disease Progress Curve) theo cụng thức sau:
AUDPC = (Yi + Yi+1)/2 (Ti+1 + Ti)
Trong đú: Yi: chỉ số bệnh ở ngày điều tra i
Yi+1: Chỉ số bệnh ở ngày điều tra i+1
T i: Ngày theo dừi bệnh ở thời điểm i
Ti+1: Ngày theo dừi bệnh ở thời điểm i +1
Chỉ số AUDPC được sử dụng để phõn tớch thống kờ theo chương trỡnh SAS [41]. Khả năng khỏng bệnh được xỏc định thụng qua chỉ số AUDPC của
giống khỏng và giống nhiễm bệnh dựng làm đối chứng so với cỏc giống cần phõn tớch, đồng thời kết hợp với cỏc phõn tớch về phản ứng bệnh, khả năng tạo
bào tử, tạo quầng.
Bố trớ thớ nghiệm gõy nhiễm bệnh ở lỏ cho nghiờn cứu 2-DE:
Các giống đậu tương: Nhiễm bệnh Kháng bệnh
Nhập nội: DT12 DT2000
Địa phương VMK CBU8325
Cỏc giống đậu tương đượcgieo trồng tại Viện Bảo vệ Thực vật, khi cõy
bắt đầu ra lỏ sũ, chuyển sang nhà lưới Viện Cụng nghệ sinh học chăm súc để
trỏnh những tỏc động bờn ngoài, cỏch ly chậu đối chứng với chậu thớ nghiệm,
khi cõy cú lỏ kộp bắt đầu gõy nhiễm bệnh.
Hỡnh 2.1. Hỡnh ảnh cõy thớ nghiệm nhiễm bệnh nhõn tạo trong phũng thớ nghiệm A (đối chứng) và B (thớ nghiệm)
A
2.2.2. Phương phỏp phõn tớch hoỏ sinh
Mẫu nghiờn cứu được chuẩn bị như sau: hạt khụ được búc vỏ, tỏch lấy
hai lỏ mầm và nghiền nhỏ thành bột mịn. Bột được bảo quản trong lọ cú nỳt
kớn ở 40C.
2.2.2.1. Xỏc định hàm lượng lipid tổng số
Lipit trong hạt đậu tương được chiết rỳt bằng dung mụi hữu cơ (petroleum ether) và xỏc định hàm lượng theo cụng thức sau đõy:
A: Khối lượng mẫu ban đầu
B: Khối lượng mẫu sau khi loại lipid
2.2.2.2. Xỏc định hàm lượng protein tan tổng số
Protein tan tổng số được chiết bằng dung dịch đệm phosphate citrate (pH 10) và NaCl 1M và xỏc định bằng thuốc thử Foling sử dụng mỏy quang
phổ UV, bước súng hấp thụ 750nm. Hàm lượng protein được tớnh theo đồ thị đường chuẩn (hỡnh 2.2).
Hỡnh 2.2. Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương phỏp Lowry
A - B A x100% Hàm lượng lipid (%) = 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Abs -0.01 0.0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.11 0.12 0.13 mg Reading vs. Concentration Blank Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 std5
2.2.2.3 Xỏc định thành phần amino acid trong hạt đậu tương
20 giống đậu tương được lựa chọn, mỗi mẫu cõn 100g hạt sau đú mẫu
hạt đậu tương được sấy khụ ở trong 20 phỳt đến khối lượng khụng đổi. Sau khi
sấy, hạt được nghiền nhỏ và hũa tan trong dung dịch acid HCl 6N. Mẫu được
thủy phõn trong dung dịch acid HCl ở nhiệt độ 110oC qua đờm. Sau khi thủy phõn protein, cỏc amino acid được chiết qua giấy lọc, xử lý và được phõn tớch
trờn mỏy phõn tớch amino acid tự động - HPLC amino Quan Series II (Hewlett Parkard, Hoa Kỳ) tại phũng Húa sinh protein, Viện Cụng nghệ sinh học.
2.2.3. Cỏc phương phỏp phõn tớch đa dạng di truyền DNA
2.2.3.1. Phương phỏp tỏch chiết và tinh chế DNA tổng số
DNA tổng số được tỏch chiết từ mầm đậu tương. Mầm hạt được chuẩn
bị bằng cỏch ngõm hạt khụ trong nước cất 1 giờ, cho hạt nẩy mầm trờn giấy
lọc trong hộp lồng ở buồng tối, khi mầm dài khoảng 2cm, tỏch riờng lấy phần
thõn mầm rồi bảo quản trong tủ lạnh sõu (-200C).
Lượng mầm đậu tương khoảng 300-500mg được nghiền trong nitơ lỏng
thành dạng bột mịn. Sau đú, mẫu được hoà trong 3ml đệm chiết (Tris HCl
0,1M pH 8; EDTA 0,5M pH 8; NaCl 6M; - Mecaptoethanol (0,14M; CTAB 4%) ủ 650C trong 90 phỳt để chiết DNA.
Protein và tạp chất được loại bỏ bằng cỏch xử lý dịch chiết bằng một
thể tớch tương đương hỗn hợp dung dịch phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 25: 24: 1). Ly tõm để thu lấy pha trờn và tiếp theo là xử lý pha đú bằng
dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24: 1). Ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 4oC rồi thu dịch pha trờn.
DNA trong dung dịch được tủa bằng ethanol 100% (tỷ lệ thể tớch 1: 3) ở -200C trong ớt nhất 2 giờ, sau đú ly tõm thu tủa. DNA được rửa lại bằng
ethanol 70% hai lần, làm khụ trờn mỏy hỳt chõn khụng SpeedVac trong 5 phỳt rồi hoà trong 400l nước cất khử ion vụ trựng. Điện di kiểm tra DNA thu được trờn gel agarose 0,8%.
Bổ sung 0,1 l RNase 10 mg/ml vào 100 l dung dịch DNA, ủ 370C trong 1giờ để loại RNA. Lặp lại bước 2 và 3 đó nờu trờn để loại RNase khỏi
dung dịch. DNA tinh sạch này được sử dụng làm nguyờn liệu cho cỏc
nghiờn cứu tiếp theo.
2.2.3.2. Phương phỏp xỏc định DNA bằng quang phổ
Nguyờn tắc của phương phỏp đo quang phổ là dựa vào sự hấp thụ mạnh
của tia tử ngoại ở bước súng 260nm và 280nm của cỏc purin và primidin. Một đơn vị OD260nm (Optical Density260nm) tương ứng với nồng độ là 50 g/ml cho dung dịch DNA sợi đụi. Do đú, nồng độ DNA trong mẫu được tớnh theo cụng
thức (2.3):
CDNA (g/ml) = OD260nm x50 x hệ số pha loóng (2.3)
Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, chỳng tụi đo OD ở giỏ trị
280nm (OD280nm). Dung dịch nucleic acid được xem là sạch (khụng lẫn
protein) khi tỉ số OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2. 2.2.3.3. Điện di DNA trờn gel agarose
- Chuẩn bị gel agarose: Cõn một lượng agarose thớch hợp vào 100 ml dung dịch đệm TAE. Đun trong lũ vi súng cho đến khi thu được dịch trong
suốt. Để nguội đến khoảng 50 - 600C, đổ dung dịch agarose vào khay đó cài sẵn răng lược. Sau một thời gian gel đụng lại thỡ rỳt răng lược ra và đặt bản
gel vào bể điện di cú chứa dung dịch đệm TAE.
- Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thớch hợp với đệm tra mẫu, tra vào “giếng” trờn bản gel. Điện di với dũng điện một chiều cú hiệu điện thế 100V,
dũng điện 60 - 80 mA trong khoảng 30 phỳt.
- Sau khi kết thỳc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuụn và ngõm vào dung dịch EtBr cú nồng độ 0,5 l/ml. Lấy bản gel ra sau 10 - 15 phỳt và rửa trong nước sạch.
2.2.3.4. Điện di DNA trờn gel polyacrylamide và nhuộm bạc
Điện di cỏc đoạn DNA nhỏ được tiến hành trờn gel polyacrylamide 15% trong dung dịch đệm TBE với hiệu điện thế 100V trong 3 giờ. Sau đú gel nhuộm
bạc theo phương phỏp cải tiến. Cụng thức đổ gel và nhuộm bạc được trỡnh bày ở
bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương phỏp cải tiến
Gel acrylamide 15% (V = 8ml) 4ml Acrylamide/bis 30%; 1,6ml TBE 5X, 2,4ml H2O, 40àl APS 10%, 5 àl TEMED Phương phỏp nhuộm bạc
1. Cố định: dung dịch acid acetic 10% trong 30 phỳt 2. Rửa: nước cất trong 10 phỳt
3. Nhuộm bạc: dung dịch bao gồm 1‰ (w/v) AgNO3, 1‰ (v/v) formaldehyt 37% trong 30 phỳt
4. Rửa: Sau khi nhuộm bạc, rửa qua nước trong 1-2 phỳt 5. Hiện màu: 3% NaOH, 0,65% Na2CO3, và 0,4% HCOH 6. Rửa: rửa qua dung dịch cố định, sau đú là nước cất
Trong phương phỏp này, gel sau khi điện di đựơc cố định và nhuộm
trong dung dịch chứa 5% ethanol, 1% nitric acid và 0,1% AgNO3 trong 5 phỳt. Gel sau đú rửa nhanh với nước tinh khiết trong 10 giõy và nhỳng vào dung dịch chứa 3% NaOH, 0,65% Na2CO3, và 0,4% HCOH (formaldehyde) từ 2 đến 3 phỳt. Cuối cựng nhỳng vào dung dịch chứa 5% ethanol và 1% nitric acid trong vũng 1 phỳt. Sản phẩm sẽ được chụp để phõn tớch.
2.2.3.5. Phõn tớch đa hỡnh bằng kỹ thuật RAPD
Phản ứng khuếch đại DNA sử dụng cỏc mồi RAPD được tiến hành trong thể tớch 25 l. Thành phần và chu trỡnh nhiệt của PCR-RAPD được mụ
Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR - RAPD cú tổng thể tớch 25 l bao gồm: MgCl2 (1,6 mM); 2 mM dNTPs; đoạn mồi 10 pm; 1 đơn vị Taq polymerase và 10 ng DNA khuụn. Phản ứng PCR- RAPD thực hiện trong
mỏy PCR- Thermal Cycler PTC 100 theo chu kỳ nhiệt: 940C - 3 phỳt; 35 chu kỳ: 920C - 1 phỳt; 350C/ 1 phỳt; 720C/ 1phỳt. Sau đú 720C - 10 phỳt; lưu giữ ở 40C. Điện di phõn tớch sản phẩm PCR trờn gel agarose 1,4% ở điện ỏp 120V trong 2 giờ. Nhuộm gel bằng ethidium bromide soi và chụp ảnh trờn mỏy Gel Doc (Bio-Rad, Mỹ). Chỉ những phõn đoạn DNA cú độ nột trung bỡnh trở lờn mới được ghi nhận. Những phõn đoạn DNA mờ khụng được sử dụng cho
phõn tớch cuối cựng.
2.2.3.6. Phõn tớch đa hỡnh bằng kỹ thuật SSR
Phản ứng PCR-SSR được tiến hành với chu trỡnh nhiệt là: 950C: 4phỳt; 35 chu kỳ: 950C: 1 phỳt, 450C - 580C (tuỳ từng cặp mồi): 45 giõy, 720C: 1 phỳt, kết thỳc 720C: 9 phỳt; lưu giữ ở 4oC
Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR- SSR trong 25 ml bao gồm : MgCl2 (1,6 mM); 2 mM dNTPs; đoạn mồi 10 pm; 1 đơn vị Taq DNA polymerase và 10 ng DNA khuụn.
Điện di phõn tớch sản phẩm PCR -SSR trờn gel polyacrylamide 15% ở
hiệu điện thế 100V trong 3 giờ. Nhuộm gel bạc và chụp ảnh trờn mỏy Gel Doc (Bio-Rad, Mỹ) để phõn tớch.
2.2.3.7. Phương phỏp xử lý số liệu
- Phõn tớch cỏc tớnh trạng số lượng theo phương phỏp thống kờ sinh học.
Cỏc trị số thống kờ được xử lý trờn mỏy vi tớnh bằng chương trỡnh Excel, ở
mức ý nghĩa α = 0,05 hoặc α= 0,01.
- Xử lý kết quả phõn tớch RAPD, SSR
Dựa vào hỡnh ảnh điện di sản phẩm PCR và sự xuất hiện cỏc băng SSR
Phõn tớch số liệu theo quy ước: - Số 1 - xuất hiện băng SSR
- Số 0 - khụng xuất hiện băng SSR.
Cỏc số liệu này được nhập vào phần mềm Excel theo từng mồi.
Hệ số đa dạng di truyền H - genetic diversity index [87] cho mỗi chỉ thị
phõn tử được tớnh theo cụng thức : H = 1 - ∑ Pi2
Trong đú Pi là tần suất lặp alen thứ i của mỗi chỉ thị phõn tử.
- Lập sơ đồ hỡnh cõy: Số liệu được đưa vào phần mềm chuyờn dụng
NTSYS pc version 2.0 để tỡm ra sự sai khỏc giữa cỏc giống đậu tương thụng
qua biểu đồ cõy ở hệ số tương đồng DICE [120]. Phõn tớch và đỏnh giỏ hệ số tương quan kiểu hỡnh theo phương phỏp phõn nhúm UPGMA.
2.2.4. Cỏc phương phỏp phõn tớch đa hỡnh protein
2.2.4.1 Tỏch chiết protein từ lỏ đậu tương
Tỏch chiết protein từ lỏ đậu tương để tiến hành điện di SDS-PAGE và
điện di 2-DE theo phương phỏp được mụ tả sau đõy [14]:
- Lỏ đậu tương của cỏc lụ đối chứng và xử lý gõy nhiễm bệnh sau khi nhiễm bệnh 6; 9 ngày được chọn để nghiờn cứu. Lỏ được làm sạch và cất giữ ở -80oC cho đến khi sử dụng.
- Nghiền mẫu lỏ trong nitơ lỏng.
- Làm đồng nhất trong 5 thể tớch 10% TCA trong acetone cú chứa 0,07%
(w/v) DTT ủ ở -20oC trong 2 giờ. Ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 30 phỳt ở 4oC. - Cặn ly tõm được rửa lại bằng acetone cú chứa 0,07% (w/v) DTT, 1mM PMSF, 2mM EDTA: làm đồng nhất trong dung dịch , ủ -20oC trong khoảng 20 phỳt. Ly tõm 13 000 vũng/phỳt, trong 30 phỳt ở 4oC (Mỗi lần ly tõm xong, đổ bỏ dung dịch bờn trờn, đảo đều cặn, khụng để vún cục, bổ sung dung dịch aceton và khuấy đều).
- Để bay hơi cho hết acetone ở nhiệt độ phũng sau khi đó làm tơi cặn,
khoảng 20-30 phỳt.
- Cặn được hũa vào dung dịch 0,1 Tris-HCl pH 7 để điện di SDS- PAGE. Để tiến hành điện di 2-DE, cặn được hũa vào dung dịch cú chứa: 9,0
M urea, 4% CHAPS, 100 mM DTT và 2% IPG buffer (1,6% Bioampholite 5/7 + 0,4 % Bioampholite3/10) theo tỉ lệ:cặn thu được từ 0,5g lỏ hũa vào 400 l dung dịch.
- Để ở nhiệt độ phũng 10 phỳt, sau đú siờu õm 2 lần, mỗi lần 20 phỳt
trong đỏ lạnh, mẫu được giữ ở -80oC.
2.2.4.2. Điện di SDS-PAGE
Điện di protein trờn gel SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là phương phỏp phõn tỏch protein hoặc polypeptide dựa vào tốc độ dịch chuyển khỏc nhau của chỳng trong điện trường.
Phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide cú chứa SDS được tiến
hành theo mụ tả trong cụng trỡnh của Trần Thị Phương Liờn và cộng sự
(1996) [11]. 15 g protein lỏ của cỏc giống đậu tương được lựa chọn phõn
tớch được hũa vào đệm điện di và biến tớnh ở 100oC trong 10 phỳt, sau đú mẫu được ly tõm 12.000 vũng/phỳt trong 10 phỳt để loại cặn.
Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide Cỏc thành phần Gel cụ đặc (4%) Gel phõn tỏch (12,5%) Nước cất (ml) 1,2 2,5 Tris HCL0,5M (ml) pH6,8 0,5 - Tris HCL1,5M (ml) pH8,8 - 2,25 Acrylamide/Bis (ml) 0,27 4,15 SDS10% (l) 20 90 APS 10% (l) 10 45 TEMED (l) 2 4,5
Điện di được tiến hành trờn mỏy điện di của hóng Bio-Rad với kớch thước gel 9x5,5cm; độ dày 0,75mm. Ở đõy chỳng tụi sử dụng gel cụ mẫu là 4% (Tris 0,125M; pH 6,8), gel tỏch mẫu là 12,5 % (Tris 0,375M, pH 8,8). Thành phần điện di được mụ tả như bảng 2.5
Điện di được tiến hành trong dung dịch đệm Tris - glyxin (Tris 0,025M; glyxin 0,193M) cú chứa SDS 1%, pH 8,3; hiệu điện thế 90V trong 4 giờ. Sau đú, bản gel được nhuộm bằng dung dịch Coomasie G-250 0,1% trong 30 phỳt rồi rửa bằng dung dịch tẩy màu (20% methanol, 7% axetic acid).
Bộ thang protein chuẩn (Fermentas): bao gồm - galactosidase (116,0 kDa), bovine serum albumin (66,2 kDa), ovalbumin (45,0 kDa), lactate dehydrogenase (35,0 kDa), restriction endonuclease Bsp98l (25,0 kDa), - lactoglobulin (18,4 kDa), lysozyme (14,4 kDa).
2.2.4.3. Điện di hai chiều – 2-DE
Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyờn lý phõn tỏch khỏc nhau. Theo chiều thứ nhất, cỏc phõn tử protein được phõn tỏch dựa theo điểm đẳng điện pI bởi nguyờn lý hội tụ theo điểm đẳng điện IEF (isoelectric focusing) trờn một thanh cố định gradient pH (vớ dụ dải pH 3-10). Chiều thứ