Đánh giá khả năng tái sinh invitro và biến nạp gen GFP vào lúa japonica thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

luận văn, tiến sĩ, thạc sĩ, báo cáo, khóa luận, đề tài

Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG NGHIệP Hà NộI ------------ ---------- PHùNG THị PHƯƠNG NHUNG ĐáNH GIá KHả NĂNG TáI SINH IN VITRO Và BIếN NạP GEN GFP VàO LúA JAPONICA THÔNG QUA VI KHUẩN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUậN VĂN THạC Sĩ NÔNG NGHIệP Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số : 60.62.01 Ngời hớng dẫn khoa học: GS.TS. Đỗ NĂNG VịNH Hà Nội - 2010 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip i LờI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và cha hề đợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đ đợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn đ đợc chỉ rõ nguồn gốc Tác giả Phùng Thị Phơng Nhung Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip ii LờI CảM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS. TS. Đỗ Năng Vịnh, Phó Viện trởng, Giám đốc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp, TS. Nguyễn Văn Khiêm, Nghiên cứu viên chính Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp đ tận tình chỉ dẫn và trực tiếp hớng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn này, đồng thời cũng là ngời nhiệt tình cổ vũ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác tại Viện Di truyền Nông nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong Bộ môn Di truyền giống đ tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lnh đạo Viện Đào tạo sau đại học, Trờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội đ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trờng. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, đồng nghiệp trong Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đ giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Phòng Thí nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đ nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống. Sự tin tởng và khích lệ từ gia đình đ giúp tôi vững vàng, toàn tâm, toàn ý cho công việc. Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi ngời ! Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2010 Tác giả Phùng Thị Phơng Nhung Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip iii MụC LụC LờI CAM ĐOAN i LờI CảM ƠN ii MụC LụC iii DANH MụC CáC CHữ VIếT TắT Và THUậT NGữ vi PHầN 1 Mở ĐầU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu, ý nghĩa nghiên cứu 2 1.2.1. Mục tiêu 2 1.2.2 ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 PHầN 2 TổNG QUAN TàI LIệU 4 2.1 Biến đổi khí hậu - thách thức lớn đối với nền sản xuất nông nghiệp 4 2.1.1 ảnh hởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp toàn cầu 4 2 1.2. Biến đổi khí hậu với sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam 5 2.2. Thực trạng về cây trồng biến đổi gen và các hớng chuyển gen chính 6 2.2.1 Thực trạng về cây trồng biến đổi gen và các hớng chuyển gen chính thế giới 7 2.2.2. Thực trạng về cây trồng biến đổi gen và các hớng chuyển gen chính ở Việt Nam 8 2.3. Cơ sở khoa học của xây dựng, đánh giá khả năng tái sinh 10 2.4.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn Agrobacterim tumefaciens 14 2.5 Khái quát về cây lúa 22 2.5.1 Nguồn gốc, vị trí và phân loại 22 2.5.2 Tình hình nghiên cứu tái sinh và chuyển gen vào lúa 23 2.5.2 Tình hình nghiên cứu tái sinh và chuyển gen vào lúa ở Việt Nam 26 2.6 Gen gfp và các nghiên cứu chuyển gen gfp vào thực vật 29 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip iv PHầN 3 VậT LIệU, NộI DUNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Error! Bookmark not defined. 3.1 Địa điểm, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 31 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 31 3.1.5 Phạm vi nghiên cứu 36 3.2 Nội dung nghiên cứu 37 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hởng của các các chất điều hoà sinh trởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở một số giống lúa thuộc loài phụ Japonica. 37 3.2.2. Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen thông qua Agrobacterium 37 3.3 Phơng pháp nghiên cứu 39 3.3.1.Bố trí thí nghiệm 39 3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi, phơng pháp thu thập và xử lý số liệu 39 3.3.3 Phơng pháp nuôi cấy mô và chuyển gen 40 3.3.4. Phơng pháp xác định biểu hiện của gen chuyển bằng kính hiển vi huỳnh quang 42 PHầN 4 KếT QUả Và THảO LUậN 47 4.1 Nghiên cứu ảnh hởng của chất điều hoà sinh trởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây 47 4.1.1 Đánh giá khả năng tạo mô sẹo của các giống lúa 47 4.1.1.1 ảnh hởng của tơng tác Giống x MTCL tới tỷ lệ phát sinh mô sẹo 48 4.1.1.2 ảnh hởng của tơng tác Giống x MTCL đến tỷ lệ mô sẹo phôi hóa 50 4.1.1.3 ảnh hởng của Giống tới thời gian xuất hiện và đặc điểm hình thái mô sẹo 53 4.1.1.4 ảnh hởng của tơng tác Giống x MTCL tới kích thớc mô sẹo phôi hóa 55 4.1.1.5 ảnh hởng của tơng tác Giống x MTCL tới khả năng tái sinh mô sẹo 58 4.1.2 Đánh giá khả năng tái sinh của các giống lúa 60 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip v 4.1.2.1 ảnh hởng của tơng tác MTCL x MTTS đến khả năng tái sinh của các giống nghiên cứu 60 4.1.2.3 ảnh hởng của tơng tác Giống x MTTS đến thời gian xuất hiện màu xanh 64 4.1.2.4 ảnh hởng của tơng tác Giống x MTTS đến số chồi trung bình/cụm mô sẹo tái sinh và tỷ lệ cây bạch tạng 66 4.2 Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen gfp và xác định sự hợp nhất của gen chuyển vào hệ gen lúa 69 4.2.1 Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen gfp 69 4.2.2 Xác định sự tồn tại của gen chuyển 75 4.2.2.1 Xác định sự tồn tại của gen chuyển bằng kính hiển vi huỳnh quang 75 4.2.2.2 Xác định sự tồn tại của gen chuyển bằng PCR 77 PHầN 5 KếT LUậN Và Đề NGHị 79 5.1 Kết luận 79 5.2 Đề nghị 80 TI LIệU THAM KHảO 81 PHụ LụC 89 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip vi DANH MụC CáC CHữ VIếT TắT Và THUậT NGữ B5 Môi trờng Gamborg (1963) BA 6-Benzyl Amino Purine Bp (base pair) Cặp bazơ nitơ Cs Cộng sự Kb Kilo base LB- Left Border Biên bên trái RB- Right Border Biên bên phải MS Môi trờng Murashige - Skoog (1962) N6 Môi trờng Chu et al (1975) -NAA - Napthalene axetic axit IAA 3- indole acetic acid NST Nhiễm Sắc Thể PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp T-DNA (Transfer DNA) Đoạn DNA chuyển Ti-plasmid (Tumor inducing plasmid) Plasmid gây khối u Vir (Virulence Region) Vùng gây độc 2,4 D 2,4-D-Dichlorophenoxi axetic axit MTCL Môi trờng tạo mô sẹo MTTS Môi trờng tái sinh PRM (Pre-regeneration medium) Môi trờng tiền tái sinh RM (Regeneration medium) Môi trờng tái sinh MS-R (MS- Regenration) Môi trờng tạo cây hoàn chỉnh CCM (Co-culture medium) Môi trờng đồng nuôi cấy Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip 1 PHầN 1: Mở ĐầU 1.1 Đặt vấn đề Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong số cây lơng thực quan trọng nhất nuôi sống hơn 2 tỷ ngời trên thế giới (Datta, 2004). Do đó, cây lúa đ và đang là đối tợng quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu. Cây lúa đợc trồng chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của các châu lục. Trong đó, khoảng 90% diện tích lúa trồng trên thế giới thuộc về châu á. Các giống japonica chiếm khoảng 11% sản lợng lúa thế giới (Nathan W. Childs and Linwood Hoffman1,1999). Hiện nay, do yêu cầu của thực tiễn, vấn đề chuyển gen vào cây lúa đ và đang đợc các nhà khoa học trên khắp thế giới đặc biệt quan tâm. Chuyển gen là một trong các chiến lợc quan trọng đợc sử dụng để đa gen phân lập từ cơ thể nào đó vào cây trồng trong cùng hoặc khác loài, tạo ra những cây biến đổi gen có tính trạng mong muốn. Chuyển gen vào lúa kết hợp với các phơng pháp chọn giống truyền thống có thể coi là một biện pháp tối u để tạo ra các giống lúa năng suất cao, chất lợng tốt, có khả năng kháng với sâu, bệnh, các tác nhân vô sinh trong thời gian ngắn, và có tính bền vững cao. Có 2 phơng pháp chuyển gen đang đợc áp dụng phổ biến hiện nay là dùng súng bắn gen và sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Tuy nhiên, chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium ngày càng đợc sử dụng nhiều hơn vì giá thành rẻ, thao tác đơn giản, gen chuyển ít bị bất hoạt do số bản gen chuyển hợp nhất vào hệ gen thấp. Hiệu quả biến nạp gen lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tố: phơng pháp biến nạp, giống lúa, mô sử dụng để biến nạp, thành phần môi trờng nuôi cấy, chất điều hòa sinh trởng và điều kiện tái sinh cây [30]. Nhiều nghiên cứu đ chỉ ra ở các giống lúa japonica hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây in vitro cao hơn ở các giống indica, do đó hiệu quả biến nạp cũng cao hơn ở các giống indica [19][39]. Cho đến nay, hầu hết các quy trình đợc công bố đều cho thấy để thu đợc cây lúa biến nạp thông thờng mất 3- 4 tháng từ nuôi cấy đầu tiên. Chỉ có nghiên cứu của Toki (1997) biến nạp thành công vào lúa Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip 2 japonica trong thời gian 2 tháng và Toki et al. (2006) thu đợc cây biến nạp sau một tháng [63]. Nh vậy, thời gian biến nạp vào các giống japonica có thể đợc rút ngắn hơn nhiều so với các giống indica. Theo tác giả Nguyễn Đình Giao, Nguyễn Thiện Huyên và cộng sự (2001) thì điều kiện vị trí địa lý của nớc ta chủ yếu thích hợp cho sự phát triển của các giống lúa thuộc loài phụ indica [7]. Tuy nhiên, trên thực tế có nhiều giống lúa japonica đ đợc trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi phía Bắc từ lâu đời và đợc coi nh các giống lúa đặc sản địa phơng nh lúa Tẻ Mộc Châu, Tẻ Yên Bái, Tẻ nơng Lào Cai . Mặt khác, trong 10 năm trở lại đây, nhiều giống lúa japonica đ đợc đa vào trồng tại Việt Nam, gạo của các giống lúa này đợc coi nh một loại gạo đặc sản, chất lợng cao, đợc bao tiêu xuất khẩu đến các thị trờng khó tính với giá cao làm tăng hiệu quả kinh tế cho ngời nông dân trồng lúa [75]. Nh vậy, bên cạnh việc tiến hành nghiên cứu chuyển gen vào lúa indica thì ở nớc ta việc nghiên cứu chuyển gen vào lúa japonica cũng là một hớng đi cần đợc quan tâm đúng mức. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Đánh giá khả năng tái sinh in vitro và biến nạp gen GFP vào lúa Japonica thông qua vi khuẩn Agrobacterium. 1.2 Mục tiêu, ý nghĩa nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu - Chọn đợc môi trờng thích hợp để tỷ lệ tạo mô sẹo, và tái sinh cây cao cho 1 số giống lúa japonica. - Chọn đợc giống lúa japonica có hiệu quả tái sinh cao - Tạo đợc cây lúa japonica biến nạp mang gen gfp với hiệu quả cao, trong thời gian ngắn, làm cở sở để biến nạp những gen có ý nghĩa kinh tế khác vào lúa bằng vi khuẩn Agrobacterium. 1.2.2 ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.2.2.1 ý nghĩa khoa học Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s nụng nghip 3 - Nghiên cứu rút ngắn thời gian biến nạp gen vào lúa, nâng cao hiệu quả chuyển gen. - Bớc đầu xây dựng quy trình chuyển gen vào lúa japonica 1.2.2.2 ý nghĩa thực tiễn - Đánh giá đợc khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của một số giống lúa japonica, lựa chọn giống thích hợp cho chuyển gen. - Phục vụ cho chiến lợc chuyển gen vào lúa, tạo giống lúa japonica kháng sâu, kháng hạn, chịu rét, chịu nóng, chịu mặn . . cứu tái sinh và chuyển gen vào lúa 23 2.5.2 Tình hình nghiên cứu tái sinh và chuyển gen vào lúa ở Vi t Nam 26 2.6 Gen gfp và các nghiên cứu chuyển gen gfp. hành nghiên cứu đề tài: Đánh giá khả năng tái sinh in vitro và biến nạp gen GFP vào lúa Japonica thông qua vi khuẩn Agrobacterium. 1.2 Mục tiêu, ý nghĩa