PHÂN TÍCH PHÂN tử và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG sâu đục THÂN (SCIRPOPHAGA INCERTULAS) của các DÒNG lúa c71 CHUYỂN GEN cry1ac ở mức độ PHÒNG THÍ NGHIỆM và NHÀ lưới

Luận văn

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn ạc khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 th sỹ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I ĐỖ XUÂN ĐỒNG PHÂN TÍCH PHÂN TỬ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG SÂU ĐỤC THÂN (SCIRPOPHAGA INCERTULAS) CỦA CÁC DÒNG LÚA C71 CHUYỂN GEN cry1Ac Ở MỨC ĐỘ PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ NHÀ LƯỚI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 60 62 05 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. LÊ TRẦN BÌNH À Ộ Lời cam đoan Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2007 Học viên Đỗ Xuân Đồ ng Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lê Trần Bình - Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Trưởng Phòng Công nghệ tế bào thực vật, người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn . Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến PGS.TSKH. Lê Thị Muội, TS. Chu Hoàng Hà và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh họ c đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, ủng hộ và giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích c ủa các cô chú, anh chị Phòng Công nghệ tế bào thực vật và sự động viên khích lệ của bạn đồng nghiệp trong và ngoài Viện. Cuối cùng, tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn bên tôi, quan tâm dành cho tôi những tình cảm sâu nặng, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2007 Học viên Đỗ Xuân Đồng Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 3 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 4 MỤC LỤC 1. MỞ ĐẦU 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu chung về cây lúa 3 2.2. Các gen có hoạt tính gây độc của Bt 4 2.2.1. Sơ lược về Bt 4 2.2.2. Phân loại gen mã hóa độc tố của Bt 4 2.3. Cơ chế diệt côn trùng của protein độc 6 2.4. Sơ lược về công nghệ biến đổi di truyền 7 2.5. Tác hại của sâu bệnh lên sản xuất lúa gạo 10 2.6. Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng 10 2.7. Các phương pháp phân tích cây chuyển gen 11 2.7.1. Phương pháp thử tính kháng kháng sinh 12 2.7.2. Phương pháp sinh học phân tử 12 2.7.3. Phương pháp sử dụng các phép thử sinh học 18 2.7.4. Một số thành tựu về tạo cây lúa chuyển gen 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 3.1. Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.1. Thực vật 21 3.1.2. Sâu đục thân 21 3.1.3. Hóa chất và thiết bị 21 3.2. Phương pháp nghiên cứu 22 3.2.1. Tách chiết ADN và kiểm tra cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 23 3.2.2. Phương pháp tạp plasmit tái tổ hợp mang gen cry1A(c) 25 3.2.3. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5  25 3.2.4. Tách chiết plasmit 25 3.2.5. Phương pháp xử lý ADN plasmit 27 3.2.6. Phương pháp xác định trình tự nucleotit 27 3.2.7. Phương pháp xử lý trình tự gen thu được 28 3.2.8. Kỹ thuật lai Western blotting 29 3.2.9. Thử khả năng diệt sâu non của dòng lúa chuyển gen ở giai đoạn đẻ nhánh 30 3.2.10. Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân 30 3.2.11. Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân các dòng lúa chuyển gen trên đồng ruộng 31 3.3. Địa điểm nghiên cứu 31 1. MỞ ĐẦU Lúa là cây lương thực quan trọng và là nguồn lương thực cung cấp cho hơn một phần hai dân số trên thế giới. Nơi tiêu thụ tập trung chủ yếu ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ La Tinh. Diện tích gieo trồng trên đất nông nghiệp hàng năm vào khoảng 11% trên thế giới [40]. Ở Việt Nam lúa được trồng phổ biến từ rất sớm và là nguồn lương thực và thu nhập chủ yếu của người nông dân. Tuy rằng hiện nay chúng ta đang là nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới [21] nhưng năng suất thu hoạch còn chưa cao, đời sống người dân trồng lúa vẫn gặp nhiều khó khăn về kinh tế. Một trong những nguyên nhân chủ yếu làm giảm sản lượng lúa là sự bất lợi về địa hình và bất lợi về điều kiện tự nhiên. Hơn nữa sâu bệnh, đặc biệt sâu đục thân là nguyên nhân làm gi ảm năng suất từ 5-30% tổng sản lượng thu hoạch lúa ở hầu hết các nước châu Á [7] [18]. Để khắc phục thiệt hại do sâu bệnh gây ra đã có nhiều phương pháp được áp dụng, ví dụ biện pháp canh tác, cơ giới vật lý, hoá học, trong đó biện pháp phun thuốc hoá học hiện đang được sử dụng phổ biến rộng rãi hơn. Tuy nhiên sử dụng thuốc hoá học lâu dài gây ra ô nhiễm môi trường, độc h ại cho người sử dụng và làm suy giảm đa dạng sinh học trong hệ sinh thái nông nghiệp [12]. Sự phát triển của kỹ thuật gen đã khắc phục được những nhược điểm trên, nhiều giống cây trồng cải biến di truyền mang gen có ý nghĩa thực tiễn cao đã và đang được phát triển: cây bông Bt kháng sâu; lúa Bt kháng sâu; ngô Bt kháng sâu; cải canola kháng thuốc diệt cỏ; đu đủ kháng virus PRSV và một số gen liên quan đến ch ất lượng dầu thực vật, hàm lượng tiền vitamin, hàm lượng axít amin, chín chậm, sản xuất protein làm vaccine, làm thuốc chuyển vào cây trồng v.v mang lại hiệu quả to lớn trong nông nghiệp [65] [47] [19] [31] [54] [15] [60]. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 5 Vì vậy, nghiên cứu để nâng cao chất lượng và ổn định sản lượng lúa bằng cách tạo ra các giống lúa có khả năng kháng được sâu bệnh và tác động của ngoại cảnh bất lợi là một trong những định hướng quan trọng trong công cuộc tạo giống mới ở Việt Nam [4]. Các kỹ thuật sinh học truyền thống như kỹ thuật lai chọn giống đã được con người sử dụ ng hàng ngàn năm qua để tạo ra các cây trồng có đặc tính riêng biệt. Tuy nhiên, những kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian và có thể phải trải qua nhiều thế hệ mới có được những tính trạng mong muốn và loại bỏ những đặc tính không cần thiết. Công nghệ sinh học sử dụng các kỹ thuật di truyền để biến đổi cây trồng bằng cách đưa những gen có giá trị vào bộ gen của cây nhận (th ậm chí kể cả gen của các loài vốn không có quan hệ họ hàng) và nhanh chóng tạo ra các cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Organisms) mang những đặc tính mong muốn. Đề tài nghiên cứu cấp nhà nước “Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi” do PGS. TS. Lê Trần Bình làm chủ nhiệm đã tạo ra các dòng lúa chuyển gen C71 mang gen cry1A(c) (kháng sâu đục thân) [3]. Tuy nhiên những nghiên cứu sâu hơn trên các dòng lúa chuyể n gen này như xác định số bản copy của gen chuyển, mức độ biểu hiện độc tố của gen chuyển ở trong cây và sự sai khác về kiểu hình là vấn đề cần được nghiên cứu và phân tích để nhanh chóng chọn được những dòng lúa chuyển gen có tính kháng cao và ổn định. Với mục tiêu như vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân tích phân tử và đánh giá khả năng kháng sâu đục thân (Scirpophaga incertulas) của các dòng lúa C71 chuyển gen cry1A(c) ở m ức độ phòng thí nghiệm và nhà lưới”. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 6 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây lúa Cây lúa thuộc họ Hòa thảo, thân bụi, lá mềm. Cây lúa trồng thuộc chi oryza với nhiều loài khác nhau. Trong số 23 loài đã được phân loại thì chỉ có 2 loài là O. glaberrima Sreud. và O. sativa L. được trồng cấy. Loài O. glaberrima Sreud. được trồng chủ yếu ở một số nước miền Tây châu Phi. Loài O. sativa L. được trồng khắp thế giới (phần lớn tập trung ở châu Á) và được chia thành 3 loài phụ: indica, japonica và javanica. Lúa indica được thuần hoá đầu tiên ở vùng Đông ấn, từ đó phân tán đến các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, ngày nay lúa indica chiếm 80% các giống lúa trồng trên thế giới; lúa japonica bắt nguồn từ vùng nam Trung Quốc, được trồng chủ yếu ở các nước ôn đới và cận ôn đới còn lúa javanica chỉ được trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia [36] [37]. Lúa O. sativa L. có số nhiễm sắc thể đơn bội là n = 12. Đa số các loài lúa dạ i và lúa trồng hiện nay có bộ gen ở trạng thái lưỡng bội và là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo [37]. Theo Khush, 1997 và Ikeda, 2001 trên thế giới có khoảng 120 loại lúa được trồng. Từ năm 1960, Viện Nghiên cứu lúa quốc tế đã nghiên cứu, cải tiến những giống lúa tốt, có hạt dẻo ngon và việc phổ biến những giống lúa đó chiếm 70% diện tích trồng lúa trên thế giới. Lúa là mộ t trong những loại cây lương thực chính, chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên trái đất và cung cấp thức ăn cho hơn một nửa dân số thế giới. Theo thống kê, trên thế giới có 15 nước trồng hơn một triệu hecta lúa, trong đó có tới 13 nước ở Châu Á. Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu. Bănglađét, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 7 Inđônêsia và Thái Lan, mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mỹ La Tinh. Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng Việt Nam, nhưng sản lượng trồng lúa lại thấp hơn Việt Nam hai đến ba lần [48]. Việt Nam, với 80% dân số sống bằng nghề nông nghiệp, trong sản xuất nông nghiệp, lúa không những cung cấp lương thực cho toàn bộ dân số trong n ước mà còn mang lại hiệu quả kinh tế cao do xuất khẩu gạo ra thị trường quốc tế. Theo thống kê, năng suất lúa nước ta đạt 34568,8 nghìn tấn năm 2003, đạt 36148,9 nghìn tấn năm 2004 và năm 2005 đạt 35832,9 nghìn tấn [11]. 2.2. Các gen có hoạt tính gây độc của Bt 2.2.1. Sơ lược về Bt Bt (Bacillus thuringiensis) là trực khuẩn sinh bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc, gram (+). Bt có khả năng sản sinh protein tinh thể độc ở dạng ngoại bào (, , -exotoxin) và nội bào (-endotoxin). Trong đó - endotoxin là một họ protein tinh thể độc chính gây độc hệ tiêu hoá của côn trùng. Trong các loại độc tố này thì -endotoxin, -exotoxin là các độc tố được nghiên cứu nhiều nhất về mặt phân tử và phổ tác dụng với côn trùng, chúng tác dụng hầu hết lên các loại côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Hai cánh (Diptera), Cánh cứng (Coleoptera) và tuyến trùng (Nematoda) [26]. 2.2.2. Phân loại gen mã hoá độc tố của Bt 2.2.2.1. Các gen n ội độc tố cry Có rất nhiều loại gen mã hóa cho các protein có hoạt tính diệt côn trùng của Bt (gọi tắt là gen độc) chủ yếu là các gen cry, người ta đã phân tích trình Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 8 tự của 50 gen mã hóa cho protein tinh thể độc. Một số giống nhau hoàn toàn, một số khác gần giống nhau đại diện cho cùng một gen hoặc nhiều gen hoặc là biến dạng từ một gen [26]. Năm 1986, Whiteley đã xây dựng một hệ thống phân loại các gen cry dựa trên cơ sở khác nhau về trọng lượng protein, phổ tác dụng với côn trùng được chia thành năm nhóm chính: Bảng 1.1. Bảng phân nhóm gen cry Nhóm gen Lớp gen Mã hóa cho protein độc (kDa) Phổ tác dụng với côn trùng Nhóm I CryI (A, B, C) 130 - 160 Lepidoptera Nhóm II CryII (A, B, C) 67 - 71 Lepidoptera, Diptera Nhóm III CryIII (A, B, C, D, E) 73 Diptera Nhóm IV CryIV (A, B, C, D) 135, 128, 78, 72 Diptera Nhóm V Đang được nghiên cứu sâu về cấu trúc và chức năng 81, 2 Lepidoptera, Coleoptera 1.2.2.2. Các gen ngoại độc tố khác Gen cytA: Là gen tổng hợp nên protein độc với tế bào động vật có xương sống và không xương sống, hồng cầu động vật có vú. Gen này mã hoá protein có trọng lượng khoảng 27kDa (trình tự không đồng nhất với bất kì gen cry nào) và hoạt tính chống côn trùng của protein này vẫn chưa được xác định rõ. Nhưng theo một số nghiên cứu cho thấy protein này kết hợp vói một số protein do gen cryI mã hoá tạo ra phức hợp tinh th ể hình trứng có tác dụng độc với côn trùng [52]. Nhóm gen vip (Vegetative Insecticidal Protein): Ngoài các gen cry tạo độc tố trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, còn có nhiều hướng nghiên cứu mới về gen vip. Gen vip mã hoá các protein trong pha sinh Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 9 dưỡng trong chu trình phát triển của vi khuẩn Bt và Bc có hoạt lực diệt côn trùng có phổ tác dụng mạnh hơn các protein độc do gen cry mã hóa [38]. Một số gen vip (vip1, vip2, vip3) có phổ diệt côn trùng rất rộng và mạnh như protein vip3 có kích thước khoảng 88,6 kDa và có hoạt tính kháng sâu xám (Agrotis ypsilon) cao gấp 260 lần so với protein cry1A và có phổ hoạt động rộng kháng một số loài côn trùng Bộ Cánh vảy như: sâu xám, sâu cắn chồi thuốc lá (Heliothis virescens) và sâu xanh h ại ngô (Helicoverpa zea) [58] và protein vip được xử lý mất đoạn đầu C và N để mở rộng phổ hoạt động như diệt sâu đục củ khoai tây (Phthrimea opercullelar), sâu đục thân ngô (Chilo partellus), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu tơ hại cải bắp (Plutella xylostella) [51]. Về cơ chế tác dụng độc của các loại protein vip cũng được nghiên cứu và bước đầu cho thấy giống như phương thức tác dụng của tinh thể độc - endotoxins. Tuy nhiên, protein vip có hoạt lực sau 48-72 giờ sau khi ăn protein độc, trong khi đó đối với protein cry là 16-24 giờ [61]. Gần đây, đã có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động, hoạt lực diệt côn trùng, phổ tác dụng về gen vip để tiến tới phân lập và thiếp kế tạo vector chuyển gen vào thực vật. Theo các nhà khoa học việc tìm ra các gen vip có hoạt tính diệt côn trùng mạnh và ứng dụng để t ạo ra cây chuyển gen có tính kháng sâu và phổ tác động rộng hơn là vấn đề đang quan tâm của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [6] [51] [52] [58] [61]. 2.3. Cơ chế diệt côn trùng của protein độc Protein độc của Bt có nhiều loại khác nhau nhưng chúng có cơ chế tác động gây độc chung với côn trùng gồm 3 bước chính [6] [16] [26]: i. Sau khi nuốt phải tinh thể độc (tiền độc tố), dưới tác động của môi trường có độ pH>10 và sự hoạt độ ng của enzym protease ở ruột giữa của ấu trùng Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 10 . tài Phân tích phân tử và đánh giá khả năng kháng sâu đục thân (Scirpophaga incertulas) của các dòng lúa C71 chuyển gen cry1A(c) ở m ức độ phòng thí nghiệm. đẻ nhánh 30 3.2.10. Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân 30 3.2.11. Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân các dòng lúa chuyển gen trên đồng ruộng 31 3.3.