Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương (glycine max) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ Đỗ Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ Đỗ Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng TS. Lê Hồng Điệp Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Đồng – người thầy kiên nhẫn hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực luận văn. Tôi xin gửi tới TS. Lê Hồng Điệp lời cảm ơn chân thành, người hỗ trợ giúp đỡ để hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc giúp đỡ nhiệt tình, ý kiến đóng góp quý báu dẫn tận tình TS. Nguyễn Anh Vũ suốt trình thực hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Kỹ sư Lương Thanh Quang tập thể cán Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt để thực đề tài cách suôn sẻ thuận lợi. Cuối cùng, xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân bạn bè lời cảm ơn thân thương - người sát cánh, quan tâm dành cho tình cảm chân thành suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn luôn bên cạnh ủng hộ sống. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên cao học Đỗ Thị Như Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU . CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 1.1. Đậu tương tầm quan trọng đậu tương . 1.1.1. Giới thiệu chung đặc điểm sinh học đậu tương 1.1.2. Vai trò đậu tương đời sống người 1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương Thế giới Việt Nam 1.2. Cơ chế chống chịu yếu tố phi sinh học thực vật . 10 1.3. Đặc tính chịu hạn số gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tương 12 1.3.1. Đặc tính chịu hạn đậu tương 12 1.3.2. Các gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tương . 13 1.4. Gen GmGLP1 14 1.5. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 15 1.5.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15 1.5.2. Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen . 18 1.5.3. Phương pháp chuyển gen xung điện . 18 1.5.4. Phương pháp chuyển gen qua ống phấn 19 1.6. Nguồn gốc đặc tính sinh học giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 . 20 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 22 2.1. Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.2. Vật liệu nghiên cứu . 22 2.2.1. Vật liệu . 22 2.2.2. Hóa chất môi trường . 23 2.2.3. Thiết bị dụng cụ . 23 2.2.4. Trình tự mồi enzyme cắt giới hạn sử dụng nghiên cứu 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu . 24 2.3.1. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 24 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu . 26 2.3.3. Phương pháp nhân trình tự ADN kỹ thuật PCR . 27 2.3.4. Phương pháp gel tinh sản phẩm PCR 28 2.3.5. Phương pháp lai Southern blot 29 2.4. Các tiêu chí đánh giá . 31 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 32 3.1. Kết đánh giá khả tái sinh hoàn chỉnh giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 32 3.1.1. Đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu . 32 3.1.2. Khả tái sinh tạo đa chồi 33 3.1.3. Khả tái sinh rễ tạo hoàn chỉnh 35 3.2.2. Kiểm tra có mặt gen cần chuyển GmGLP1 kỹ thuật PCR 38 3.3. Phân tích chuyển gen hệ T1 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 49 KẾT LUẬN . 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 50 PHỤ LỤC 60 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương Thế giới năm gần . Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương nước đứng đầu Thế giới . năm gần Bảng 3. Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam năm gần . Bảng 4. Trình tự cặp mồi sử dụng thí nghiệm 24 Bảng5. Thành phần phản ứng PCR . 28 Bảng 6. Chu trình nhiệt phản ứng PCR . 28 Bảng 7. Thành phần phản ứng cắt giới hạn enzyme Bam HI . 30 Bảng8. Kết khảo sát tỷ lệ mầm giống đậu tương . 33 ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84 33 Bảng 9. Khả phát sinh chồi giống đậu tương nghiên cứu sau 14 ngày . 34 Bảng 10. Khả sống sót sau chọn lọc khả kéo dài chồi giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 35 Bảng 11. Sự phát sinh rễ tái sinh hoàn chỉnh . 36 Bảng 12. Cây tái sinh hoàn chỉnh sống sót phát triển môi trường . 36 Bảng 13. Tỷ lệ sống sót sau phun basta . 38 Bảng 14. Thống kê số T0 sinh trưởng phát triển tốt sau phun basta dương tính với PCR 41 Bảng 15. Phân tích T1 chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 15:1 . 43 Bảng 16. Kết phân tích chuyển gen T1 . 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cơ chế chống chịu thực vật với stress 12 Hình 2. Hạt đậu tương giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 sử dụng thí nghiệm 22 Hình 3. Cấu trúc vector biểu gen GmGLP1 vector pZY101Asc 23 Hình 4. Quy trình chuyển gen đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 37 Hình 5. Cây phản ứng với Basta sau ngày phun 37 Hình 6a. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số T0 giống ĐT22 . 38 Hình 6b. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số T0 giống đậu tương ĐT26 DT84 39 Hình 6. Ảnh điện di DNA tổng số đậu tương chuyển gen giống ĐT22 hệ T0 39 Hình 7a. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 đậu tương ĐT22 chuyển gen hệ T0 . 40 Hình 7b. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 đậu tương ĐT26 DT84 chuyển gen hệ T0 . 40 Hình 7. Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 đậu tương ĐT22, ĐT26 DT84 chuyển gen hệ T0 40 Hình 8. Cây đậu tương chuyển gen dương tính với PCR giống ĐT22 hệ T0 . 42 Hình 9. Hạt đậu tương chuyển gen giống ĐT22 hệ T0 42 Hình 10. Phản ứng chuyển gen hệ T1 với Basta . 43 Hình 11. DNA tổng số T1sống sót sau phun Basta 44 Hình 12. PCR kiểm tra có mặt gen GmGLP1 T1 45 Hình 13. Kết lai Southern Blot . 46 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADN Axit deoxyribonucleic AS Acetosyringone BAP – benzylaminopurine Bar Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase Bp Base pair CCM Cocultivation medium – môi trường đồng nuôi cấy Cs Cộng dNTP Deoxynucleoside triphosphate ĐT22 Giống đậu tương ĐT22 ĐT26 Giống đậu tương ĐT26 DT84 Giống đậu tương DT84 ĐVN9 Giống đậu tương ĐVN9 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic GA3 Gibberelic acid GM Germination medium – môi trường nảy mầm hạt GmGLP1 Glycine max Germin – like protein IBA Indole-3-butyric acid Kb Kilo base OD Optical density PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trường rễ SDS Sodium dodecysulfat SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi T0 Cây chuyển gen T1 Cây chuyển gen thệ thứ TAE Tris – acetate – EDTA v/p vòng/phút YEP Yeast extract peptone MỞ ĐẦU Đậu tương (Glycine max(L.) Merr ) [1] hay gọi đậu nành công nghiệp ngắn ngày có hiệu kinh tế giá trị dinh dưỡng cao. Đậu tương trồng lấy hạt, cho dầu quan trọng bậc giới, đứng hàng thứ sau lúa mì, lúa nước ngô. Do có khả thích ứng rộng nên đậu tương trồng khắp châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ - chiếm tỷ lệ 76,96%, tiếp đến Châu Á – 18,54% [85]. Ở Việt Nam, diện tích gieo trồng đậu tương mở rộng, tính đến tháng 11/2013 diện tích gieo trồng đậu tương khoảng 117,8 triệu ha, sản lượng đạt khoảng 168,3 nghìn [8]. Tuy nhiên, giới phải đối mặt với tượng biến đổi khí hậu, nhiệt năm tăng cao dẫn đến tình trạng hạn hán. Mức độ hạn hán thường khó dự đoán phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tần suất phân bố lượng mưa, mức độ nước bay hơi, khả giữ nước đất [76, 29]. Theo Boyer (1982) [13], hạn hán yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn đến suất trồng toàn giới, đồng thời hạn hán có khả tác động lên nhiều giai đoạn phát triển khác trồng nói chung đậu tương nói riêng [29]. Bởi ấm lên khí hậu toàn cầu, nhu cầu thực phẩm tăng ngày cao áp lực gia tăng dân số, tần suất ảnh hưởng hạn hán trở nên rõ rệt [68, 63, 22]. Trước thực trạng đó, việc nghiên cứu phát triển giống trồng có khả thích ứng, chống chịu tốt điều kiện hạn hán mục tiêu hàng đầu nhà khoa học giới nhà khoa học Việt Nam. Các nghiên cứu trước chế phân tử tính trạng chịu hạn thực vật kiểm soát nhiều gen chia làm hai nhóm nhóm gen điều hòa nhóm gen chức [38, 61, 11]. Trong nhóm gen chức họ gen mã hóa cho germin-like proteins (GLPs) đóng vai trò thiết yếu tiềm chịu hạn cây. Ở đậu tương, họ gen GmGLP biết đến gồm 21 gen [45], GLPs biết đến với khả SOD, POD hoạt tính enzyme chống oxi hóa. Nhờ đóng vai trò quan trọng việc thể khả chống chịu trồng với điều kiện bất lợi. Ở đậu tương, gen mã hóa cho protein đặt tên Glycine max GmGLP1 – Soybean Oxalate oxidase. Việc nghiên cứu sử dụng hệ thống gen chống chịu với điều kiện bất lợi việc chọn tạo giống trồng biến đổi gen có khả kháng hạn tâm điểm hàng loạt phòng thí nghiệm toàn giới. Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả tiếp nhận gen GmGLP1 vào đậu tương (Glycine max) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen GmGLP1 vào giống đậu tương Việt Nam: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84. Yêu cầu nghiên cứu Biến nạp thành công gen GmGLP1 vào bốn giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84. Phân tích chuyển gen hệ T0 T1. Q2.1/5 Q3.4 Q3.4/1 < 3,841 > 3,841 + - + - +: dương tính; - : âm tính Từ kết phân tích đậu tương ĐT22 chuyển gen GmGLP1 hệ T1trong bảng 16 rút số nhận xét sau: (i): Từ kết phân tích tỷ lệ kháng mẫn với basta, kết PCR kết Southern blot kết luận T1 dòng chuyển gen Q1.5 dòng Q1.7 hình thành tương ứng từ T0 có copy gen GmGLP1 chèn vào hệ gen. Vị trí băng Southern blot dòng số dòng số trùng lặp kích thước, cho thấy hai dòng thực chất xuất phát từ nguồn gốc. Tiếp tục phân tích hai dòng chuyển gen Q1.5 dòng Q1.7 hệ để tìm dòng thuần. (ii): Dòng chuyển gen Q2.1, kết phân tích thống kê cho thấy rằngcác T1 hình thành từ T0 mang copy gen GmGLP1 chèn vào hệ gen. Kết PCR cho thấy T1 kháng với Basta kiểm tra mang gen GmGLP1 ngoại sinh. Tuy nhiên kết Southern blot không cho băng, khả chuẩn bị mẫu chưa đủ tốt. Để khẳng định xác số lượng copy gen GmGLP1 hệ gen cần tiếp tục tiến hành phân tích tương tự hệ tiếp theo. (iii): Đối với dòng chuyển gen Q3.4, kết PCR băng nhạt kết Southern blot âm tính đồng thời số lượng mẫu ban đầu ít, sống sau phun basta thấp. Loại bỏ dòng số 4, không tiếp tục phân tích hệ tiếp theo. Như vậy, dòng đậu tương ĐT22 chuyển gen Q1.5, Q1.7 Q2.1 tiếp tục phân tích phân ly hệ để tìm dòng mang gen GmGLP1. 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Giống đậu tương ĐT22 có khả tái sinh cụm chồi (51,07 %) cao có tiềm tiếp nhận gen GmGLP1 tốt giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 sử dụng nghiên cứu. 2. Trong giống đậu tương nghiên cứu: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 tạo chuyển gen mang gen GmGLP1 giống đậu tương: ĐT22, ĐT26 DT84. Dựa vào kết phân tích PCR chuyển gen hệ T0, thu tần suất biến nạp giống đậu tương sau ĐT22: 0,93%; ĐT26: 0,27% DT84: 0,13%. 3. Phân tích đánh giá ổn định di truyền giống đậu tương ĐT22 hệ T1 phương pháp phun Basta phương pháp phân tích Southern blot. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu tìm dòng giống đậu tương ĐT22 mang gen GmGLP1. 2. Đánh giá khả kháng hạn ổn định di truyền dòng đậu tương ĐT22 mang gen GmGLP1. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình Đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 2. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hương, Nguyễn Hữu Kiên (2012)“Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, (39), tr. 119 – 124. 3. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013), “Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả kháng hạn kháng thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22”,Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, 11, tr. – 9. 4. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa nhân gen dehydrin số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc Việt Nam", Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu khoa học sống, Đại học Y Hà Nội, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 5. Trần Thị Cúc Hòa (2007) “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương trồng Việt Nam”, Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn, 18, tr. – 14. 6. Nguyễn Huy Hoàng (1992) “Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương nhập nội miền Bắc Việt Nam”, Luận án phó tiến sỹ, Hà Nội. 7. Chu Hoàng Mậu (2001) “Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để rao dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc việt nam” Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội. 8. Tổng cục thống kê (2013), Niên giám thống kê 2012, NXB Thống kê, Hà Nội. 50 Tài liệu tiếng Anh 9. Akwatulira F., Gwali S., Okullo J.B.L., Ssegawa P., Tumwebaze S. B., Mbwambo J. R., Muchugi A. (2001), “Influence of rooting media and indole-3butyric acid (IBA) concentration on rooting and shoot formation of Warburgia ugandensis stem cuttings”, African Journal of Plant Science, 5(8), pp. 421-429. 10. Banerjee J, Maiti M. K. (2010), “Functional role of rice germin-like protein1 in regulation of plant height and disease resistance”,Biochemical and Biophysical Research Communications, 394(1), pp. 178-183. 11. Bartels D., Sunkar R. (2005), “Drought and Salt Tolerance in Plants”,Critical Reviews in Plant Sciences,24(1), pp. 23-58. 12. Birch R.G. (1997), “ Plant Transformation: Problems and Strategies for Practical Application”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 48, pp. 297-326. 13. Boyer J.S. (1982), “Plant productivity and environment”, Science, 218(4571), pp. 443–448. 14. Chaves M.M., Costa J.M., Saibo N.J.M. (2011), “Recent Advances in Photosynthesis Under Drought and Salinity”, Advances in Botanical Research, 57, pp. 50-83. 15. Chee, P. P., Fober K. A., Slightom J. L. (1989), “Transformation of Soybean (Glycine max)by Infecting Germinating Seeds with Agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiology,91(3), pp. 1212-1218. 16. Chen M., Wang Q. Y., Cheng X. G., Xu Z. S., Li L. C., Ye X. G., Xia L. Q., Ma Y. Z. (2007), “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants”, Biochemical and Biophysical Research Communiction,353(2), pp.299-305. 17. Chen W. S., Chiu C. C., Liu H. Y., Lee T. L., Cheng J. T., Lin C. C., Wu Y. J., Chang H. Y. (1998), “Gen transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon”,Biochemistry and Molecular Biology International,46(6), pp. 12011209. 51 18. Chowrira, G. M., Akella V., Lurquin, P.F. (1995), “Electroporation-mediated gen transfer into intact nodal meristems in planta. Genrating transgenic plants without in vitro tissue culture”,Molecular Biotechnology,3(1), pp. 17-23. 19. Christou P., Murphy J. E., Swain W. F. (1987), “Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed callus”,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84(12), pp. 3962-3966. 20. Chumakov M.I., Rozhok N. A., Velikov V.A., Tyrnov V.S., Volokhina I.V. (2006), “Agrobacterium-mediated in Planta Transformation of Maize via Pistil Filaments”,Russian Journal of Gentics,42(8), pp. 893-897. 21. Cleene M. D., Ley J. D. (1976), “The host range of crown gall”,Botanical Review, 42(4), pp. 389-466. 22. Cook E.R., Seager R., Cane M.A., Stahle D.W. (2007), “North American drought: reconstructions, causes, and consequences”,Earth-Science Reviews, 81, pp. 93-134. 23. de Ronde J. A., Laurie R. N., Caetano T., Grayling M. M., Kerepesi I.(2004), “Comparative study between transgenic and non-transgenic soybean lines proved transgenic lines to be more drought tolerant”, Euphytica, 138, pp.123-132. 24. Delauney A. J.,Verma D. P.(1990), “A soybean gen encoding delta 1pyrroline-5-carboxylate reductase was isolated by functional complementation in Escherichia coli and is found to be osmoregulated”,Molecular &Genral Gentics,221(3), pp. 299-305. 25. Delzer B. W., Somer D.A., Orf J.H. (1990), “Agrobacterium tumefaciens susceptibility and plant regenration of 10 soybean genotypes in maturity group 00 to II”, Crop Science, 30(2), pp. 320-322. 26. Di R., Purcell V., Collins G.B., Ghabrial S.A. (1996), “Production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gen”. Plant Cell Reports, 15, pp. 746-750. 52 27. Doyle J.J., Doyle J.L. (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues”, Phytochemical Bulletin,19, pp. 11-15. 28. Duan X. L., Chen S. B. (1985), “Variation occurring by introduction of the exogenous DNA into rice”. Scientia Sinica. Series B, Chemical, biological, agricultural, medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan, 18, pp. 6-10. 29. Farooq M., Wahid A., Kobayashi N., Fujita D., Basra S.M.A. (2009),“Plant drought stress: effects, mechanisms anh management”,Agronomy for Sustainable Development,29(1), pp. 185-212. 30. Fromm M., Taylor L.P., Walbot V. (1985), “Expression of gen transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation”,Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,82(17), pp. 5824-5828. 31. Hadi M. Z., McMullen M.D., Finer, J.J. (1996), “Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment”,Plant Cell Reports,15, pp. 500-505. 32. Hansen G., Das A., Chilton M.D. (1994), “Constitutive expression of the virulence gens improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium”, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,91(16), pp. 7603-7607. 33. Hood E. E., Helmer G. L., Fraley R. T., Chilton M. D. (1986), “The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciensA281 is encoded in a region of pTiBo542 outsite of T-DNA”, Journal of Bacteriology, 168(3), pp.1291-1301. 34. Hooykaas P.J. J., Schilperoort R.A. (1992), “Agrobacterium and plant gentic engineering”, Plant Molecular Biology,19, pp.15-38. 35. Hooykaas P.J.J., Beijersbergen A. G. M. (1994), “The virulence system of Agrobacterium tumefaciens”,Annual Reviewof Phytopathology, 32, pp. 157-179. 36. Hu C. Y., Wang L. (1999), “In planta soybean transformation technologies developed in China: Procedure, comfirmation and field performance”, In Vitro Cell &Developmental Biology,35(5), pp. 417-420. 53 37. Hymowitz T., Newell C. A. (1981), “Taxonomy of the Genus Glycine Domestication and Uses of Soybeans”, Economic Botany, 35(3), pp.272-288. 38. Ingram J., Bartels D., (1996),“The molecular basis of dehydration tolerance in plants”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,47, pp. 377-403. 39. Jorgensen R.A., Cluster P.D., English J., Que Q., Napoli C.A (1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences”, Plant Molecular Biology, 31(5), pp. 957-973. 40. Ke Y., Han G., He H., Li J. (2009), “Differential regulation of proteins and phosphoproteins in rice under drought stress.” Biochemical and biophysical research communications, 379 (1), pp. 133 – 138. 41. Knecht K., Seyffarth M., Desel C., Thurau T., Sherameti I., Lou B., Oelmullier R., Cal D. (2010), “Expression of BvGLP-1 Encoding a Germin-Like Protein from Sugar Beet in Arabidopsis thaliana Leads to Resistance Against Phytopathogenic Fungi”,Molecular Plant-Microbe interaction, 23(4), pp. 446-457. 42. Lata C., Prasad M. (2011), “Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants”,Journal of Experimental Botany, 62(14), pp. 4731-4748. 43. Li Z., Nelson R.L., Widholm J.M., Bent A. (2002), “Soybean Transformation via the Pollen Tube Pathway”, Soybean Gentics Newsletter, 29, pp. 1-11. 44. Liu DP, Yuan Y, and Sun H (1992), “A study of exogenous DNA introduction into cultivated soybean. In: Zhou GY, Chen SB, and Hu JQ (eds), Advances in Molecular Breeding Research of Agriculture”, China Agri Sci Tech Press, pp. 134 – 140. 45. Lu M, Han Y., Gao J., Wang X., Li W. (2010), “Identification and analysis of the germin-like gen family in soybean”,BMC genomics, 11, pp. 620. 54 46. McCabe D. E., Swain W.F., Martinell B. J., Christou, P. (1988), “Stable transformation of soybean (Glycine max Merrill) by particle acceleration”, Bio/Technology, 6,pp. 923-926. 47. Mello-Farias, P. C., Chaves, A. L. S. (2008), “Advances in Agrobacterium– mediated plant transformation with Emphasis on soybean”, Sci Agric (piracicaba, Braz), 65(1), pp. 95-106. 48. Meurer C. A., Dinkins R. D., Collins G. B. (1998), “Factors affecting soybean cotyledonary node transformation”, Plant Cell Reports, 18(3-4), pp. 180186. 49. Nguyen HT, Babu RCBlum, A. (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular gentics considerations:, Crop Sci, 37, 1426 – 1434. 50. Ni W. C., Zhang Z. L., Guo S. D. (1998), “Development of transgenic insectresistant cotton plants”,Scientia Sinica. Series B, Chemical, biological, agricultural, medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan,31, pp. 8-13. 51. Olhoft P. M., Flagel L. E., Donovan C. M., Somers D. A.(2003),“Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”,Planta, 216(5), pp. 723-735. 52. Olhoft P. M., Lin K., Galbraith J., Nielsen N. C., Somers D. A. (2001), “The role of thiol compounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Reports,20, 731-737. 53. Olhoft P. M., Somers D. A. (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-nodes cells”, Plant Cell Reports, 20(8), 706-711. 54. Parrott W. A., Hoffman L. M., Hildebrand D.F., Williams E. G., Collin G.B. (1989), “Recovery of primary transformants of soybean”, Plant Cell Reports, 7(8), pp. 201-204. 55. Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K. B. and Wang K. (2004) “Assessment of conditions affecting Agrobacterium – mediated soybean 55 transformation using the cotyledonary node explant” , Euphytica, 136, pp: 167 – 169. 56. Paz, M. M., Guo H., Zhang Z., Banerjee Z., Wang A. K., Kan (2004),“Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”,Euphytica 136, pp. 167-179. 57. Paz, M. M., Martinez, J. C., Kalvig A. B., Fonger T. M., Wang K. (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Reports, 25(3), pp. 206-213. 58. PazM. M., Martinez J. C., Kalviq A. B., Fonger T. M., Wang K. (2006), “Improve cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Reports, 25(3), pp. 206-213. 59. Pederson, H.C., Christiansen, J., Wyndaele, R. (1983), “Induction and in vitro culture of soybean crown gall tumors”,Plant Cell Reports, 2(24), pp. 201-204. 60. Perl A., Lotan O., Abu-Abied M., Holland D. (1996), “Establishment of an Agrobacterium–mediated transformation system for grape (Vitis vinifera L.): the role of antioxidants during grape–Agrobacterium interactions”. Nature Biotechnology,14(5), pp. 624-628. 61. Ramanjulu S., Bartels D., (2002),“Drought- and desiccation-induced modulation of gen expression in plants”, Plant cell& Environment, 25(2), pp.141151. 62. Rietz S., Bernsdorff F. E. M., Cai D. (2012),“Members of the germin-like protein family in Brassica napus are candidates for the initiation of an oxidative burst that impedes pathogensis of Sclerotinia sclerotiorum”, Journal of experimental botany, 63(15), pp. 5507-5519. 63. Salinger M.J., Sivakumar M.V.K., Motha R. (2005),“Reducing vulnerability of agriculture and forestry to climate variability and change: workshop summary and recommendations”, Climatic Change 70, pp. 341-362. 56 64. Sambrook, J., Russell, D. (2001) Molecular Cloning, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 65. Santarem E.A., Pelissier B., Fimer, J.J. (1997), “Effect of explant orientation, pH, solidifying agent and wounding on initiation of soybean somatic embryos”, Invitro Cellular and Development Biology – Plant, 33(1), pp. 13-19. 66. Schmidt M. A., Lafayette P. R., Artelt B. A., Parrott W. A. (2008), “A comparison of strategies for transformation with multiple gens via microprojectilemediated bombardment”,In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44, pp. 162-168. 67. Shou H., Palmer R. G., Wang K. (2002), “Irreproducibility of the Soybean Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure”, Plant Molecular Biology Reporter,20, pp. 325-334. 68. Somerville C., Briscoe J., (2001),“Gentic Engineering and Water”, Science, 292 (5525), pp. 2217. 69. Southern E.M. (1975),“Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, Journal of Molecular Biology, 98(3), pp. 503-517. 70. Stachel S.E., Messens E., Montagu M.V., Zambryski P. (1985), “Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells which activate the T-DNA transfer process in Agrobacterium tumefaciens”, Nature, 318, pp. 624-629. 71. Tinland B., Hohn B., (1995), “Recombination between prokaryotic and eukaryotic DNA: integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant genome”, Gentic Engineering, 17, pp. 209-229. 72. Tran Thi Cuc Hoa (2008),“Efficiency of developing transgenic soybean from the varieties MTĐ 176, HL 202, Maverick and Williams 82 by cotyledonary-node method using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation”, Science & Technology Journal of Agriculture and Rural Development, 1, pp.14-19. 57 73. Trejgell A., Chernetskyy M., Podlasiak J., Tretyn A. (2013), “An efficient system for regenrating Taraxacum pieninicum Pawl. from seedling explants”,Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica, 55(1), pp. 73-79. 74. Trick H.N., Finer J.J. (1997), “SAAT: sonication-assisted Agrobacteriummediated transformation”, Transgenic Research, pp. 329-337. 75. Versulues P.E., Agarwal M., Katiyar-Agarwal S., Zhu J., Zhu J.K. (2006) “Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status”,The Plant Journal for cell and molecular biology, ;45(4), pp. 523-539. 76. Wery J., Silim S.N., Knights E.J., Malhotra R.S., CousinR.(1994),:Screening techniques and sources of tolerance to extremes of moisture and air temperature in cool season food legumes”,Euphytica,73(1-2), pp. 73-83. 77. Xue R., Xie H., Zhang B. (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnology Letters,28, pp. 1551-1557. 78. Yong Z., Bao-Yu Y., Shi-Yun C. (2006), “Inheritance Analysis of HerbicideResistant Transgenic Soybean Lines”, Acta Gentica Sinica, 33(12), pp. 1105-1111. 79. Yu H.X., Liu J.J., Feng Z.L., Dong J.D. (1999), “Study on Introduction of Vermin-Resistance Gen (CpTI) into Wheat through Pollen-Tube Pathway Method”, Shandong Agricultural Sciences,1990-01. 80. Zambryski, P. (1998), “Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to plant cells”, Annual Review Gentics, 22, pp. 1-30. 81. Zhang et al (2004), An improved Agrobacterium-mediated soybeantransformation procedure. Improved from, Plant Cell Reports 22:478-482. 82. Zhang Z., Xing A., Staswick P., Clemente T.E. (1999),“The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean”,Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56, pp. 37-46. 83. Zhen J.Z., Wu Y.X., Wang D.J., Zhang J., Ma Z.R., Zhou Z.Y. (1998), “The exploration of the mechanism and gentic performance of the progenies gained from pollen-tube pathway transformation”, Sci Bull 43, pp. 561-566. 58 84. Zhou G., Weng J., Zhen Y., Huang J., Qian S., Liu G. (1983), “Introduction of exogenous DNA into cotton embryos”, Methods in enzymology, 101, pp. 433481. Trang web 85. FAOSTAT (2012), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org/faostat-gateway/go/to/home/E. 86. United States Department http://www.usda.gov/wps/portal/usda/usdahome 59 of Agriculture (2014), PHỤ LỤC Phụ lục 1:Thành phần môi trường GM STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít B5 major salt 10x 100 ml B5 minor salt 100x 10 ml Ferrous-NaEDTA 100x 10 ml Glucozo 2% 20 gam Bổ sung PhytagelTM gam B5 vitamin 500x 2ml Chuẩn pH = 5.8 với KOH 1M, khử trùng 20 phút Phụ lục 2: Thành phần môi trường YEP STT Thành phần Hàm lượng cho lít Bacto – pepton 10 gam Yeast – extract gam NaCl gam Agar (đối với môi trường đặc) 12 gam Chuẩn pH = với NaCl 1M, khử trùng 20 phút Phụ lục 3: Thành phần môi trường đồng nuôi cấy CCM STT 10 11 12 13 14 Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít B5 major salt 10X 10 ml B5 minor salt 100X ml Ferrous-NaEDTA 100X ml Glucozo 3% 30 gam MES 20mM 3,9 gam Acetosyringone 40 mg/ml ml B5 vitamin 500X ml GA3 mg/ml 0,25 ml BAP 16,7 mg/ml 0,1 ml L-cysteine 25 mg/ml 16 ml DTT 154 mg/ml ml Na-thiosulfate 158 mg/ml ml Agar washed 0,5% gam Chuẩn pH = 5,4 với KOH 5M, khử trùng 20 phút 60 Phụ lục 4: Thành phần môi trường SIM STT 10 11 12 Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít B5 major salt 10X 100 ml B5 minor salt 100X 10 ml Ferrous-NaEDTA 100X 10 ml Glucozo 3% 30 gam MES mM 0,6 gam B5 vitamin 500X ml BAP 16,7 mg/ml 0,1 ml Cefotaxime 200 mg/ml ml Vancomycin mg/ml 10 ml Glufosinate 10 mg/l ml TM Phytagel gam Chuẩn pH = 5,7 dùng KOH 5M, khử trùng 20 phút Phụ lục 5: Thành phần môi trường SEM STT 10 11 12 13 Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít MS major salt 10X 100 ml MS minor salt 100X 10 ml Ferrous-NaEDTA 100X 10 ml Glucozo 3% 30 gam MES mM 0,6 gam B5 vitamin 500 X ml Asp/Glu 25 mg/ml ml IAA mg/ml 0,1 ml GA3 mg/ml 0,5 ml Cefotaxime 20 mg/ml ml Glufosinate mg/l 0,3 ml TM Phytagel gam Chuẩn pH = 5,7 dùng KOH 5M, khử trùng 20 phút Phụ lục 6: Thành phần môi trường RM STT Thành phần MS major salt MS minor salt Ferrous-NaEDTA Glucozo MES B5 vitamin Nồng độ 10X 100X 100X 2% mM 500X 61 Hàm lượng lít 100 ml 10 ml 10 ml 20 gam 0,6 gam ml Asp/Glu 25 mg/ml ml Cefotaxime 200 mg/ml 0,5 ml Vancomycin mg/ml 10 ml PhytagelTM gam Chuẩn pH = 5,6 dùng KOH 1M, khử trùng 20 phút 10 11 Phụ lục 7: Thành phần CTAB STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng 100ml CTAB gam Tris-HCl 8,0 1M 10 ml NaCl 5M 14 ml EDTA 8,0 0,5 M ml BME (mecraptoethanol) 14 M 1,5 ml Chuẩn thể tích V=100ml nước cất, khử trùng 20 phút Phụ lục 8: Hóa chất làm Southern Blot Phụ lục 8.1. Thành phần SSC 20x STT Thành phần Natri clorua Natri citrate Nồng độ 3M 0,3 M Hàm lượng lít 175,32 gram 88,23 gram Phụ lục 8.2. Thành phần dung dịch Neutralisation STT Thành phần Tris – HCl NaCl Nồng độ Hàm lượng lít 0,5 M 78,8 gram 3M 175,32 gram Chuẩn pH = 7,5 sử dụng NaOH Phụ lục 8.3. Thành phần dung dịch Denaturalize STT Thành phần NaCl NaOH Nồng độ 1,5 M 0,5 M Hàm lượng lít 87,66 gram 20 gram Phụ lục 8.4. Thành phần Acid Maleic STT Thành phần Maleic acid NaCl Nồng độ Hàm lượng lít 0,1 M 11,6 gram 0,15 M 8,77 gram Chuẩn pH = 7,5 sử dụng NaOH 62 Phụ lục 8.5. Thành phần Detection STT Thành phần Tris – HCl NaCl Nồng độ Hàm lượng lít 0,1 M 15,76 gram 0,1 M 5,84 gram Chuẩn pH = 9,5 sử dụng NaOH 63 [...]... chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens và phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen 1.5.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phương pháp này sử dụng vi khuẩn A tumefaciensnhư một vector sinh học để chuyển một đoạn ADN của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả tạo được cây biến đổi gen [34], [80] Vi khuẩn A tumefaciens xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vị trí bị tổn thương của cây. .. max GmGLP1- Soybean Oxalate oxidase ( Gen ID: |EU916269.1|) 1.5 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã được nghiên cứu và ứng dụng vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens, chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng vi tiêm … Nhưng hai phương pháp chuyển gen. .. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Vi t Nam Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây đậu tương, nên cây đậu tương được xem là một trong những loại cây trồng chiến lược trên toàn thế giới, đứng ở vị trí thứ 4 chỉ sau cây lúa, cây ngô và cây lúa mì Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện môi trường khác nhau nên cây đậu tương được trồng... dùng sản xuất thức ăn cho gia súc [1] Tiếp đến, cây đậu tương đóng vai trò trong vi c cải tạo đất Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng vụ sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng đồng thời giảm chi phí cho vi c bón nitơ Thân, lá đậu tương có thể dùng để bón ruộng thay phân... giống đậu tương có cơ chế trốn thoát điều kiện hạn hán là những giống đậu tương ngắn ngày và chín rất sớm (xem mục 1.1.1) Đối với giống đậu tương có cơ chế tránh hạn sẽ có 12 các cơ chế để duy trì lượng nước trong cây trong suốt giai đoạn hạn thông qua vi c tăng khả năng hấp thụ nước từ rễ và giảm sự thoát hơi nước ở những bộ phận khác của cây Các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, cây sẽ có khả. ..CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đậu tương và tầm quan trọng của cây đậu tương 1.1.1 Giới thiệu chung về đặc điểm sinh học của cây đậu tương Đậu tương hay còn gọi là đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max(L.) Merr theo khóa phân loại của Hymowitz, và Newel (1981) [37].Căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, đậu tương được xếp vào Bộ (Fabales), Họ... có khả năng tự mình chống chịu lại với điều kiện hạn hán Do đó vi c tìm ra những gen có khả năng kháng hạn, phân lập và chuyển vào cây trồng quan tâm đang được tiến hành ở hầu hết các phòng thí nghiệm về thực vật Cho tới nay, có rất nhiều công bố liên quan tới vi c phân lập tách chiết cũng như chuyển thành công đoạn gen kháng hạn vào cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng Gen GmDREB2 và gen P5CR... nhân của vi c diện tích đất gieo trồng đậu tương ngày càng bị thu hẹp, tuy nhiên, kết hợp với tình hình đánh giá sản lượng đậu tương của các Quốc gia trên thế giới có thể ban đầu kết luận rằng hạn hán cũng đang góp phần ảnh hưởng tới năng suất và diện tích gieo trồng đậu tương Trước những thực trạng ở cả Vi t Nam và trên thế giới, vi c nghiên cứu tìm ra gen có khả năng kháng hạn và chuyển vào cây trồng... Banerjee và cs [10] sử dụng chủng vi khuẩn A.tumefacien LBA4404 mang đoạn gen OsGLP1 chuyển nạp gen vào cây thuốc lá bằng phương pháp lây nhiễm qua lá để xác định ảnh hưởng của gen OsGLP1 tới chiều cao cây và khả năng kháng sâu bệnh Cũng năm 2010, Katrin Knecht và cs [41] sử dụng vi khuẩn A.tumefacien chủng GV3101 mang gen BvGLP1 chuyển nạp vào Arabidopsis thaliana thông qua phương pháp tổn thương lá,... tính sau đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ba cây chuyển gen có chứa gen zein kích thước 15kD được hình thành Tuy nhiên, những cây chuyển gen này đều bị khảm và khi phân tích các cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa gen mã hóa zein 15kD Gần đây, một phương pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã được phát triển để biến nạp vi khuẩn A tumefaciens mang gen vào thẳng tế bào mô đích Kỹ . Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương (Glycine max) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen GmGLP1 vào 4 giống đậu tương. NHIÊN  Đỗ Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực. NHIÊN  Đỗ Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC