Rễ là bộ phận quan trọng của cây. Rễ đóng vai trò chính trong quá trình hút chất dinh dưỡng và muối khoáng nuôi dưỡng cây. Vì vậy, số lượng rễ và chất lượng rễ quyết định tới sự sống còn của mẫu khi chuyển mẫu ra ngoài môi trường nuôi cấy. Do đó, việc kích thích mô nuôi cấy hình thành rễ là một bước hết sức quan trọng, số lượng rễ càng nhiều và chất lượng rễ tốt, mô nuôi cấy càng có tỷ lệ sống sót cao hơn ở môi trường ngoài. Indol butyric acid (IBA) thuộc nhóm hoocmon thực vật auxin có tác dụng kích thích sự hình thành rễ. Nồng độ IBA khác nhau ảnh
hưởng khác nhau tới số lượng và chiều dài của rễ [9]. Theo nghiên cứu năm 2012 của Nguyễn Văn Đồng và cs [2], nồng độ IBA 1mg/ml phù hợp với giống ĐT22 cho bộ rễ to khỏe , nhiều rễ chính và thứ cấp, rễ mọc xung quanh gốc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng IBA nồng độ 1 mg/ml để kích thích ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh cho cả 4 giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 được sử dụng trong nghiên cứu. Kết quả phát sinh rễ tái tạo cây hoàn chỉnh được trình bày trong như trong bảng 12.
Bảng 11. Sự phát sinh rễ tái sinh cây hoàn chỉnh
Tên giống ĐT22 ĐVN9 ĐT26 DT84
Thời gian ra rễ 7 ngày 7 ngày 10 ngày 14-17 ngày
Số lượng rễ 10-15 10-15 5-7 3-5 Chất lượng rễ Rễ trắng, mảnh, nhiều rễ thứ cấp Rễ trắng, nhiều rễ thứ cấp Rễ nâu, ít rễ thứ cấp Rễ nâu sậm, không có rễ thứ cấp quanh gốc
Bảng 12. Cây tái sinh hoàn chỉnh sống sót và phát triển ở môi trường ngoài
TT Tên giống Tổng số chồi
(chồi)
Số chồi tạo rễ (chồi)
Số cây sống sót ở môi trường ngoài (cây)
1 ĐT22 15 15 15
2 ĐVN9 10 10 7
3 ĐT26 10 10 8
Hình 4. Quy trình chuyển gen đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (a): Giai đoạn nảy mầm hạt; (b): giai đoạn đồng nuôi cấy trên CCM; (c): giai đoạn cảm ứng tạo chồi trên SIM; (d): giai đoạn trên SIM có bổ sung chất chọn lọc glufosinate; (e): kéo dài chồi trên SEM; (f): giai đoạn tạo rễ trong RM; (g): giai đoạn cây con ở môi trường ngoài
3.2. Kết quả phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T0
3.2.1. Chọn lọc cây sau chuyển gen bằng Basta
Để giảm nhẹ những phần việc phân tích cây sau chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử, những cây sống sót ngoài đất sẽ trải qua thêm một lần chọn lọc
gen chỉ thị Bar. Cây sau khi được tái sinh hoàn chỉnh, sống sót và phát triển tốt ở
môi trường ngoài được tiến hành chọn lọc bằng cách sử dụng thuốc diệt cỏ Basta với nồng độ 100 mg/ml, phun lặp 2 lần mỗi lần cách nhau 3 ngày, sau 5 ngày nhận thấy cây kháng và cây chết biểu hiện rõ ràng như hình 5.
Hình 5. Cây phản ứng với Basta sau 5 ngày phun
Trong các nghiên cứu từ trước tới nay, có hai phương pháp chọn lọc cây T0
đang được sử dụng: (i): chọn lọc bằng cách bôi glufosinate lên lá; (ii): chọn lọc sử dụng basta để phun hoặc bôi lá. Thực chất hai phương pháp này là như nhau, basta là một loại thuốc diệt cỏ mà có chứa 2% thành phần là glufosinate. Điều này có nghĩa, dùng phương pháp bôi lá bằng glufosinate hay chọn lọc bằng basta đều sử
dụng glufosinate để chọn lọc những cây mang và biểu hiện gen Bar. Năm 2004, Paz
và cs [56] sử dụng nồng độ glufosinate 150 mg/l để bôi lá cây T0. Năm 2013, Nguyễn Văn Đồng và cs [3] sử dụng phương pháp phun basta để chọn lọc cây sau chuyển gen với nồng độ basta 3ppm. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã thử nồng
độ basta , ở nồng độ 100 mg/l cho biểu hiện cây kháng rõ rệt nhất. Kết quả phun basta được trình bày trong bảng 13.
Bảng 13. Tỷ lệ cây sống sót sau khi phun basta
Tên giống Số cây con ban
đầu (cây) Số cây con sống sót (cây) Tỷ lệ cây sống sót (%) ĐT22 15 8 53,33 ĐVN9 7 0 0 ĐT26 8 6 75 DT84 2 2 100