và DT84
Giống đậu tương ĐT22
Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Hoàng Minh Tâm, Quách Ngọc Truyền, Nguyễn Thị mỹ Hạnh, Nguyễn Thị Chúc, Lê Tuấn phong, Nguyễn Đạt Thuần. Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
Giống ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai (DT95 x ĐT12) và được Hội đồng Khoa học Công nghệ (Bộ NN&PTNT) công nhận là giống mới. Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày 19/01/2006.
Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng trung bình từ 85-90 ngày. Hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đâm, quả chín có màu nâu. Khối lượng 1000 hạt khoảng 155-160g. Có khả năng kháng bệnh phấn trắng. Năng suất từ 18-27 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. ĐT22 thích hợp gieo trồng trong cả 3 vụ trong năm.
Giống đậu tương ĐVN9
Giống đậu tương ĐVN9 do nhóm các nhà khoa học của Viện nghiên cứu Ngô lai tạo và chọn lọc từ tổ hợp lai ĐT12 x VN205
Những đặc tính chính: ĐVN9 là giống đậu tương chín sớm: vụ xuân khoảng 88-90 ngày, vụ hè: từ 75 – 77 ngày, vụ đông: 78-80 ngày. Dạng cây đứng, lá hình trứng nhọn, hoa tím, vỏ quả chín màu vàng rơm, hạt vàng, rốn hạt nâu nhạt. Chiều cao cây trung bình 27,3 - 56,5 cm; phân cành mạnh khoảng 1,7 – 3,1 cành cấp 1 trên một cây; sai quả khoảng 22,9 – 49,5 quả trên một cây. Khối lượng 1000 hạt khoảng 148,5 – 171,8 gam. Năng suất trung bình ở vụ xuân đạt 17 tạ/ha, vụ hè đạt 21 tạ/ha.
Giống đậu tương ĐT26
Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Nguyễn Thị Loan, Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Văn Thắng, Trần Thanh Bình và CTV. Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
Giống đậu tương ĐT26 được chọn từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12. Được công nhận cho sản xuất thử theo Quyết định số 111/QĐ-TT-CCN ngày 3 tháng 6 năm 2008.
Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trường trung bình từ 90-95 ngày. Chiều cao cây 45-60 cm, hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chính có màu nâu, phân cành khá nhiều từ 2-3 cành/cây, có 30-35 quả chắc/cây, tỷ lệ quả 3 hạt 20-40%. Khối lượng 1000 hạt 180-190g. Năng suất 21-29 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. Giống thích hợp trong vụ xuân và vụ đông.
Giống đậu tương DT84
Giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo bằng phương pháp xử lý đột biến dòng 33-3 (tổ hợp lai ĐT80 x ĐH4) được công nhận giống Quốc gia năm 1995 và đưa vào khảo nghiệm, sản xuất từ năm 1995.
Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng 85 – 90 ngày. Chiều cao cây từ 50 – 60 cm, cây sinh trưởng khỏe, ít phân cành. Hạt to, màu vàng sáng, hoa màu tím, khối lượng 1000 hạt 160 – 180 hạt, năng suất đạt 15 – 20 tạ/ha. Giống được trồng cả 3 vụ: xuân, hè, đông , thích hợp trồng thâm canh.
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 7/2012 đến tháng 12/2014.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu Vật liệu thực vật Vật liệu thực vật
Thí nghiệm sử dụng 4 giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9, ĐT26, DT84 được cung cấp bởi Trung tâm Đậu đỗ và phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp.
Hình 2. Hạt đậu tương của 4 giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 được sử dụng trong thí nghiệm
Vật liệu vi khuẩn
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens – EHA101 [33] chứa vector biểu hiện pZY101Asc mang đoạn gen GmGLP1, gen kháng kháng sinh Streptomycin và
Spectinomycin làm chỉ thị chọn lọc vi khuẩn, gen kháng Glufosinate làm chỉ thị chọn lọc thực vật được cung cấp bởi phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp.
Hình 3. Cấu trúc casstte biểu hiện gen GmGLP1 trong vector pZY101Asc 2.2.2. Hóa chất và môi trường
Hóa chất
Các loại hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm nuôi cấy mô: NaClO, AS, 2,4-D, IAA, BAP, Glufosinate, Cefotamine, Streptinomycin, Spectinomycin.
Các loại hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm phân tích cây sau chuyển gen: thuốc diệt cỏ basta (có chứa 2% glufosinate trong thành phần), NaCl, EDTA, Tris – HCl, 2-mecaptonethanol, chloroform, phenylanine, phenol, isoamyl alcohol, ethanol, bột agarose, bộ kit tinh sạch ADN Quick gel extraction, bộ kit DIG – High Prime ADN labeling.
Tất cả các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm được sử dụng của hãng Sigma, Fermentas, Merk và một số hãng khác.
Môi trường
Các loại môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật bao gồm: GM, CCM, SIM, SEM, RM.
Môi trường sử dụng nuôi khuẩn trong thí nghiệm: YEP đặc và YEP lỏng. Thành phần và hàm lượng các chất trong môi trường đã sử dụng trong thí nghiệm được trình bày trong phần phụ lục.
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Box cấy vô trùng, tủ nuôi khuẩn, máy lắc, máy đo OD, máy ly tâm, máy đo nanodrop, máy PCR, tủ lạnh các loại: 4oC, -20oC, -80oC; bể ổn nhiệt; máy làm khô; bể điện di.
Dụng cụ: Chày cối sứ; ống eppendorf các loại: 2ml, 1.5ml và 0.5ml, pipetman, đầu côn các loại, lưỡi dao các loại sử dụng trong nuôi cấy mô.
2.2.4. Trình tự mồi và enzyme cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu
Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu (bảng 4)
Bảng 4. Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm
Tên mồi Trình tự mồi 5’ – 3’
Nhiệt độ gắn mồi Kích thước GmGLP1-35S-Forward GTGACAGATAGCTGGGCAATG 57oC ~ 881bp GmGLP1 - Reverse TTATTTCTTAGGAGCAAGCCTAGAC 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Phương pháp tạo vật liệu vô trùng và phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương được tiến hành theo quy trình của Olhofl et al. (2003) [51] và Zhang (2004) [81] có cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Tạo vật liệu vô trùng
Hạt đậu tương được đặt trong đĩa petri 15x100 mm thành một lớp đơn và đưa vào hộp hút khô có chứa ca thủy tinh đựng hỗn hợp 100ml Clorox + 4ml HCl đặc. Hộp hút khô được đóng kín và hạt giữ trong vòng 16h để khử trùng.
Nảy mầm hạt
Hạt đậu tương sau khi khử trùng được cấy trên đĩa môi trường GM. Gói đĩa chứa hạt thành từng chồng 5 đĩa. Các chồng hạt được nuôi trong phòng nuôi cấy trong điều kiện: nhiệt độ 24oC, 18h sáng, 6h tối, với cường độ ánh sáng 100-150E trong vòng 5 ngày.
Chuẩn bị khuẩn biến nạp
Chủng khuẩn A.tumefaciens – EHA101 chứa vector pZY101Asc – mang gen
Bar chọn lọc glufosinate và gen cần chuyển GmGLP1 – được lưu giữ trong tủ -
80oC. Trước khi sử dụng khuẩn cho biến nạp thực vật, khuẩn được nuôi phục hồi trên môi trường YEP đặc có bổ sung 4 loại kháng sinh chọn lọc vi khuẩn: 50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin, và 25mg/ml Kanamycin. Nuôi khuẩn sau 3 ngày trên môi trường YEP đặc, thu khuẩn lạc và nuôi lắc trong 5ml môi trường YEP lỏng được bổ sung 4 loại kháng sinh chọn lọc (50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin, và 25mg/ml
Kanamycin).Nuôi lắc trong 8 giờ, dịch khuẩn thu được được chuyển sang bình chứa 150ml YEP lỏng. Tiếp tục nuôi lắc khuẩn 16h ở 28oC , V = 250 v/p. Sử dụng máy đo OD ở bước sóng 650nm để kiểm tra mật độ tế bào có mặt trong dịch khuẩn nuôi cấy. OD650 khuẩn đạt giá trị nằm trong khoảng 1,0 – 1,2 được sử dụng để lây nhiễm cho thực vật. Ly tâm dịch khuẩn để thu cặn khuẩn ở 3500 v/p, 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hòa tan lại cặn khuẩn sử dụng dung dịch CCM lỏng sao cho OD650 sau khi hòa tan đạt giá trị0,6. Dung dịch CCM lỏng có giá trị OD650 đạt 0,6 được gọi là dung dịch đồng nuôi cấy.
Đồng nuôi cấy
Nảy mầm hạt sau 5 ngày, loại bỏ phần trụ dưới lá mầm, tách đôi hai lá mầm ( ½ lá mầm sau đây sẽ được gọi là mẫu nuôi cấy) bằng dao nuôi cấy sao cho mỗi lá mầm chứa ½ chồi đỉnh. Loại bỏ chồi đỉnh trên mẫu nuôi cấy, gây tổn thương mẫu nuôi cấy tại vị trí nốt lá mầm khoảng 5 – 7 đường, mỗi đường sâu khoảng 0,5mm và dài khoảng 3 – 4 mm. Mẫu nuôi cấy đã gây tổn thương được ngâm trong dung dịch
đồng nuôi cấy khoảng 30 phút để lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens. Chuyển
mẫu nuôi cấy sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường CCM đặc). Nuôi mẫu trên môi trường CCM đặc trong 5 ngày ở điều kiện nhiệt độ 24oC, điều kiện ánh sáng: 18h sáng và 6h tối, cường độ ánh sáng 100 – 150E.
Kích thích ra chồi
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy trên môi trường CCM đặc, loại bỏ khuẩn bám trên bề mặt mẫu nuôi cấy bằngmôi trường SIM lỏng trước khi chuyển sang môi trường SIM đặc. Giữ mẫu nuôi cấy trong môi trường SIM đặc trong 14 ngày nhằm kích thích vị trí gây tổn thương tạo cụm đa chồi. Chuyển mẫu nuôi cấy đã phát sinh được cụm đa chồi sang môi trường SIM đặc có chứa chất chọn lọc thực vật glufosinate nồng độ 10mg/l, nuôi mẫu nuôi cấy trong 14 ngày.
Kéo dài chồi
Những mẫu nuôi cấy sống sót qua chọn lọc được loại bỏ những chồi chết trên cụm chồi đồng thời được cắt loại bỏ phần trụ lá mầm. Chuyển tiếp mẫu nuôi cấy sang môi trường SEM chứa chất chọn lọc glufosinate nồng độ 5mg/ml giảm ½
so với môi trường SIM đặc. Cứ sau 14 ngày tiến hành chuyển những mẫu sống sót xanh sang môi trường SEM mới. Chú ý loại bỏ những chồi chết trong mỗi lần chuyển mẫu. Mẫu đýợc chuyển cho tới khi cụm đa chồi bật lęn đýợc chồi.
Kích thích ra rễ
Những chồi dài 3 – 4 cm trong cụm đa chồi, được cắt khỏi cụm đa chồi để kích thích ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh. Chồi sau khi được cắt khỏi cụm đa chồi được ngâm khoảng 2 – 5 phút trong dung dịch IBA 1 mg/ml. Chồi được nuôi trên môi trường RM cho tới khi chồi phát sinh rễ.Chuyển cây con sau khi tái sinh hoàn chỉnh ( có thân, lá và rễ đầy đủ) ra đất.
Chọn lọc cây con ra đất bằng Basta
Tùy thuộc vào tốc độ thích ứng của phát triển của cây con ngoài môi trường mà chọn thời gian phun basta cho hợp lý. Thương cây con được sử dụng trong thí nghiệm phun basta là những cây phát sinh khoảng 3 – 5 lá thật. Nồng độ basta sử dụng trong thí nghiệm chọn lọc là 100mg/l. Cây con sau khi phun basta được che chắn để giảm tác động của môi trường ( mưa, nắng, gió, sương…) tới kết quả phun basta. Thí nghiệm phun basta được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày. Những cây con sống sót sau 3 lần phun basta, được tiếp tục chăm sóc làm vật liệu cho những phân tích đánh giá tiếp theo.
Chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A.
tumefaciens như được trình bày ở trên trong các thí nghiệm với 4 giống đậu tương:
ĐT22, ĐT26, DT84, và ĐVN9. Với từng giống, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá
Quy trình tách chiết ADN được tiến hành theo quy trình tách chiết ADN của Doyle et al. (1987) [27] được cải tiến cho phù hợp với điều kiện và hóa chất của phòng thí nghiệm.
Bước 1: Thu mẫu lá từ những cây con sống sót sau 3 lần phun basta. Giữ mẫu lá thu được trong nito lỏng, nghiền mẫu lá ngay sau khi thu mẫu.
Bước 2: Nghiền nhỏ 1 gam mẫu lá bằng chày cối sứ trong nito lỏng và chuyển vào ống eppendoft 2ml.
Bước 3: Bổ sung 1,5ml dung dịch đệm CTAB (xem phụ lục) mỗi ống eppendoft. Lắc đều mẫu và ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở 650C, t = 60 phút.
Bước 4: Ly tâm hỗn hợp dịch chiết mẫu lá V = 13000 v/p, t = 10 phút, ở 4oC. Bước 5: Thu dịch nổi, chuyển sang ống eppendoft 2ml. Bổ sung dung dịch 25 : 24 : 1 ( phenol : chloroform : isoamylalcohol ) vào ống chứa dịch chiết theo tỷ lệ 1 : 1. Lắc đều hỗn hợp và ly tâm ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 10 phút.
Bước 6: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 2ml. Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết. Lắc đều hỗn hợp và ly tâm lạnh ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút.
Bước 7: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 1,5ml. Bổ sung dung dịch isopropanol theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết. Lắc nhẹ nhàng. Giữ mẫu trong tủ -20oCtrong vòng 2h. Ly tâm ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại tủa ADN.
Bước 8: ADN được làm khô bằng cách mở nắp và để trong tủ hút trong vòng 2h. Hòa tan lại ADN bằng hỗn hợp NaCl 1M + Rnase 1mg/ml, ủ hỗn hợp ở tủ 37oC, t = 30 phút.
Bước 9:Bổ sung theo tỷ lệ 1 : 1 dung ethanol 100% vào hỗn hợp dung dịch ( ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml), giữ hỗn hợp ở tủ -20oC trong vòng 1h.
Bước 10: Ly tâm hỗn hợp ( ethanol 100% + ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml ) ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút nhằm thu lại tủa ADN.
Bước 11: Rửa lại tủa ADN thu được ở bước 10 bằng dung dịch Ethanol 70%, ly tâm lạnh 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút. Lặp lại bước này 2 lần.
Bước 12: Làm khô tủa ADN sử dụng máy hút chân không. Hòa tan ADN bằng nước cất khử ion. Bảo quản ADN trong tủ -20oC.
Bước 13: Kiểm tra chất lượng ADN tách chiết được bằng máy đo nanodrop và bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
2.3.3. Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR
Dung lượng hỗn hợp PCR cho mỗi mẫu là 20µl. Phản ứng PCR được tiến hành trên máy chu trình nhiệt model PTC-100.
Sau khi PCR kết thúc, 10µl dung dịch của mỗi ống phản ứng được điện di trên gel agarose 1% có bổ sung EtBr 0,05%, cùng với ADN marker (ADN chuẩn); sau đó, sản phẩm PCR được kiểm tra dưới đèn UV, chụp ảnh và đánh giá.
Bảng5. Thành phần phản ứng PCR
TT Thành phần Nồng độ ban đầu Thể tích (µl)
1 Nước khử ion vô trùng 13,35
2 Taq – buffer 10X 2
3 MgCl2 25mM 0,5
4 dNTPs 10mM 1,5
5 GmGLP1-35S-Forward 10pmol 0,5
6 GmGLP1-Reverse 10pmol 0,5
7 Taq ADN polymerase 10pg/µl 0,15
8 ADN khuôn 100 ng/µl 1
Tổng 20
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bước Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu
Nhiệt độ 95oC 95oC 57oC 72oC 72oC 4oC
Thời gian 5 phút 30 giây 30 giây 90 giây 10 phút ∞
Số chu kỳ 35
2.3.4. Phương pháp thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được thu nhận và tinh sạch để sử dụng làm ADN mẫu dò trong kỹ thuật lai Southern Blot. Quá trình tinh chế nhằm thu lại ADN đích và loại bỏ các thành phần khác đặc biệt là mồi thừa trong hỗn hợp PCR có ảnh hưởng xấu đến hiệu quả gắn của mẫu dò với trình tự đích.
Bộ hóa chất Quick Gel Extraction Kit và quy trình kèm theo được sử dụng để tinh sạch sản phẩm PCR. Các bước thôi gel được tiến hành theo chỉ dẫn của hãng sản xuất. Sau khi PCR, sản phẩm được kiểm tra trên gel agrose 1% có bổ sung 0,05% EtBr, điện di trong khoảng 1 giờ 30 phút (U = 100V, I = 100 mA), soi UV để vạch gel. Gel thu được được thực hiện các bước thôi gel:
Bước 1: Băng ADN từ bản gel agarose được cắt bằng dao cắt gel và chuyển vào ống eppendorf 1,5ml đã được cân và chú thích trọng lượng ống.
Bước 2: Cân ống eppendorf 1,5 ml chứa gel để xác định trong lượng của gel, sau đó bổ sung dung dịch L3 buffer theo tỷ lệ 3:1 vào ống. Ủ hỗn hợp buffer L3 và gel ở 50oC trong vòng 10 phút, cứ 3 phút đảo ống gel một lần.
Bước 3: Mẫu được chuyển sang cột Gel Extraction; ly tâm ở nhiệt độ phòng