Phương pháp lai Southern blot được thực hiện theo Southern (Southern, 1975) [69], sử dụng bộ kit DIG high prime I cùng protocol đi kèm bộ kit; ngoài ra tham khảo thêm protocol Southern blot Sambrook (2001) [64] và có cải tiến cho phù hợp với phòng thí nghiệm. ADN tổng số được sử dụng trong kỹ thuật lai Southern blot được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp tách chiết ADN của Doyle (1987) [27].
Mẫu dò ADN
Bước 1: Khuếch đại đoạn gen GmGLP1 ADN khuôn được sử dụng là plasmid. Cặp mồi GmGLP1-35S-Forward/ GmGLP1-Reverse. Sản phẩm PCR được
Bước 2: Thu nhận và tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit thôi gel Quick Gel Extraction Kit (như trình bày trong mục 2.3.4)
Bước 3: Sử dụng 1 µg đến 3 µg hàm lượng ADN làm mẫu dò (ADN khuôn) . Bước 4: Biến tính ADN khuôn ở 100oC trong 10 phút.
Bước 5: 16µl ADN khuôn sau biến tính được cho phản ứng với 4 µl DIG – High Prime, ủ ở 37oC trong 20h để phản ứng tổng hợp mẫu dò diễn ra hoàn toàn.
Bước 6: Dừng phản ứng tổng hợp mẫu dò ở 65oC trong 10 phút. Bảo quản mẫu dò ở tủ -20oC.
Mẫu dò sau khi tổng hợp có kích thước ~881 bp bằng kích thước đoạn gen
GmGLP1 được biến nạp vào cây đậu tương. Phản ứng cắt giới hạn ADN
Bước 1: Phản ứng cắt giới hạn bằng emzyme BamHI, thành phần phản ứng
như trong bảng , ủ hỗn hợp ở 37oC trong 20h.
Bảng 7. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bằng enzyme Bam HI
TT Thành phần phản ứng Nồng độ Hàm lượng cho 1 phản ứng 1 Bam HI buffer 10 X 30 µl 2 Rnase 1 mg/ml 30 µl 3 Enzyme Bam HI 3 U 9 µl 4 ADN khuôn 30 µg 200 µl 5 H2O 31 µl Tổng 300 µl
Bước 2: Bổ sung 1ml ethanol vào hỗn hợp phản ứng cắt, ủ trong 1h tủ -20oC Bước 3: Ly tâm 13000 v/p ở 4oC trong 30 phút để thu cặn tủa ADN.
Bước 4: Tủa ADN được rửa lại bằng ethanol 75%, lặp lại hai lần để loại bỏ hoàn toàn lượng enzyme và buffer còn dư của phản ứng cắt.
Bước 5: Đặt tủa ADN thu được trong tủ hút, ở nhiệt độ phòng, t = 1h để làm khô hoàn toàn.
Bước 6: Tủa ADN được hòa tan lại bằng nước cất khử trùng.
Bước 7: Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1%, U = 25V, t = 16h. Soi UV và chụp ảnh lại bản gel điện di sản phẩm cắt.
Chuyển sản phẩm cắt DNA từ bản gel lên màng lai
Bước 2: Chuyển ADN đã được biến tính lên màng nitrocellulose. Sử dụng dung dịch SDS 20X làm cầu dẫn cho sự dịch chuyển ADN từ gel lên màng nitrocellulose. Bước này diễn ra trong 24h để đảm bảo ADN từ gel được chuyển hoàn toàn lên màng lai.
Bước 3: Đèn UV được sử dụng để gắn ADN lên màng lai.
Lai với mẫu dò
Bước 1: Biến tính mẫu dò bằng nước sôi 100oC, trong 5 phút.
Bước 2: Phản ứng lai mẫu dò với ADN đích gắn trên màng nitrocellulose được diễn ra trong vòng 16h.
Bước 3: Rửa màng loại bỏ mẫu dò thừa và hiện màu phản ứng lai.
Chi tiết hóa chất đã được sử dụng trong các bước khác nhau của thí nghiệm được trình bày cụ thể trong protocol đi kèm với bộ kit.
2.4. Các chỉ tiêu đánh giá
Tần số phát sinh đa chồi (%) = *100
Tần suất biến nạp ở thế hệ T0 (%) = *100
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.1. Đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu
Đối với nguồn vật liệu khởi đầu, chúng tôi tiến hành so sánh và đánh giá 3 chỉ tiêu: tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ hạt nảy mầm xanh nhằm tạo tính khách quan cho những đánh giá ở các giai đoạn tiếp sau. Chúng tôi sử dụng 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 làm nguồn vật liệu ban đầu để tạo ra vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, do 4 giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu được thu hoạch ngoài đồng ruộng nên hạt bị nhiễm nấm và các loại vi sinh vật từ môi trường sinh trưởng và phát triển của chúng. Do đó, việc khử trùng loại bỏ các tác nhân gây ảnh hưởng tới mẫu nghiên cứu là cần thiết.
Giai đoạn khử trùng hạt là giai đoạn quan trọng nhất bởi đây chính là bước đầu tiên trong toàn bộ quá trình chuyển gen, ở giai đoạn này, đối tượng nuôi cấy
được đưa từ điều kiện bên ngoài vào điều kiện nuôi cấy in vitro. Tỷ lệ mẫu vô trùng
phụ thuộc vào thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng. Dung dịch dùng để khử trùng phải có nồng độ đủ để tiêu diệt các tác nhân gây nhiễm mẫu nhưng phải đảm bảo không làm ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt.
Theo quy trình biến nạp của Zhang và cs [81], hạt được khử trùng bằng khí Clo được giải phóng qua phản ứng:
NaClO + HCl đặc = NaOH + Cl2↑
Hạt được đặt trong hộp kín chứa hỗn hợp dung dịch NaClO + HCl đặc trong vòng 16h để loại bỏ các loại nấm, vi sinh vật bám trên bề mặt hạt. Hạt sau khử trùng được cấy lên môi trường nảy mầm hạt (GM).
Bảng8. Kết quả khảo sát tỷ lệ này mầm của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84
Hóa chất Thời gian khử trùng Giống đậu tương Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) Tỷ lệ nảy mầm xanh (%) 40ml NaClO + 5ml HCl đặc 16h ĐT22 5,00 98,00 75,00 ĐVN9 10,00 98,00 80,00 ĐT26 12,50 85,00 50,00 DT84 15,00 70,00 50,00
Dựa bảng số liệu 8 nhận thấy:
- Tỷ lệ nhiễm khuẩn và nấm của giống đậu tương DT84 là cao nhất đồng thời tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ nảy mầm xanh là thấp nhất.
- Tỷ lệ nhiễm của giống ĐT22 là thấp nhất, tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm xanh thấp hơn so với giống đậu tương ĐVN9.
Dựa vào kết quả nảy mầm của các giống, để đảm bảo số lượng mẫu đầu vào đủ tiêu chuẩn cho giai đoạn biến nạp tiếp sau, chúng tôi tăng số lượng hạt khử trùng và nảy mầm trên môi trường GM là: khoảng 400 hạt cho một thí nghiệm đối với giống DT84 và ĐT26; khoảng 150 – 200 hạt cho một thí nghiệm đối với giống ĐT22 và ĐVN9.
3.1.2. Khả năng tái sinh tạo đa chồi
Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường lây nhiễm, mẫu được chuyển sang môi trường SIM có chứa chất kích thích sinh trưởng BAP 1,67mg/l. Rất nhiều nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên sự tái sinh tạo đa chồi chỉ ra rằng: các chất kích thích sinh trưởng điển hình là BAP – đóng vai trò rất lớn trong sự sinh trưởng, phát triển và khả năng phát chồi của mẫu nuôi cấy. Theo nghiên cứu của Trejgell A và cs (2013) [73], các nồng độ khác nhau của BAP có ảnh hưởng khác nhau lên khả năng hình thành chồi và đa chồi ở cây đậu tương. Ngoài ra, theo Trần Thị Cúc Hòa [5] nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tương ở Việt Nam đã chỉ ra rằng khả năng tiếp nhận gen của các
vậy, khả năng tái sinh tạo đa chồi phụ thuộc vào hai yếu: (i) phụ thuộc vào nồng độ chất kích thích sinh trưởng BAP trong môi trường nuôi cấy; (ii) phụ thuộc vào đặc tính của giống đậu tương, các giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ đa chồi khác nhau.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng BAP nồng độ 1,67 mg/l cho quá trình kích thích tạo đa chồi của 4 giống đậu tương – ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84; sở dĩ, chúng tôi lựa chọn BAP nồng độ 1,67 mg/l do trong đa số những nghiên cứu trước đây [56, 51]… đều sử dụng BAP nồng độ 1,67 mg/l trong môi trường kích thích tạo đa chồi. Sau 14 ngày cảm ứng tạo chồi, kết quả thu được được thể hiện trong bảng 10. Tỷ lệ phát sinh đa chồi của giống ĐVN9 là cao nhất với tỷ lệ mẫu đa chồi là 62,40% tiếp đến là giống đậu tương ĐT22 (51,07%), giống DT84 có tỷ lệ mẫu phát sinh đa chồi thấp nhất (33,30%). Mặc dù trong quá trình tái sinh tạo đa chồi, ngoài những mẫu có khả năng tạo đa chồi và những mẫu chết do không tạo được chồi còn có những mẫu phát sinh lại chồi đỉnh. Những mẫu phát sinh chồi đỉnh được loại bỏ; do đó, coi những mẫu phát sinh chồi đỉnh là mẫu chết. Nguyên nhân phát sinh chồi đỉnh là do trong quá trình thao tác gây tổn thương lây nhiễm khuẩn không loại bỏ hoàn toàn đỉnh sinh trưởng trên nửa lá mầm.
Bảng 9. Khả năng phát sinh chồi của 4 giống đậu tương nghiên cứu sau 14 ngày
STT Giống Số mẫu
lây nhiễm (mẫu)
Số mẫu phát sinh đa chồi
(mẫu) Số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu phát sinh đa chồi (%) 1 ĐT22 750 383 367 51,07 2 ĐVN9 750 468 282 62,40 3 ĐT26 750 300 450 40,00 4 DT84 750 250 500 33,33
Tái sinh tạo đa chồi là một bước quan trọng cho sự thành công của quá trình chuyển gen. Bước tiếp sau của quá trình chuyển gen là chọn ra được các chồi mang
gen cần chuyển. Vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng cho biến nạp có chứa vector nhị thể pZY101Asc, ngoài chứa gen đích cần chuyển là gen GmGLP1 còn chứa thêm một đoạn gen Bar đóng vai trò làm chỉ thị chọn lọc thực vật. Hệ thống vector chứa gen Bar làm chỉ thị chọn lọc thực vật đã được sử dụng rất nhiều trong các nghiên
nồng độ glufosinate khác nhau trong môi trường chọn lọc. Năm 1999, Zhang và cs [82] chỉ ra rằng khả năng tái sinh chồi bị ức chế khi sử dụng nồng độ glufosinte 10 mg/l cho giống A 3237. Nhưng năm 2007, theo Trần Thị Cúc Hòa [5], glufosinate nồng độ 10 mg/l trong môi trường chọn lọc là phù hợp với hầu hết giống đậu tương và nồng độ 5 mg/l cho môi trường kéo dài chồi tiếp theo; trong nghiên cứu này Trần Thị Cúc Hòa sử dụng 4 giống đậu tương để nghiên cứu là: MTĐ176, HL202, Maverick và Williams 82. Paz và cs (2004) [56] đã sử dụng nồng độ glufosinate 6 mg/l trong suốt quá trình chọn lọc tức là từ giai đoạn sau phát sinh đa chồi cho tới giai đoạn kéo dài chồi. Năm 2013, Nguyễn Văn Đồng và cs [3] sử dụng glufosinate nồng độ 10 mg/l trong môi trường chọn lọc và duy trì nồng độ glufosinate trong môi
trường kéo dài lóng là 5 mg/l trong nghiên cứu chuyển nạp gen GmMyb vào giống
đậu tương ĐT22. Dựa vào kết quả những nghiên cứu trước đây, chúng tôi sử dụng nồng độ glufosinate trong lần chọn lọc đầu tiên là 10 mg/l và 5 mg/l cho môi trường chọn lọc kéo dài chồi tiếp sau.
Bảng 10. Khả năng sống sót sau chọn lọc và khả năng kéo dài chồi của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84
STT Giống Số mẫu tạo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đa chồi (mẫu) Số mẫu sống sót qua chọn lọc (mẫu) Số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ sống sót qua chọn lọc (%) 1 ĐT22 383 198 185 51,70 2 ĐVN9 468 168 300 35,90 3 ĐT26 300 56 244 18,70 4 DT84 250 68 182 27,20
3.1.3. Khả năng tái sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh
Rễ là bộ phận quan trọng của cây. Rễ đóng vai trò chính trong quá trình hút chất dinh dưỡng và muối khoáng nuôi dưỡng cây. Vì vậy, số lượng rễ và chất lượng rễ quyết định tới sự sống còn của mẫu khi chuyển mẫu ra ngoài môi trường nuôi cấy. Do đó, việc kích thích mô nuôi cấy hình thành rễ là một bước hết sức quan trọng, số lượng rễ càng nhiều và chất lượng rễ tốt, mô nuôi cấy càng có tỷ lệ sống sót cao hơn ở môi trường ngoài. Indol butyric acid (IBA) thuộc nhóm hoocmon thực vật auxin có tác dụng kích thích sự hình thành rễ. Nồng độ IBA khác nhau ảnh
hưởng khác nhau tới số lượng và chiều dài của rễ [9]. Theo nghiên cứu năm 2012 của Nguyễn Văn Đồng và cs [2], nồng độ IBA 1mg/ml phù hợp với giống ĐT22 cho bộ rễ to khỏe , nhiều rễ chính và thứ cấp, rễ mọc xung quanh gốc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng IBA nồng độ 1 mg/ml để kích thích ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh cho cả 4 giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 được sử dụng trong nghiên cứu. Kết quả phát sinh rễ tái tạo cây hoàn chỉnh được trình bày trong như trong bảng 12.
Bảng 11. Sự phát sinh rễ tái sinh cây hoàn chỉnh
Tên giống ĐT22 ĐVN9 ĐT26 DT84
Thời gian ra rễ 7 ngày 7 ngày 10 ngày 14-17 ngày
Số lượng rễ 10-15 10-15 5-7 3-5 Chất lượng rễ Rễ trắng, mảnh, nhiều rễ thứ cấp Rễ trắng, nhiều rễ thứ cấp Rễ nâu, ít rễ thứ cấp Rễ nâu sậm, không có rễ thứ cấp quanh gốc
Bảng 12. Cây tái sinh hoàn chỉnh sống sót và phát triển ở môi trường ngoài
TT Tên giống Tổng số chồi
(chồi)
Số chồi tạo rễ (chồi)
Số cây sống sót ở môi trường ngoài (cây)
1 ĐT22 15 15 15
2 ĐVN9 10 10 7
3 ĐT26 10 10 8
Hình 4. Quy trình chuyển gen đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (a): Giai đoạn nảy mầm hạt; (b): giai đoạn đồng nuôi cấy trên CCM; (c): giai đoạn cảm ứng tạo chồi trên SIM; (d): giai đoạn trên SIM có bổ sung chất chọn lọc glufosinate; (e): kéo dài chồi trên SEM; (f): giai đoạn tạo rễ trong RM; (g): giai đoạn cây con ở môi trường ngoài
3.2. Kết quả phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T0
3.2.1. Chọn lọc cây sau chuyển gen bằng Basta
Để giảm nhẹ những phần việc phân tích cây sau chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử, những cây sống sót ngoài đất sẽ trải qua thêm một lần chọn lọc
gen chỉ thị Bar. Cây sau khi được tái sinh hoàn chỉnh, sống sót và phát triển tốt ở
môi trường ngoài được tiến hành chọn lọc bằng cách sử dụng thuốc diệt cỏ Basta với nồng độ 100 mg/ml, phun lặp 2 lần mỗi lần cách nhau 3 ngày, sau 5 ngày nhận thấy cây kháng và cây chết biểu hiện rõ ràng như hình 5.
Hình 5. Cây phản ứng với Basta sau 5 ngày phun
Trong các nghiên cứu từ trước tới nay, có hai phương pháp chọn lọc cây T0
đang được sử dụng: (i): chọn lọc bằng cách bôi glufosinate lên lá; (ii): chọn lọc sử dụng basta để phun hoặc bôi lá. Thực chất hai phương pháp này là như nhau, basta là một loại thuốc diệt cỏ mà có chứa 2% thành phần là glufosinate. Điều này có nghĩa, dùng phương pháp bôi lá bằng glufosinate hay chọn lọc bằng basta đều sử
dụng glufosinate để chọn lọc những cây mang và biểu hiện gen Bar. Năm 2004, Paz
và cs [56] sử dụng nồng độ glufosinate 150 mg/l để bôi lá cây T0. Năm 2013, Nguyễn Văn Đồng và cs [3] sử dụng phương pháp phun basta để chọn lọc cây sau chuyển gen với nồng độ basta 3ppm. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã thử nồng
độ basta , ở nồng độ 100 mg/l cho biểu hiện cây kháng rõ rệt nhất. Kết quả phun basta được trình bày trong bảng 13.
Bảng 13. Tỷ lệ cây sống sót sau khi phun basta
Tên giống Số cây con ban (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đầu (cây) Số cây con sống sót (cây) Tỷ lệ cây sống sót (%) ĐT22 15 8 53,33 ĐVN9 7 0 0 ĐT26 8 6 75 DT84 2 2 100
3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển GmGLP1 bằng kỹ thuật PCR
Những cây con sống sót sau khi phun Basta được thu lá để tách chiết ADN
để kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 bằng kỹ thuật PCR. Để đảm bảo chất lượng
ADN, mẫu lá thu là những lá bánh tẻ mới ra sau lần phun Basta, mẫu sau khi thu xong được giữ trong nito lỏng và nghiền ngay. Thu khoảng 1 gram mẫu lá. Sử dụng quy trình CTAB [27] có cải tiến cho phù hợp theo điều kiện phòng thí nghiệm. Sau khi thu được ADN, kiểm tra chất lượng ADN bằng điện di và đo nanodrop. Kết quả