Hạt của cây T0 sau khi thu được gieo vào vụ xuân hè, gieo tất cả hạt T0 thu được để tiến hành đánh giá: (i): tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ Basta; (ii): phân tích southern blot.
Hình 10. Phản ứng của cây chuyển gen ở thế hệ T1 với Basta
Nồng độ Basta sử dụng cho việc chọn lọc cây T1 là 100 mg/l bằng với nồng độ phun chọn lọc cây T0. Năm 2006, Zhang và cs [78], sử dụng phương pháp bôi lá với 2% glufosinate. Cùng năm 2006, Margie và cs[57] chọn lọc cây T1 sau hai tuần
này mầm bằng Liberty nồng độ 250 mg/l để xác nhận sự có mặt gen Bar.
Bảng 15. Phân tích cây T1 chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 và 15:1
Giống đậu tương Dòng T0 Kháng Basta Mẫn Basta Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 3:1 So sánh giá trị 2 với giá trị tới hạn 3,841 ( = 0,05; df = 1 ) Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 15:1 So sánh giá trị 2 với giá trị tới hạn 3,841 ( = 0,05; df = 1 ) ĐT22 Q 1.5 12 6 0,667 < 3,841 22,533 > 3,841 Q 1.7 15 2 1,918 < 3,841 0,882 < 3,841
Q 2.1 12 7 1,421 < 3,841 30,347 > 3,841
Q 3.4 1 5 3,761 < 3,841 60,844 > 3,841
Dựa vào bảng 15, dòng Q1.5, Q2.1 và Q3.4 có giá trị 2 nhỏ hơn 3,841 khi xét tỷ lệ phân ly 3:1 và lớn hơn giá trị 3,841 khi xét tỷ lệ phân ly 15:1. Từ giá trị 2 nhận được, có thể kết luận bước đầu là: các cây T1 của các dòng Q1.5, Q2.1 và Q3.4 được hình thành từ các cây T0 tương ứng mang 1 bản copy của gen GmGLP1 được
chèn vào hệ gen. Tuy nhiên chúng tôi cũng lưu ý rằng, do tổng số cây trong phân tích thống kê cho dòng 4 chỉ có 6 cây – trong đó duy nhất 1 cây có biểu hiện kháng khi chọn lọc Basta – nên cũng không ngoại trừ khả năng kết quả thống kê 2 không
phản ánh chính xác sự có mặt 1 bản copy của gen GmGLP1 trong trường hợp
này.Riêng đối với dòng Q1.7, kết quả phân tích thống kê cho thấy giá trị 2 đều nhỏ hơn giá trị tới hạn 3,841 khi so sánh với tỷ lệ phân ly 3:1 và tỷ lệ phân ly 15:1. Như vậy để khẳng định được số bản copy – một hay hai – thực sự được chèn vào trong hệ gen (từ thế hệ T0) của dòng Q1.7, cần phải tiếp tục làm những phân tích tiếp sau.
Để tiếp tục phân tích, chúng tôi chọn ra từ các dòng cây T1 chuyển gen mỗi dòng 2 cây để phục vụ cho việc phân tích Southern blot. Kết quả tách chiết ADN
được trình như ở dưới:
M: thang ADN chuẩn 1 kb plus; 1,2: mẫu cây T1 dòng Q1.5; 3,4: mẫu cây T1 dòng Q1.7; 5,6: mẫu cây T1 dòng Q2.1; 7: mẫu cây T1 dòng Q3.4; 8: mẫu ĐT22 không chuyển gen
Chất lượng ADN tổng số tương đối tốt, không bị đứt gẫy nhưng hàm lượng các mẫu không đồng đều; nguyên nhân là do lượng mẫu lá thu không đều nhau. Chất lượng ADN như trên hình đủ tiêu chuẩn để được sử dụng trong phân tích tiếp theo.
Sử dụng cặp mồi GmGLP1-35S-Forward/ GmGLP1-Reversecho phản ứng
PCR kiểm tra cây T1. Kết quả thu được như sau:
Hình 12. PCR kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 trong cây T1
M: thang ADN chuẩn 1 kb plus;(+): đối chứng dương – plasmid; (-): đối chứng âm – H2O; Q1.5/3 và Q1.5/8: cây chuyển gen số 3 và số 8 dòng Q1.5; ; Q1.7/7 và Q1.7/9: cây chuyển gen số 7 và số 9 dòng Q1.7; Q2.1/4 và Q2.1/5:cây chuyển gen số 4 và số 5 dòng Q2.1; Q3.4/1: cây chuyển gen số 1 dòng Q3.4; ĐT22: cây ĐT22 không chuyển gen.
Hình 12 cho thấy, đối chứng dương plasmid cho băng đậm nét, đối chứng âm - H2O - không cho băng, điều này chứng tỏ phản ứng PCR diễn ra bình thường và có độ tin cậy. Cây chuyển gen của các dòng T1, tuy các băng hiện độ đậm nhạt khác nhau nhưng các băng đều rõ ràng và sáng nét, riêng dòng Q3.4, băng có kích thước
bằng băng kích thước của plasmid ~ 881 bp mờ hơn so với các dòng khác, ngoài ra, còn xuất hiện thêm 1 băng phụ.
Tiếp tục phân tích các dòng dương tính PCR bằng kỹ thuật lai Southern Blot. Mẫu dò sử dụng trong kỹ thuật lai Southern blot được sử dụng từ chính đoạn gen
GmGLP1 nội sinh của cây không chuyển gen và kéo dài thêm một đoạn khoảng 25
bp về phía promoter 35S.
Kết quả cắt giới hạn bằng enzyme BamHI và kết quả lai Southern blot được trình bày trong hình 13.
Hình 13. Kết quả lai Southern Blot
M: Thang chuẩn ADN 1 kb plus; ĐT22: cây không chuyển gen;Q1.5/3 và Q1.5/8: cây chuyển gen ở thế hệ T1 dòng cây chuyển gen Q1.5; Q1.7/7 và Q1.7/9: cây chuyển gen ở thế hệ T1 dòng cây chuyển gen Q1.7; Q2.1/4 và Q2.1/5: cây chuyển gen ở thế hệ T1 dòng cây chuyển gen Q2.1; Q3.4/1: cây chuyển gen ở thế hệ T1 dòng cây chuyển gen Q3.4
Từ kết quả lai Southern cho thấy:
- Cây ĐT22 cho ba băng và tất cả những dòng chuyển gen cũng cho băng bằng với băng của cây ĐT22. Có hai lý do để lý giải cho kết quả Southern blot hiện băng ở cả cây không chuyển gen: (i): Theo Lu và cs [47], trong hệ gen của đậu
tương, họ GmGLP1 có 21 gen, gen GmGLP1 được phân bố ở hai vị trí trong hệ gen, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trong quá trình cắt bởi enzym cắt giới hạn BamHI sẽ cho ra những đoạn có kích
thước khác nhau; (ii): mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu là đoạn gen GmGLP1 nội sinh từ cây đậu tươngđược tổng hợp dựa trên sự bắt cặp của cặp mồiGmGLP1-35S- Forward/ GmGLP1-Reverse.
- Dòng cây chuyển gen Q1.5 và Q1.7 ngoài băng cùng với băng của cây ĐT22 còn có thêm một băng bằng nhau ở vị trí khác nằm trong khoảng 2000 bp tới 3000 bp. Điều này chứng tỏ, dòng Q1.5 và dòng Q1.7 được xuất phát từ một nguồn ban đầu. Điều này có thể xảy ra bởi, trong quá trình phát sinh đa chồi, chồi nào bật lên dài trước sẽ được cắt và kích thích ra rễ, cụm đa chồi lại được tiếp tục nuôi để tạo chồi mới; nhiều khả năng là do hai chồi được cắt ra có cùng nguồn gốc.
- Dòng Q2.1 và dòng Q3.4, ngoài băng trùng với băng của cây ĐT22 không có băng nào khác. Điều này chứng tỏ rằng, hệ gen của cây chuyển gen thế hệ T1 của
hai dòng cây chuyển gen Q2.1 và Q3.4 không mang đoạn gen GmGLP1 cần chuyển.
Kết hợp kết quả phun Basta, kết quả PCR và kết quả lai Southern blot để đưa ra kết luận về số lượng bản copy ở cây T1, số liệu được trình bày như trong bảng 16.
Bảng 16. Kết quả phân tích cây chuyển gen T1
Giống đậu tương Dòng T0 Dòng T1 Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 3:1 Giá trị 2 với tỷ lệ phân ly 15:1 PCR Southern blot ĐT22 Q1.5 Q1.5/3 2 < 3,841 2> 3,841 + + Q1.5/8 + + Q1.7 Q1.7/7 2 < 3,841 2< 3,841 + + Q1.7/9 + + Q2.1 Q2.1/4 2 < 3,841 2> 3,841 + -
Q2.1/5 + -
Q3.4 Q3.4/1 2
< 3,841 2> 3,841 + -
+: dương tính; - : âm tính
Từ kết quả phân tích cây đậu tương ĐT22 chuyển gen GmGLP1 ở thế hệ
T1trong bảng 16 rút ra được một số nhận xét như sau:
(i): Từ kết quả phân tích tỷ lệ cây kháng và cây mẫn với basta, kết quả PCR và kết quả Southern blot kết luận được rằng các cây T1 của dòng cây chuyển gen Q1.5 và dòng Q1.7 được hình thành tương ứng từ các cây T0 có duy nhất một bản
copy của gen GmGLP1 chèn vào trong hệ gen. Vị trí băng trong Southern blot của
dòng số 1 và dòng số 2 trùng lặp về kích thước, cho thấy rằng hai dòng thực chất được xuất phát từ cùng một nguồn gốc. Tiếp tục phân tích hai dòng cây chuyển gen Q1.5 và dòng Q1.7 ở thế hệ tiếp theo để tìm ra dòng thuần.
(ii): Dòng cây chuyển gen Q2.1, kết quả phân tích thống kê cho thấy rằngcác cây T1 được hình thành từ cây T0 mang 1 bản copy của gen GmGLP1 chèn vào
trong hệ gen. Kết quả PCR cũng cho thấy rằng các cây T1 kháng với Basta được
kiểm tra đều mang gen GmGLP1 ngoại sinh. Tuy nhiên kết quả Southern blot
không cho băng, một khả năng là do sự chuẩn bị mẫu chưa đủ tốt. Để có thể khẳng
định được chính xác số lượng bản copy của gen GmGLP1 trong hệ gen cần tiếp tục
tiến hành các phân tích tương tự ở thế hệ tiếp theo.
(iii): Đối với dòng cây chuyển gen Q3.4, kết quả PCR hiện băng nhạt và kết quả Southern blot âm tính đồng thời số lượng mẫu ban đầu quá ít, cây sống sau khi phun basta thấp. Loại bỏ dòng số 4, không tiếp tục phân tích ở những thế hệ tiếp theo.
Như vậy, dòng cây đậu tương ĐT22 đã được chuyển gen Q1.5, Q1.7 và Q2.1 được tiếp tục phân tích sự phân ly ở thế hệ tiếp theo để tìm ra dòng thuần mang gen
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Giống đậu tương ĐT22 có khả năng tái sinh cụm chồi (51,07 %) cao và có
tiềm năng tiếp nhận gen GmGLP1 tốt nhất trong 4 giống đậu tương: ĐT22, ĐVN9,
ĐT26 và DT84 đã được sử dụng trong nghiên cứu.
2. Trong 4 giống đậu tương nghiên cứu: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 đã tạo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
được cây chuyển gen mang gen GmGLP1 của 3 giống đậu tương: ĐT22, ĐT26 và
DT84. Dựa vào kết quả phân tích PCR ở cây chuyển gen thế hệ T0, thu được tần suất biến nạp của các giống đậu tương như sau ĐT22: 0,93%; ĐT26: 0,27% và DT84: 0,13%.
3. Phân tích đánh giá sự ổn định di truyền của giống đậu tương ĐT22 ở thế hệ T1 bằng phương pháp phun Basta và phương pháp phân tích Southern blot. KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu và tìm ra dòng thuần của giống đậu tương ĐT22
mang gen GmGLP1.
2. Đánh giá khả năng kháng hạn và sự ổn định di truyền của dòng đậu tương
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây Đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà
Nội.
2. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hương, Nguyễn Hữu Kiên (2012)“Nghiên
cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua Agrobacterium
tumefaciens”, Tạp chí khoa học và công nghệ Việt Nam, 9 (39), tr. 119 – 124.
3. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013), “Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và kháng
thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22”,Tạp chí khoa học và công nghệ Việt Nam,
11, tr. 3 – 9.
4. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh
Hương (2005), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa và nhân gen dehydrin của
một số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc Việt Nam", Báo cáo khoa
học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Đại học Y Hà Nội, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội
5. Trần Thị Cúc Hòa (2007) “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen
của các giống đậu tương trồng ở Việt Nam”, Tạp chí nông nghiệp và phát triển
nông thôn, 18, tr. 9 – 14.
6. Nguyễn Huy Hoàng (1992) “Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống
đậu tương nhập nội ở miền Bắc Việt Nam”, Luận án phó tiến sỹ, Hà Nội.
7. Chu Hoàng Mậu (2001) “Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để
rao các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc việt nam”
Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội.
8. Tổng cục thống kê (2013), Niên giám thống kê 2012, NXB Thống kê, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
9. Akwatulira F., Gwali S., Okullo J.B.L., Ssegawa P., Tumwebaze S. B., Mbwambo J. R., Muchugi A. (2001), “Influence of rooting media and indole-3- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
butyric acid (IBA) concentration on rooting and shoot formation of Warburgia
ugandensis stem cuttings”, African Journal of Plant Science, 5(8), pp. 421-429.
10.Banerjee J, Maiti M. K. (2010), “Functional role of rice germin-like protein1
in regulation of plant height and disease resistance”,Biochemical and Biophysical
Research Communications, 394(1), pp. 178-183.
11.Bartels D., Sunkar R. (2005), “Drought and Salt Tolerance in Plants”,Critical
Reviews in Plant Sciences,24(1), pp. 23-58.
12.Birch R.G. (1997), “ Plant Transformation: Problems and Strategies for
Practical Application”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular
Biology, 48, pp. 297-326.
13.Boyer J.S. (1982), “Plant productivity and environment”, Science,
218(4571), pp. 443–448.
14.Chaves M.M., Costa J.M., Saibo N.J.M. (2011), “Recent Advances in
Photosynthesis Under Drought and Salinity”, Advances in Botanical Research, 57,
pp. 50-83.
15.Chee, P. P., Fober K. A., Slightom J. L. (1989), “Transformation of Soybean
(Glycine max)by Infecting Germinating Seeds with Agrobacterium tumefaciens”,
Plant Physiology,91(3), pp. 1212-1218.
16.Chen M., Wang Q. Y., Cheng X. G., Xu Z. S., Li L. C., Ye X. G., Xia L. Q.,
Ma Y. Z. (2007), “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants”, Biochemical and
Biophysical Research Communiction,353(2), pp.299-305.
17.Chen W. S., Chiu C. C., Liu H. Y., Lee T. L., Cheng J. T., Lin C. C., Wu Y. J., Chang H. Y. (1998), “Gen transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt
in watermelon”,Biochemistry and Molecular Biology International,46(6), pp. 1201-
18.Chowrira, G. M., Akella V., Lurquin, P.F. (1995), “Electroporation-mediated gen transfer into intact nodal meristems in planta. Genrating transgenic plants
without in vitro tissue culture”,Molecular Biotechnology,3(1), pp. 17-23.
19.Christou P., Murphy J. E., Swain W. F. (1987), “Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed
callus”,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 84(12), pp. 3962-3966.
20.Chumakov M.I., Rozhok N. A., Velikov V.A., Tyrnov V.S., Volokhina I.V.
(2006), “Agrobacterium-mediated in Planta Transformation of Maize via Pistil Filaments”,Russian Journal of Gentics,42(8), pp. 893-897. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
21.Cleene M. D., Ley J. D. (1976), “The host range of crown gall”,Botanical
Review, 42(4), pp. 389-466.
22.Cook E.R., Seager R., Cane M.A., Stahle D.W. (2007), “North American
drought: reconstructions, causes, and consequences”,Earth-Science Reviews, 81, pp.
93-134.
23.de Ronde J. A., Laurie R. N., Caetano T., Grayling M. M., Kerepesi I.(2004), “Comparative study between transgenic and non-transgenic soybean lines proved
transgenic lines to be more drought tolerant”, Euphytica, 138, pp.123-132.
24.Delauney A. J.,Verma D. P.(1990), “A soybean gen encoding delta 1- pyrroline-5-carboxylate reductase was isolated by functional complementation in
Escherichia coli and is found to be osmoregulated”,Molecular &Genral Gentics,221(3), pp. 299-305.
25.Delzer B. W., Somer D.A., Orf J.H. (1990), “Agrobacterium tumefaciens
susceptibility and plant regenration of 10 soybean genotypes in maturity group 00 to
II”, Crop Science, 30(2), pp. 320-322.
26.Di R., Purcell V., Collins G.B., Ghabrial S.A. (1996), “Production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor
27.Doyle J.J., Doyle J.L. (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissues”, Phytochemical Bulletin,19, pp. 11-15.
28.Duan X. L., Chen S. B. (1985), “Variation occurring by introduction of the
exogenous DNA into rice”. Scientia Sinica. Series B, Chemical, biological,
agricultural, medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan, 18,
pp. 6-10.
29.Farooq M., Wahid A., Kobayashi N., Fujita D., Basra S.M.A. (2009),“Plant
drought stress: effects, mechanisms anh management”,Agronomy for Sustainable
Development,29(1), pp. 185-212.
30.Fromm M., Taylor L.P., Walbot V. (1985), “Expression of gen transferred
into monocot and dicot plant cells by electroporation”,Proceeding of the National
Academy of Sciences of the United States of America,82(17), pp. 5824-5828.
31.Hadi M. Z., McMullen M.D., Finer, J.J. (1996), “Transformation of 12
different plasmids into soybean via particle bombardment”,Plant Cell Reports,15,
pp. 500-505.
32.Hansen G., Das A., Chilton M.D. (1994), “Constitutive expression of the
virulence gens improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium”, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,91(16), pp. 7603-7607.
33.Hood E. E., Helmer G. L., Fraley R. T., Chilton M. D. (1986), “The
hypervirulence of Agrobacterium tumefaciensA281 is encoded in a region of pTiBo542 outsite of T-DNA”, Journal of Bacteriology, 168(3), pp.1291-1301.
34.Hooykaas P.J. J., Schilperoort R.A. (1992), “Agrobacterium and plant gentic engineering”, Plant Molecular Biology,19, pp.15-38.