Phương pháp tạo vật liệu vô trùng và phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương được tiến hành theo quy trình của Olhofl et al. (2003) [51] và Zhang (2004) [81] có cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Tạo vật liệu vô trùng
Hạt đậu tương được đặt trong đĩa petri 15x100 mm thành một lớp đơn và đưa vào hộp hút khô có chứa ca thủy tinh đựng hỗn hợp 100ml Clorox + 4ml HCl đặc. Hộp hút khô được đóng kín và hạt giữ trong vòng 16h để khử trùng.
Nảy mầm hạt
Hạt đậu tương sau khi khử trùng được cấy trên đĩa môi trường GM. Gói đĩa chứa hạt thành từng chồng 5 đĩa. Các chồng hạt được nuôi trong phòng nuôi cấy trong điều kiện: nhiệt độ 24oC, 18h sáng, 6h tối, với cường độ ánh sáng 100-150E trong vòng 5 ngày.
Chuẩn bị khuẩn biến nạp
Chủng khuẩn A.tumefaciens – EHA101 chứa vector pZY101Asc – mang gen
Bar chọn lọc glufosinate và gen cần chuyển GmGLP1 – được lưu giữ trong tủ -
80oC. Trước khi sử dụng khuẩn cho biến nạp thực vật, khuẩn được nuôi phục hồi trên môi trường YEP đặc có bổ sung 4 loại kháng sinh chọn lọc vi khuẩn: 50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin, và 25mg/ml Kanamycin. Nuôi khuẩn sau 3 ngày trên môi trường YEP đặc, thu khuẩn lạc và nuôi lắc trong 5ml môi trường YEP lỏng được bổ sung 4 loại kháng sinh chọn lọc (50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin, và 25mg/ml
Kanamycin).Nuôi lắc trong 8 giờ, dịch khuẩn thu được được chuyển sang bình chứa 150ml YEP lỏng. Tiếp tục nuôi lắc khuẩn 16h ở 28oC , V = 250 v/p. Sử dụng máy đo OD ở bước sóng 650nm để kiểm tra mật độ tế bào có mặt trong dịch khuẩn nuôi cấy. OD650 khuẩn đạt giá trị nằm trong khoảng 1,0 – 1,2 được sử dụng để lây nhiễm cho thực vật. Ly tâm dịch khuẩn để thu cặn khuẩn ở 3500 v/p, 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hòa tan lại cặn khuẩn sử dụng dung dịch CCM lỏng sao cho OD650 sau khi hòa tan đạt giá trị0,6. Dung dịch CCM lỏng có giá trị OD650 đạt 0,6 được gọi là dung dịch đồng nuôi cấy.
Đồng nuôi cấy
Nảy mầm hạt sau 5 ngày, loại bỏ phần trụ dưới lá mầm, tách đôi hai lá mầm ( ½ lá mầm sau đây sẽ được gọi là mẫu nuôi cấy) bằng dao nuôi cấy sao cho mỗi lá mầm chứa ½ chồi đỉnh. Loại bỏ chồi đỉnh trên mẫu nuôi cấy, gây tổn thương mẫu nuôi cấy tại vị trí nốt lá mầm khoảng 5 – 7 đường, mỗi đường sâu khoảng 0,5mm và dài khoảng 3 – 4 mm. Mẫu nuôi cấy đã gây tổn thương được ngâm trong dung dịch
đồng nuôi cấy khoảng 30 phút để lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens. Chuyển
mẫu nuôi cấy sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường CCM đặc). Nuôi mẫu trên môi trường CCM đặc trong 5 ngày ở điều kiện nhiệt độ 24oC, điều kiện ánh sáng: 18h sáng và 6h tối, cường độ ánh sáng 100 – 150E.
Kích thích ra chồi
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy trên môi trường CCM đặc, loại bỏ khuẩn bám trên bề mặt mẫu nuôi cấy bằngmôi trường SIM lỏng trước khi chuyển sang môi trường SIM đặc. Giữ mẫu nuôi cấy trong môi trường SIM đặc trong 14 ngày nhằm kích thích vị trí gây tổn thương tạo cụm đa chồi. Chuyển mẫu nuôi cấy đã phát sinh được cụm đa chồi sang môi trường SIM đặc có chứa chất chọn lọc thực vật glufosinate nồng độ 10mg/l, nuôi mẫu nuôi cấy trong 14 ngày.
Kéo dài chồi
Những mẫu nuôi cấy sống sót qua chọn lọc được loại bỏ những chồi chết trên cụm chồi đồng thời được cắt loại bỏ phần trụ lá mầm. Chuyển tiếp mẫu nuôi cấy sang môi trường SEM chứa chất chọn lọc glufosinate nồng độ 5mg/ml giảm ½
so với môi trường SIM đặc. Cứ sau 14 ngày tiến hành chuyển những mẫu sống sót xanh sang môi trường SEM mới. Chú ý loại bỏ những chồi chết trong mỗi lần chuyển mẫu. Mẫu đýợc chuyển cho tới khi cụm đa chồi bật lęn đýợc chồi.
Kích thích ra rễ
Những chồi dài 3 – 4 cm trong cụm đa chồi, được cắt khỏi cụm đa chồi để kích thích ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh. Chồi sau khi được cắt khỏi cụm đa chồi được ngâm khoảng 2 – 5 phút trong dung dịch IBA 1 mg/ml. Chồi được nuôi trên môi trường RM cho tới khi chồi phát sinh rễ.Chuyển cây con sau khi tái sinh hoàn chỉnh ( có thân, lá và rễ đầy đủ) ra đất.
Chọn lọc cây con ra đất bằng Basta
Tùy thuộc vào tốc độ thích ứng của phát triển của cây con ngoài môi trường mà chọn thời gian phun basta cho hợp lý. Thương cây con được sử dụng trong thí nghiệm phun basta là những cây phát sinh khoảng 3 – 5 lá thật. Nồng độ basta sử dụng trong thí nghiệm chọn lọc là 100mg/l. Cây con sau khi phun basta được che chắn để giảm tác động của môi trường ( mưa, nắng, gió, sương…) tới kết quả phun basta. Thí nghiệm phun basta được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày. Những cây con sống sót sau 3 lần phun basta, được tiếp tục chăm sóc làm vật liệu cho những phân tích đánh giá tiếp theo.
Chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A.
tumefaciens như được trình bày ở trên trong các thí nghiệm với 4 giống đậu tương:
ĐT22, ĐT26, DT84, và ĐVN9. Với từng giống, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá
Quy trình tách chiết ADN được tiến hành theo quy trình tách chiết ADN của Doyle et al. (1987) [27] được cải tiến cho phù hợp với điều kiện và hóa chất của phòng thí nghiệm.
Bước 1: Thu mẫu lá từ những cây con sống sót sau 3 lần phun basta. Giữ mẫu lá thu được trong nito lỏng, nghiền mẫu lá ngay sau khi thu mẫu.
Bước 2: Nghiền nhỏ 1 gam mẫu lá bằng chày cối sứ trong nito lỏng và chuyển vào ống eppendoft 2ml.
Bước 3: Bổ sung 1,5ml dung dịch đệm CTAB (xem phụ lục) mỗi ống eppendoft. Lắc đều mẫu và ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở 650C, t = 60 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 4: Ly tâm hỗn hợp dịch chiết mẫu lá V = 13000 v/p, t = 10 phút, ở 4oC. Bước 5: Thu dịch nổi, chuyển sang ống eppendoft 2ml. Bổ sung dung dịch 25 : 24 : 1 ( phenol : chloroform : isoamylalcohol ) vào ống chứa dịch chiết theo tỷ lệ 1 : 1. Lắc đều hỗn hợp và ly tâm ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 10 phút.
Bước 6: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 2ml. Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết. Lắc đều hỗn hợp và ly tâm lạnh ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút.
Bước 7: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 1,5ml. Bổ sung dung dịch isopropanol theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết. Lắc nhẹ nhàng. Giữ mẫu trong tủ -20oCtrong vòng 2h. Ly tâm ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại tủa ADN.
Bước 8: ADN được làm khô bằng cách mở nắp và để trong tủ hút trong vòng 2h. Hòa tan lại ADN bằng hỗn hợp NaCl 1M + Rnase 1mg/ml, ủ hỗn hợp ở tủ 37oC, t = 30 phút.
Bước 9:Bổ sung theo tỷ lệ 1 : 1 dung ethanol 100% vào hỗn hợp dung dịch ( ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml), giữ hỗn hợp ở tủ -20oC trong vòng 1h.
Bước 10: Ly tâm hỗn hợp ( ethanol 100% + ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml ) ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút nhằm thu lại tủa ADN.
Bước 11: Rửa lại tủa ADN thu được ở bước 10 bằng dung dịch Ethanol 70%, ly tâm lạnh 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút. Lặp lại bước này 2 lần.
Bước 12: Làm khô tủa ADN sử dụng máy hút chân không. Hòa tan ADN bằng nước cất khử ion. Bảo quản ADN trong tủ -20oC.
Bước 13: Kiểm tra chất lượng ADN tách chiết được bằng máy đo nanodrop và bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
2.3.3. Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR
Dung lượng hỗn hợp PCR cho mỗi mẫu là 20µl. Phản ứng PCR được tiến hành trên máy chu trình nhiệt model PTC-100.
Sau khi PCR kết thúc, 10µl dung dịch của mỗi ống phản ứng được điện di trên gel agarose 1% có bổ sung EtBr 0,05%, cùng với ADN marker (ADN chuẩn); sau đó, sản phẩm PCR được kiểm tra dưới đèn UV, chụp ảnh và đánh giá.
Bảng5. Thành phần phản ứng PCR
TT Thành phần Nồng độ ban đầu Thể tích (µl)
1 Nước khử ion vô trùng 13,35
2 Taq – buffer 10X 2
3 MgCl2 25mM 0,5
4 dNTPs 10mM 1,5
5 GmGLP1-35S-Forward 10pmol 0,5
6 GmGLP1-Reverse 10pmol 0,5
7 Taq ADN polymerase 10pg/µl 0,15
8 ADN khuôn 100 ng/µl 1
Tổng 20
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bước Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu
Nhiệt độ 95oC 95oC 57oC 72oC 72oC 4oC
Thời gian 5 phút 30 giây 30 giây 90 giây 10 phút ∞
Số chu kỳ 35
2.3.4. Phương pháp thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được thu nhận và tinh sạch để sử dụng làm ADN mẫu dò trong kỹ thuật lai Southern Blot. Quá trình tinh chế nhằm thu lại ADN đích và loại bỏ các thành phần khác đặc biệt là mồi thừa trong hỗn hợp PCR có ảnh hưởng xấu đến hiệu quả gắn của mẫu dò với trình tự đích. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bộ hóa chất Quick Gel Extraction Kit và quy trình kèm theo được sử dụng để tinh sạch sản phẩm PCR. Các bước thôi gel được tiến hành theo chỉ dẫn của hãng sản xuất. Sau khi PCR, sản phẩm được kiểm tra trên gel agrose 1% có bổ sung 0,05% EtBr, điện di trong khoảng 1 giờ 30 phút (U = 100V, I = 100 mA), soi UV để vạch gel. Gel thu được được thực hiện các bước thôi gel:
Bước 1: Băng ADN từ bản gel agarose được cắt bằng dao cắt gel và chuyển vào ống eppendorf 1,5ml đã được cân và chú thích trọng lượng ống.
Bước 2: Cân ống eppendorf 1,5 ml chứa gel để xác định trong lượng của gel, sau đó bổ sung dung dịch L3 buffer theo tỷ lệ 3:1 vào ống. Ủ hỗn hợp buffer L3 và gel ở 50oC trong vòng 10 phút, cứ 3 phút đảo ống gel một lần.
Bước 3: Mẫu được chuyển sang cột Gel Extraction; ly tâm ở nhiệt độ phòng V = 13000 v/p, t = 1 phút. Thu lại cột Gel, loại bỏ phần dịch.
Bước 4: Rửa cột Gel bằng dung dịch rửa ( WB ). Bổ sung dung dịch WB theo tỷ lệ thể tích 1 : 1 so với thể tích mẫu đã cho lên cột. Ly tâm lạnh ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 1 phút. Loại bỏ phần dịch. Bước này được lặp lại 2 lần.
Bước 5: Ly tâm cột Gel ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 1 phút nhằm loại bỏ hoàn toàn dịch rửa WB.
Bước 6: Chuyển cột Gel sang ống eppendorf mới. Bổ sung 30 µl dung dịch EB lên cột Gel, mẫu được giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 5 – 10 phút. Ly tâm mẫu ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 1 phút.
Bước 7: Mẫu được bảo quản trong tủ -20oC và được sử dụng làm mẫu dò trong phương pháp lai Southern blot.
2.3.5. Phương pháp lai Southern blot
Phương pháp lai Southern blot được thực hiện theo Southern (Southern, 1975) [69], sử dụng bộ kit DIG high prime I cùng protocol đi kèm bộ kit; ngoài ra tham khảo thêm protocol Southern blot Sambrook (2001) [64] và có cải tiến cho phù hợp với phòng thí nghiệm. ADN tổng số được sử dụng trong kỹ thuật lai Southern blot được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp tách chiết ADN của Doyle (1987) [27].
Mẫu dò ADN
Bước 1: Khuếch đại đoạn gen GmGLP1 ADN khuôn được sử dụng là plasmid. Cặp mồi GmGLP1-35S-Forward/ GmGLP1-Reverse. Sản phẩm PCR được
Bước 2: Thu nhận và tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit thôi gel Quick Gel Extraction Kit (như trình bày trong mục 2.3.4)
Bước 3: Sử dụng 1 µg đến 3 µg hàm lượng ADN làm mẫu dò (ADN khuôn) . Bước 4: Biến tính ADN khuôn ở 100oC trong 10 phút.
Bước 5: 16µl ADN khuôn sau biến tính được cho phản ứng với 4 µl DIG – High Prime, ủ ở 37oC trong 20h để phản ứng tổng hợp mẫu dò diễn ra hoàn toàn.
Bước 6: Dừng phản ứng tổng hợp mẫu dò ở 65oC trong 10 phút. Bảo quản mẫu dò ở tủ -20oC.
Mẫu dò sau khi tổng hợp có kích thước ~881 bp bằng kích thước đoạn gen
GmGLP1 được biến nạp vào cây đậu tương. Phản ứng cắt giới hạn ADN
Bước 1: Phản ứng cắt giới hạn bằng emzyme BamHI, thành phần phản ứng
như trong bảng , ủ hỗn hợp ở 37oC trong 20h.
Bảng 7. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bằng enzyme Bam HI
TT Thành phần phản ứng Nồng độ Hàm lượng cho 1 phản ứng 1 Bam HI buffer 10 X 30 µl 2 Rnase 1 mg/ml 30 µl 3 Enzyme Bam HI 3 U 9 µl 4 ADN khuôn 30 µg 200 µl 5 H2O 31 µl Tổng 300 µl
Bước 2: Bổ sung 1ml ethanol vào hỗn hợp phản ứng cắt, ủ trong 1h tủ -20oC Bước 3: Ly tâm 13000 v/p ở 4oC trong 30 phút để thu cặn tủa ADN.
Bước 4: Tủa ADN được rửa lại bằng ethanol 75%, lặp lại hai lần để loại bỏ hoàn toàn lượng enzyme và buffer còn dư của phản ứng cắt.
Bước 5: Đặt tủa ADN thu được trong tủ hút, ở nhiệt độ phòng, t = 1h để làm khô hoàn toàn.
Bước 6: Tủa ADN được hòa tan lại bằng nước cất khử trùng.
Bước 7: Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1%, U = 25V, t = 16h. Soi UV và chụp ảnh lại bản gel điện di sản phẩm cắt.
Chuyển sản phẩm cắt DNA từ bản gel lên màng lai
Bước 2: Chuyển ADN đã được biến tính lên màng nitrocellulose. Sử dụng dung dịch SDS 20X làm cầu dẫn cho sự dịch chuyển ADN từ gel lên màng nitrocellulose. Bước này diễn ra trong 24h để đảm bảo ADN từ gel được chuyển hoàn toàn lên màng lai.
Bước 3: Đèn UV được sử dụng để gắn ADN lên màng lai. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lai với mẫu dò
Bước 1: Biến tính mẫu dò bằng nước sôi 100oC, trong 5 phút.
Bước 2: Phản ứng lai mẫu dò với ADN đích gắn trên màng nitrocellulose được diễn ra trong vòng 16h.
Bước 3: Rửa màng loại bỏ mẫu dò thừa và hiện màu phản ứng lai.
Chi tiết hóa chất đã được sử dụng trong các bước khác nhau của thí nghiệm được trình bày cụ thể trong protocol đi kèm với bộ kit.
2.4. Các chỉ tiêu đánh giá
Tần số phát sinh đa chồi (%) = *100
Tần suất biến nạp ở thế hệ T0 (%) = *100
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84
3.1.1. Đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu
Đối với nguồn vật liệu khởi đầu, chúng tôi tiến hành so sánh và đánh giá 3 chỉ tiêu: tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ hạt nảy mầm xanh nhằm tạo tính khách quan cho những đánh giá ở các giai đoạn tiếp sau. Chúng tôi sử dụng 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 làm nguồn vật liệu ban đầu để tạo ra vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, do 4 giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu được thu hoạch ngoài đồng ruộng nên hạt bị nhiễm nấm và các loại vi sinh vật từ môi trường sinh trưởng và phát triển của chúng. Do đó, việc khử trùng loại bỏ các tác nhân gây ảnh hưởng tới mẫu nghiên cứu là cần thiết.
Giai đoạn khử trùng hạt là giai đoạn quan trọng nhất bởi đây chính là bước đầu tiên trong toàn bộ quá trình chuyển gen, ở giai đoạn này, đối tượng nuôi cấy
được đưa từ điều kiện bên ngoài vào điều kiện nuôi cấy in vitro. Tỷ lệ mẫu vô trùng
phụ thuộc vào thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng. Dung dịch dùng để khử trùng phải có nồng độ đủ để tiêu diệt các tác nhân gây nhiễm mẫu nhưng phải đảm bảo không làm ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt.