Đối với nguồn vật liệu khởi đầu, chúng tôi tiến hành so sánh và đánh giá 3 chỉ tiêu: tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ hạt nảy mầm xanh nhằm tạo tính khách quan cho những đánh giá ở các giai đoạn tiếp sau. Chúng tôi sử dụng 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 làm nguồn vật liệu ban đầu để tạo ra vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, do 4 giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu được thu hoạch ngoài đồng ruộng nên hạt bị nhiễm nấm và các loại vi sinh vật từ môi trường sinh trưởng và phát triển của chúng. Do đó, việc khử trùng loại bỏ các tác nhân gây ảnh hưởng tới mẫu nghiên cứu là cần thiết.
Giai đoạn khử trùng hạt là giai đoạn quan trọng nhất bởi đây chính là bước đầu tiên trong toàn bộ quá trình chuyển gen, ở giai đoạn này, đối tượng nuôi cấy
được đưa từ điều kiện bên ngoài vào điều kiện nuôi cấy in vitro. Tỷ lệ mẫu vô trùng
phụ thuộc vào thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng. Dung dịch dùng để khử trùng phải có nồng độ đủ để tiêu diệt các tác nhân gây nhiễm mẫu nhưng phải đảm bảo không làm ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt.
Theo quy trình biến nạp của Zhang và cs [81], hạt được khử trùng bằng khí Clo được giải phóng qua phản ứng:
NaClO + HCl đặc = NaOH + Cl2↑
Hạt được đặt trong hộp kín chứa hỗn hợp dung dịch NaClO + HCl đặc trong vòng 16h để loại bỏ các loại nấm, vi sinh vật bám trên bề mặt hạt. Hạt sau khử trùng được cấy lên môi trường nảy mầm hạt (GM).
Bảng8. Kết quả khảo sát tỷ lệ này mầm của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84
Hóa chất Thời gian khử trùng Giống đậu tương Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) Tỷ lệ nảy mầm xanh (%) 40ml NaClO + 5ml HCl đặc 16h ĐT22 5,00 98,00 75,00 ĐVN9 10,00 98,00 80,00 ĐT26 12,50 85,00 50,00 DT84 15,00 70,00 50,00
Dựa bảng số liệu 8 nhận thấy:
- Tỷ lệ nhiễm khuẩn và nấm của giống đậu tương DT84 là cao nhất đồng thời tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ nảy mầm xanh là thấp nhất.
- Tỷ lệ nhiễm của giống ĐT22 là thấp nhất, tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm xanh thấp hơn so với giống đậu tương ĐVN9.
Dựa vào kết quả nảy mầm của các giống, để đảm bảo số lượng mẫu đầu vào đủ tiêu chuẩn cho giai đoạn biến nạp tiếp sau, chúng tôi tăng số lượng hạt khử trùng và nảy mầm trên môi trường GM là: khoảng 400 hạt cho một thí nghiệm đối với giống DT84 và ĐT26; khoảng 150 – 200 hạt cho một thí nghiệm đối với giống ĐT22 và ĐVN9.