Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bông vải qua mô sẹo chưa được thực hiện thành công và việc chuyển gen chỉ được thực hiện bằng vi tiêm vào ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001). Phương pháp chuyển gen này tuy có hiệu quả nhưng sự biểu hiện của các gen chuyển nạp trên cây không được hoàn toàn, tạo ra các thể khảm gây khó khăn cho việc phân tích và thu nhận cây chuyển gen sau này. Sự thu nhận cây chuyển gen tái sinh qua con đường sinh phôi thể hệ từ các tế bào sinh phôi là các phương pháp được ưu chuộng hiện nay (Chen và ctv, 2000).
LỜI CẢM TẠ Tôi chân thành cám ơn : Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Ban Giám đốc Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long TS. Trần Thị Cúc Hòa, trưởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Các anh chị tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Các bạn trong lớp Công nghệ sinh học 27 và ngoài lớp đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong thời giam học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Con xin tỏ lòng biết ơn to lớn đối với ba mẹ và gia đình đã lo lắng, nuôi con ăn học đến ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 NGÔ VIỆT DUY iii TĨM TẮT NGƠ VIỆT DUY, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BƠNG VẢI COKER 312 VÀ VN36P BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ”. Giáo viên hướng dẫn: TS. TRẦN THỊ CÚC HỒ Bơng vải là một trong những cây trồng quan trọng ở nước ta. Với sự phát triển của cơng nghệ sinh học, các gen mong muốn có thể chuyển vào cây bơng vải nhằm nâng cao năng suất, chất lượng xơ cũng như khả năng kháng sâu bệnh bằng các phương pháp khác nhau trong đó phương pháp chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng phổ biến nhất. Trong qui trình chuyển nạp gen vào cây trồng, hệ thống chọn lọc thơng thuờng nhất là dùng các chất kháng sinh làm tác nhân chọn lọc. Việc chuyển nạp gen đánh dấu chọn lọc kháng chất kháng sinh vào cây trồng để sử dụng chất kháng sinh làm tác nhân chọn lọc đã gây nên những lo ngại về tính an tồn sinh học của cây biến đổi gen. Gần đây để khắc phục nhược điểm này, hệ thống chọn lọc mới bằng mannose đã được nghiên cứu để thay thế hệ thống chọn lọc dùng các chất kháng sinh. Mục đích khóa luận này nhằm nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bơng vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trong đó chủ yếu nghiên cứu hiệu quả của hệ thống chọn lọc bằng mannose, vì đây là hệ thống chọn lọc mới ở cây bơng vải. Trong khố luận này, vắc tơ (vector) pManCa đã được thiết kế mang gen đánh dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus. Mơ khởi đầu dùng để ni cấy là các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 – 7 ngày tuổi. Thanh lọc mannose được thực hiện qua 3 vòng. Kết quả thu được như sau: Qua 2 vòng chọn lọc trên mơi trường mannose, số mẫu mơ sẹo sống sót vẫn đạt tỷ lệ cao ở cả mẫu đốI chứng khơng chuyển nạp gen. Đến vòng chọn lọc thứ 3, khi số mẫu mơ sẹo được tách nhỏ, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu mơ sẹo sống sót ở giống Coker 312 là 10,4% và ở giống VN36P là 13,6%, so với mẫu đối chứng (khơng chuyển nạp gen) có 0% tỷ lệ mẫu mơ sẹo sống sót. Điều này cho thấy hệ thống chọn lọc mannose có hiệu quả trong thanh lọc chuyển nạp gen. Kết quả cho thấy giống bơng Việt Nam VN36P cho hiệu quả cao trong ni cấy mơ như giống bơng đối chứng quốc tế Coker 312. Giống bơng VN36P có thể được lưu ý trong chương trình tạo giống bơng Việt Nam biến đổi gen. Để hồn thiện qui trình chọn lọc mannose đối với bơng vải cần tiếp tục nghiên cứu thêm về các mức liều lượng đường mannose và glucose ở mỗi vòng thanh lọc và thời gian chọn lọc để nâng cao hiệu quả chọn lọc, giảm thiểu điều kiện cho hiện tượng thốt mẫu. iv ABSTRACT NGO VIET DUY, Nong Lam University. August 2005. “STUDY ON THE ABILITY OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON CULTIVARS, COKER 312 AND VN36P BY USING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ”. Supervisor: Dr. Tran Thi Cuc Hoa Cotton is an important crop in Vietnam. With the development of biotechnology, genes of interest can be engineered into the cotton plant to increase yield, fiber quality and the ability to resist insect pests as well, using different methods of transformation, of which Agrobacterium tumefaciens-mediated method is most popular. In the procedure of plant transformation, the most common selection system was the use of antibiotics as selective agents. The transfer of gene for antibiotic resistance into plants to allow the use of antibiotics as selective agents has cause concerns on biosafety of transgenic plants. Recently to overcome this shortcoming, a new selection system using mannose was studied to replace the selection system using antibiotics. The objectives of this assignment were to study the ability of gene transformation of two cotton cultivars, Coker 312 and VN36P by using Agrobacterium tumefaciens, in which the focus was to study the use of mannose selection because this selection system is new for gene transformation of cotton. In this study, the vector, pManCa harboring the selective marker gene, pmi (to allow the use of mannose for selection) and the gene gus was used for transformation. The explants were hypocotyl segments isolated from 5-7 day old seedlings in vitro. Three selection cycles with mannose were done. The results obtained from this study are summarized as follows. After 2 cycles of selection with mannose, the survival percentage of callus samples in the selective medium were still high, both in the check (non-transformed) and transformed samples. At the third cycle of selection, when the calli were separated into smaller pieces, the results of selection showed that the survival percentage of sample were 10.4% for Coker and 13.6% for VN36P as compared to the non-transformed samples which showed 0% of survival. This indicated that mannose selection system was efficient in cotton transformation. The results showed that the Vietnamese cotton VN36P gave high efficiency in tissue culture as the international variety, Coker 312. The variety, VN36P should be given an attention in the breeding program of Vietnamese transgenic cotton varieties. To perfect the procedures of mannose selection system, studies should be done further to investigate the mannose concentrations in each cycle of section, duration of section to increase the selection efficiency and minimize the escape cases during selection process. v MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm Tắt iv Abstract .v Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt .viii Danh sách các hình ix Danh sách các bảng .x 1.MỞ ĐẦU .1 1.1. Đặt vấn đề .1 1.2. Mục tiêu của khóa luận .3 1.3. Hạn chế của khóa luận 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Sơ lược về Cây bông vải .4 2.1.1. Vị trí và phân loại 4 2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố 4 2.1.2.1. Loài Gossypium arboreum .4 2.1.2.2. Loài Gossypium hirsutum .4 2.1.2.3. Loài Gossypium barbadense 5 2.1.2.4. Loài Gossypium herbaceum .5 2.1.2.5. Loài Gossypium tricuspidatum .5 2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam 5 2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên Thế Giới .7 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải .9 2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 11 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .11 2.3.2. Ti-plamid 12 vi 2.3.2.1. Chức năng của T-DNA .12 2.3.2.2. Chức năng của gen Vir 14 2.3.2.3. Cơ chế lây nhiễm 16 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 3.1. Nội dung nghiên cứu .18 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện 18 3.3. Vật liệu nghiên cứu .18 3.4. Phương pháp nghiên cứu .18 3.4.1 Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy 18 3.4.2 Quy trình chuyển nạp gen 20 3.4.2.1. Nguồn Plasmid .20 3.4.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn .20 3.4.2.3. Lây nhiễm .20 3.4.2.4. Thanh lọc .21 3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi 22 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .23 4.1. Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 23 4.2. Tỷ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần thanh lọc .27 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .33 5.1. Kết luận .33 5.2. Đề nghị 33 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .34 7. PHỤ LỤC 39 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP: Adenosine 5’- monophosphate ATP: Adenosine 5’- triphosphate AS: Acetosyringone Bp: base pair CaMV35: Cauliflower mosaic virus ctv: cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleotic acid GUS: enzyme β-glucuronidase ha: hecta kb: kilobase lacZ: gen β-galactosidase LB: Left border Mb: megabase MS: Murashige and Skoog MSCo: MS co-culture medium MSS: MS selection OD 600 : optical density at 600 nm Ori: origin of replication PEG: polyethylene glycol PMI: Enzyme Phosphomannose isomerase pmi: gen pmi plasmid Ti: tumour inducing plasmid RB: Right border T-DNA: transferred DNA Vir: gen vir Vir: virulence 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid v/v: volume/volume w/v: weight/volume viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Khối u do Agrobacterium tumefaciens gây ra trên thực vật 11 Hình 2.2. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây .16 Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA .17 Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây .17 Hình 3.1. Hạt bông vải sau khi tách vỏ và cấy vào môi trường nãy mầm 19 Hình 3.2. Cây mần in vitro 5 ngày tuổi .19 Hình 3.3. Sơ đồ vector pManCa mang gen pmi và gen gus 20 Hình 4.1. Mẫu cấy giống Coker 312 sau khi lây nhiễm trên môi trường MSCo 23 Hình 4.2. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1 .24 Hình 4.3. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 2 .24 Hình 4.4. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 .25 Hình 4.5. Mẫu cấy giống VN36P sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 25 Hình 4.6. Mẫu cấy giống Coker 312 chết trên môi trường thanh lọc lần 3 .26 Hình 4.7. Khối mô sẹo giống Coker 312 sau khi thanh lọc lần 3 .26 Hình 4.8. Mô sẹo giống VN36P được tách nhỏ trên môi trường thanh lọc lần 3 .27 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam trong những năm qua .7 Bảng 2.2. Mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới năm 2001- 2002 8 Bảng 2.3. Mười nước có sản lượng bông cao nhất thế giới năm 2001 – 2002 .9 Bảng 3.1. Nồng độ đường mannose và glucose ở các lần thanh lọc .21 Bảng 4.1. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống Coker 312 27 Bảng 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống VN36P .28 Bảng 4.3. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống Coker 312 .28 Bảng 4.4. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống VN36P .29 Bảng 4.5. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 trên giống Coker 312 30 Bảng 4.6. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 3 trên giống VN36P .30 Bảng 4.7. Tỉ lệ mẫu sống sót sau khi tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc trên môi trường thanh lọc lần 3 trên giống Coker 312 31 Bảng 4.8. Tỉ lệ mẫu sống sót sau khi tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc trên môi trường thanh lọc lần 3 trên giống VN36P .31 x . Tháng 8/2005. “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BƠNG VẢI COKER 312 VÀ VN36P BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ”. Giáo vi n hướng dẫn:. gen của hai giống bơng vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trong đó chủ yếu nghiên cứu hiệu quả của hệ thống chọn lọc bằng