NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

NS hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm. Trong tự nhiên, NS phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn

THƯ VIỆN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH  VÕ THỊ BÍCH VÂN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT MÃ SỐ: 06-005 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS: TRẦN THANH THỦY TP Hồ Chí Minh 2010 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người tận tình dẫn tơi suốt q trình xây dựng đề cương hồn thành luận văn Cơ động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban chủ nhiệm thầy Khoa Sinh Phịng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tơi thời gian thực luận văn Xin gởi lời cảm ơn đến Phịng Khoa học Cơng nghệ- Sau đại học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, tạo điều kiện thuận lợi để luận văn hoàn thành tiến độ Xin gởi lời cảm ơn đến thầy cô, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp người thân gia đình tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn MỞ ĐẦU NS hay cịn gọi nấm mốc, phát triển nhanh nhiều nguồn chất hữu gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm Trong tự nhiên, NS phân bố rộng rải tham gia tích cực vào vịng tuần hồn vật chất, trình phân giải chất hữu hình thành chất mùn Một đặc điểm bật NS có hệ enzym ngoại bào phong phú Trong đó, protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất nhờ protease chúng có tính chất bền vững cao có khoảng pH hoạt động rộng so với protease từ động vật, thực vật vi khuẩn [22] Trong thể động vật, thực vật trình tổng hợp enzym thường gắn liền với yêu cầu sống thể Vì vậy, muốn thu enzym cần phải phá bỏ tổ chức đó, nguồn thu enzym thường phải tươi trình thu enzym phải lệ thuộc vào điều kiện tự nhiên Bên cạnh đó, thời gian thu họach dài làm cho việc sử dụng động vật, thực vật để sản xuất enzym không kinh tế không đáp ứng nhu cầu ngày cao enzym người Hiện tương lai gần, NS đối tượng quan trọng nhất, kinh tế sản xuất enzym qui mơ cơng nghiệp vì: - Chúng có hệ enzym vơ phong phú với hoạt tính cao sinh vật khác - Tốc độ sinh trưởng, phát triển nhanh nên sản xuất lượng lớn enzym thời gian ngắn - Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền nuôi cấy NS sinh enzym - Việc tinh chế thu enzym ngoại bào thường dễ dàng với mức chi phí thấp Các enzym từ NS sử dụng rộng rải CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước chấm…), CN enzym (sản xuất amylaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối NS để phục vụ chăn nuôi dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng NS để xử lý ô nhiễm MT [4] Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ NS đồng thời hạn chế tác hại NS gây ra, người tập trung nghiên cứu vấn đề liên quan đến NS Trước đây, nhà nghiên cứu thường tập trung tìm hiểu NS phân bố đất liền Những năm gần đây, người nhận thấy hết tầm quan trọng hệ sinh thái RNM - HST có suất sinh học cao HST Với điều kiện sinh thái RNM người nghiên cứu khả chịu đựng phục hồi tổ hợp gen Từ đây, tìm chủng NS có hệ gen bền vững, mang nhiều đặc tính có lợi cho người Hệ sinh thái RNM Cần Giờ nơi lưu trữ nguồn gen sinh vật q hiếm, bền vững có khả chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt Đây nơi có hệ VSV vơ phong phú đa dạng NS, vi khuẩn, xạ khuẩn …., NS chiếm số lượng lớn Có thể thấy RNM Cần Giờ kho dự trữ chủng NS có hoạt tính enzym cao chưa khai thác Thảm thực vật hệ động vật có RNM Cần Giờ thật nguồn thức ăn tốt cho VSV sống RNM đặc biệt hệ NS NS có khả tiết hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có cây, thân RNM thành glucose để sử dụng Ngồi ra, NS cịn sinh loại enzym khác protease, amylase, kitinase… phân hủy xác, vỏ tôm, cua, ốc, xác chết loài động vật khác thành chất dinh dưỡng chúng hấp thu Vậy hệ NS mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn, nhân tố khơng thể thiếu chu trình chuyển hóa vật chất RNM Cần Giờ Ở Việt Nam cơng trình nghiên cứu NS sinh protease nhiều tập trung đất liền Các cơng trình khoa học thức nghiên cứu NS sinh protease từ RNM Cần Giờ có song cịn nhiều hạn chế Để góp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt khu hệ NS tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả sinh enzym protease số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Mục tiêu đề tài: Phân lập tuyển chọn chủng NS có khả sinh protease cao từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh Nhiệm vụ đề tài - Phân lập NS từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh -Tuyển chọn chủng NS có hoạt tính protease cao - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân loại chủng NS chọn - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tổng hợp protease chủng NS từ xác định động thái q trình tổng hợp protease chủng NS nghiên cứu - Nghiên cứu số đặc điểm chế phẩm protease thô từ NS - So sánh hoạt độ enzym chủng NS nghiên cứu với chế phẩm enzym thị trường Thời gian, địa điểm làm đề tài - Thời gian: từ tháng 9/2008- 7/ 2009 - Địa điểm thí nghiệm: PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh Huyện Cần Giờ tiếp cận với biển Đông hữu khu RNM đan xen với hệ thống sông rạch dày đặc chứa đựng HST mang tính đa dạng sinh học cao với nhiều loài động thực vật đặc hữu miền duyên hải Việt Nam Đó khu RNM Cần Giờ nằm gọn địa giới huyện Cần Giờ rừng Sác huyện Nhơn Trạch tỉnh Đồng Nai Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ hình thành hạ lưu sơng Đồng Nai – Sài Gịn nằm cửa ngõ Đơng Nam thành phố Hồ Chí Minh Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Tổng diện tích Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ 75.740 ha, đó, vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, vùng chuyển tiếp 29.880 RNM Cần Giờ giới hạn đoạn sơng, rạch, tắc sơng Sồi Rạp, sơng Vàm Sát, rạch Đơn, tắc An Nghĩa, sơng Lịng tàu, tắc Rổi, sông Đồng Tranh, tắc Nước Hội, sông Thị Vải, sơng Gị Gia , sơng Cái Mép biển Đông, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đông sang Tây dài 30km Thổ nhưỡng phát triển đầm mặn mới, phù sa sơng Sài Gịn sông Đồng Nai mang đến lắng đọng tạo thành đất Đất Cần Giờ cấu tạo trình trầm tích sét, q trình phèn hố q trình nhiễm mặn Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm chịu chi phối qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa mưa nắng rõ rệt Lượng mưa: thấp TP Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường tháng kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng tháng [35] - Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt ngày từ – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35] - Độ ẩm khơng khí: cao nơi khác TP Hồ Chí Minh Mùa mưa độ ẩm từ 79 – 83%, mùa khô độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm vào tháng 9, khô vào tháng [36] - Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn hai lần nước rịng ngày Các tháng có đỉnh triều cực đại tháng 10 tháng 11, đỉnh triều thấp tháng tháng [36] - Độ mặn: trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực lên đến 18% lớn triều cường nhỏ triều Nước mặn xâm nhập sâu vào tháng bị đẩy xa vào tháng tháng 10 [13] * Khu hệ thực vật Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ có 150 lồi TV, lồi chủ yếu bần trắng, mấm trắng, quần hợp đước đôi - bần trắng sú, ổi, trang, đưng v.v… loại nước lợ bần chua, quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng v.v… Thảm cỏ biển với loài ưu Halophyla sp., Halodule sp., Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, loại đậu, dừa vườn ăn trái [34] * Khu hệ động vật Theo khảo sát sơ dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999 cho thấy: + Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống cạn có lồi lưỡng thê, 31 lồi bị sát, lồi có vú Trong có 11 lồi bị sát có tên sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)… [34] + Khu hệ chim có khoảng 130 lồi thuộc 47 họ, 17 Trong có 51 lồi chim nước 79 lồi khơng phải chim nước sống nhiều sinh cảnh khác [35] Phân vùng khu dự trữ sinh Cần Giờ: Tổng diện tích khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ 75.740 ha, vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 vùng chuyển tiếp 29.880 [35] * Khu hệ VSV - Vi khuẩn VK với nấm tạo nên thành phần quan trọng hệ sinh thái RNM Là SV phân huỷ, chúng đóng vai trị trung tâm mặt chức HST Số lượng VK RNM chiếm tỉ lệ cao, đặc biệt trầm tích quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước mặt, quần thể bùn lớn gấp vài lần cát [34] Nhiều loài sống giá thể bề mặt rắn chất nhầy dính bám Do đó, VK tạo nên bề mặt mỏng mặt bùn tạo điều kiện cho loài tảo, cỏ biển ngập mặn phát triển - Nấm Khu hệ nấm RNM nhiều đa dạng Phần lớn vi nấm, có số lồi có kích thước lớn Nấm đóng vai trị quan trọng RNM, với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác TV (Fell cộng 1975) Người ta phân loại nấm dựa môi trường RNM: tán cây, thân, rễ hô hấp đất, có số lồi sống từ hai MT trở lên [33] Nấm đóng vai trị quan trọng HST NS tham gia chu trình sinh địa hóa nhiều lưới thức ăn Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy vật chất hữu thành phân tử vơ cơ, sau chất đồng hóa TV hay SV khác [46] Bản thân NS từ RNM trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài ĐV nhỏ ấu trùng số loài (Odum, 1980; Alongi, 1989) VSV RNM ngồi VK NS cịn có nấm men, xạ khuẩn,… chúng đóng vai trị quan trọng chu trình tuần hồn vật chất hệ sinh thái nơi Chúng tham gia bảo vệ MT sinh thái RNM nói riêng MT sinh thái nói chung, vai trị to lớn mối quan hệ sinh học lồi SV Từ đó, đóng góp vào việc giữ cân cho HST đặc biệt  Vai trò RNM Một số lồi TV RNM xếp vào nhóm cơng dụng chủ yếu: 30 loài cho gỗ, than, củi, 14 loài cho tannin, 24 loài làm phân xanh, 21 loài dùng làm thuốc, loài chủ thả kiến cánh đỏ, 21 lồi cho mật ni ong, loài cho nhựa để sản xuất nước giải khát [2] Ngồi ra, RNM cịn có nguồn tài nguyên ĐV phong phú loài lưỡng cư, 22 lồi bị sát, 67 lồi chim, 21 lồi thú,… Các SV nước phong phú gồm 64 loài cá thuộc 35 họ, 25 lồi tơm, 66 lồi TV phiêu sinh, 26 loài ĐV phiêu sinh 22 loài ĐV đáy [2] Ngoài nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu Hệ sinh thái RNM phát đất RNM có vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) chủng NS Paecilomyces farinosUIs Các loại vi sinh vật tạo protein tinh thể độc, có khả tiêu diệt số lồi trùng gây hại cho người động thực vật lồi sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti muỗi Culex quinquefasciatus gây bệnh chân voi Bên cạnh giá trị lâm sản than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM cịn đóng vai trị quan trọng việc điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở q trình xâm thực bờ biển RNM cung cấp chất hữu để tăng suất cho vùng ven biển, nơi sinh sản ươm ni nhiều lồi hải sản có giá trị kinh tế cao tôm, cua, cá,… Mặt khác, RNM cịn có tác dụng làm chậm dịng chảy phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao sóng triều cường Hạn chế tác hại sóng thần bão lớn, hạn chế xâm nhập mặn bảo vệ nước ngầm RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối MT, làm MT nước có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất [4][18] 1.2 Sơ lược veà NS RNM Cần Giờ 1.2.1 Vị trí phân loại Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota Eumycota Eumycota bao gồm ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina, Ascomycotina Basidiomycotina [41] Ngành phụ Deuteromycotina chia theo lớp: [42 ] + Blastomycetes: Khuẩn ty không phát triển phát triển yếu; dạng thể giống nấm men có nảy chồi + Hyphomycetes: Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục sinh BT cuống, khơng có tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT + Coelomycetes: Khuẩn ty thật, BT tập trung túi BT cụm cuống BT: Lớp Hyphomycetes chia thành bộ: Moniliales, Melanconiales Sphaeropsidales Theo C J Alexopoulos (2002), nấm có phần giới nấm, giới Stramenopila (một giới bao gồm SV có cấu trúc lơng roi tách từ protista) giới Protista Giới nấm có ngành: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota Phần nấm giới Stramenopila có ngành: Oomycota, Hyphochytriomycota, Labryrinthulomycota Bốn ngành khác nấm xem SV nguyên sinh giới protista: Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota, Myxomycota Lý phân chia từ chứng nghiên cứu rRNA hoá sinh học Các chứng chứng minh tồn nhóm nấm khác Gần đây, sau hệ thống phân loại giới xuất hiện, giới nấm tái cấu trúc xếp lại Tất phần giới khác tập hợp lại giới nấm Các nhà nấm học phân chia giới thành hai phần: nấm giả, bao gồm ngành: Oomycota, Hyphochytridiomycota, Labyrinthulomycota, Plasmodiophoromycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota Myxomycota nấm thật phần cịn lại [43] 1.2.2 Hình thái, cấu trúc Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn Ngược lại, nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách Sợi nấm khơng vách ngăn mang nhiều nhân gọi đơn bào Ở nấm khơng vách ngăn vách ngăn hình thành thể sinh sản phận sợi nấm bị thương tổn Đó loại vách ngăn liền, khơng có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ thể [5] Sợi nấm có vách ngăn thể đa bào Mỗi tế bào có nhân nhiều nhân Tuy nhiên, sợi nấm nhiều tế bào hợp thành mà vách ngăn tách sợi nấm thành nhiều tế bào Vách ngăn ngang hình thành từ thành tế bào Lúc đầu gờ nhỏ hình khun tiến dần vào lấp kín lại Tuy nhiên, vách ngăn thường có hay nhiều lỗ thủng Các lỗ có kích thước hay có lỗ lớn nhiều lỗ nhỏ xung quanh Hình 1.1: Sợi nấm có vách ngăn sợi nấm khơng có vách ngăn Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên chứa chất nguyên sinh chuyển động, đường kính 1-30µm (thơng thường 5-10 µm) Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón khơng tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần sợi nấm Phần chất ngun sinh khơng có nhân chứa quan tử Tiếp đến phần tăng trưởng chứa nhiều nhân, nhiều quan tử nhiều enzym Đây phần định tăng trưởng phân nhánh sợi nấm Dưới phần thành cứng - phần thành thục sợi nấm Bắt đầu từ phần trở xuống chấm dứt tăng trưởng sợi nấm [4] [44] Nhân tế bào bao bọc màng nhân, màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, nhân có hạch nhân (nucleolus) Trong tế bào nấm cịn có ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle), thể golgi [4], giọt lipid, tinh thể (chrystal) vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), thể vơrơnin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể chitơ đường kính 40-70 nm (chitosome)… Ngồi tế bào chất cịn có vi quản rỗng ruột, đường kính 25 nm (microtubule), vi sợi đường kính 5-8 nm (microfilament), thể màng biên (plasmalemmasome) Không bào Nhân Vách tế bào Màng tế bào Thể golgi Ti thể Luới nội chất (a) Cấu tạo phần sợi nấm Nhân (b) Cấu trúc sợi nấm Hình 1.2: Cấu tạo phần cấu trúc sợi Ribosome nấm thuộc loại 80S đường kính khoảng 20-25nm, gồm tiểu phần: tiểu phần lớn 60S tiểu phần nhỏ 40S [45] Phần lớn sợi nấm có dạng suốt, số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ Sắc tố số nấm cịn tiết ngồi MT làm đổi màu khu vực có nấm phát triển Một số nấm cịn tiết chất hữu tạo nên tinh thể bề mặt KL Vì BT nấm thường có màu nên KL thường có màu Ngồi đặc điểm chung NS từ RNM cịn có đặc trưng riêng đáng quan tâm cần có nhiều cơng trình nghiên cứu đối tượng lý sau: Ở MT sống khắc nghiệt, kiểu trao đổi chất chúng khác biệt so với nấm đất liền Do đó, sản phẩm trao đổi chất, đặc biệt chất KS mang tính chất khác lạ [14] Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả thích nghi NS từ RNM Do đó, phần lớn NS từ RNM có khả sinh hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm giúp chúng thích ứng với điều kiện sống Điển hình khả sinh nhiều loại enzym, enzym ngoại bào có chức phân giải xác động thực vật thành phần hữu RNM, chất KS độc tố giúp làm tăng khả đối kháng NS trình cạnh tranh MT sống Gần đây, người ta phát nấm biển NS RNM nguồn VSV có tiềm sinh chất KS mới, chống lại VSV nhờn thuốc Sống MT biến động, MT chịu ảnh hưởng chất thải từ đất liền, ô nhiễm tràn dầu…đã tạo cho nấm sợi RNM có chế phản ứng lại với tác động khả sinh tổng hợp hệ enzym phân giải chất độc hại RNM HST chịu nhiều tác động gió bão Sau tác động trên, vấn đề nhiễm điều tránh khỏi, ô nhiễm VSV gây bệnh [13] Nhờ có đặc tính sinh học ... nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt khu hệ NS tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu khả sinh enzym protease số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ? ?? Mục tiêu đề tài: Phân lập tuyển chọn chủng NS có khả sinh. .. Phương khảo sát khả sinh kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh Năm 2001 Nguyễn Quang Huy, Cù Việt Nga, Lưu Thị Bích Thảo, Đặng Thị Cẩm Hà phân lập số chủng NS phân giải... Thanh Thuý nghiên cứu khả phân giải carbuahydro số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ  Một số ứng dụng protease [39], [28] Trong chế biến thực phẩm Trong công nghiệp chế biến thịt, protease