Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH Chuyên ngành : Vi sinh vật Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THANH THỦY TS VÕ THỊ HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh – 2007 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thanh Thủy, TS Võ Thị Hạnh- Người hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tất Thầy Cô Bộ môn Vi sinh đặc biệt cô Tuyến Ths Phương phụ trách phịng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, q Thầy Cơ khoa Sinh học, tồn thể q Thầy Cơ tận tình giảng dạy suốt khóa học Tơi xin gởi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục đào tạo tỉnh An Giang, Trường THPT Vĩnh Trạch – An Giang, người thân gia đình, bạn bè, giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian học Tác giả luận văn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP : Adenozin mono photphat CAP : Cataleolite gene Activator Protein CMCase : Carbomexymethyl cellulase CMC : Carboxymethyl cellulose CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase CBHI : Exoglucanase I CBH II : Exoglucanase II DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic Enzym : Enzyme EG : Endoglucanase EGI : Endoglucanase I EGII : Endoglucanase II IU : Imeasure Unit (đơn vị hoạt độ) KHV : Kính hiển vi KL : Khuẩn lạc MT : Mơi trường PTN : Phịng thí nghiệm PGA : Potato glucose agar RNM : Rừng ngập mặn VSV : Vi sinh vật MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Sự hữu rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ kết 25 năm phục hồi phát triển nổ lực to lớn quyền nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh Vào ngày 21 tháng năm 2000, Ủy ban MAB/ UNESCO công nhận RNM Cần Giờ khu dự trữ sinh Việt Nam [55] RNM Cần Giờ nơi lưu trữ nguồn gen sinh vật q bền vững, có khả chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt Là nơi có hệ VSV vơ phong phú đa dạng nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…., nấm sợi chiếm số lượng lớn Nấm sợi đóng vai trị quan trọng vịng tuần hoàn vật chất lượng hệ sinh thái RNM, nhờ có khả sinh loại enzym ngoại bào cellulase, protease, kitinase, amylase, enzym phân giải dầu… Đặc biệt, enzym cellulase nấm sợi sống RNM sinh lớn Do thảm thực vật dày đặc RNM Cần Giờ nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi cho chủng nấm sợi có khả sinh enzym Enzym cellulase hệ enzym bao gồm loại enzym: C1, Cx, β-glucosidase, có khả hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose Enzym cellulase ứng dụng nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, q trình li trích chất từ thực vật, việc phân hủy phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% số tỷ USD thu từ lượng enzym công nghiệp bán giới gồm enzym cellulase, hemicellulase pectinase Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại lượng lớn nguồn enzym cellulase để giải vấn đề sản xuất xử lý ô nhiễm MT Việt Nam nước nhiệt đới có nông nghiệp phong phú, đa dạng đà phát triển Vì vậy, lượng phế thải nơng nghiệp dồi dào, với cơng nghiệp hóa, đại hóa đất nước, nhiễm MT trở thành nguy thật Thành phần phế thải rắn sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp cellulose Trong đó, RNM Cần Giờ kho dự trữ chủng VSV có hoạt tính enzym cao chưa khai thác Các cơng trình khoa học nghiên cứu khả sinh enzym cellulase chủng nấm sợi RNM Cần Giờ bỏ ngõ Từ sở khoa học thực tiễn gợi ý cho chọn đề tài: “Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Lịch sử vấn đề nghiên cứu  Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase Khả sinh enzym cellulase chủ yếu tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma Aspergillus Ở Mỹ, năm 1983 PTN Quân đội Mỹ Natik trường đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase Sau đó, gây biến chủng chọn lọc biến chủng QM9414 có khả sinh cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74] Năm 1998, YU nuôi cấy T reesei Rut 30 MT chứa 5% bột cellulose 1% cám mì, thu hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68] Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả sinh tổng hợp enzym polygalacturonase, cellulase, xylanase protease từ A niger 3T5B8 nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác phương pháp lên men bán rắn ứng dụng enzym việc tách chiết dầu thực vật [61] Năm 2002, theo báo cáo gần CORAL, dịch nuôi cấy A niger MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát có hai vạch có hoạt tính CMCase trọng lượng phân tử 83.000 50.000 Dalton [67] Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu sinh tổng hợp số đặc tính cellulase (typ CMCase) A niger VS-1 MT lên men bán rắn [40] Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu nấm sợi T reesei sinh tổng hợp enzym cellulase MT lỏng với nguồn cacbon CMC [40] Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22] Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulase A niger Rnnl 363 Châu Hoàng Vũ nghiên cứu thu nhận tinh enzym cellulase từ nấm mốc T reesei phương pháp lên men bán rắn [24], [57] Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả sinh tổng hợp enzym cellulase từ T reesei A niger MT lên men bán rắn [40] Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng pectinase cellulase số chủng nấm mốc [27]  Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM Cho đến nay, giới có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu phân lập phân loại nấm sợi hệ sinh thái RNM Nhưng kết nghiên cứu sơ sài, chưa đáp ứng nhu cầu hiểu biết đa dạng nấm sợi vai trò chúng hệ sinh thái RNM [64] Trước đây, người ta cho điều kiện MT RNM khắc nghiệt, khơng thích hợp cho sinh trưởng phát triển nấm sợi Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy điều kiện sống đặc biệt vậy, đường trao đổi chất nấm sợi khác đường trao đổi chất VSV đất liền Vì vậy, có sản phẩm trao đổi chất có tính chất đặc biệt hơn, khác lạ có enzym, chất kháng sinh …[18] Nhưng đến chưa có cơng trình sâu nghiên cứu hoạt tính sinh học chủng nấm sợi từ RNM Ở Việt Nam, năm 2000 có thơng báo Mai Thị Hằng cs nấm sợi RNM Năm 2002, tác giả tiếp tục nghiên cứu đa dạng, nghiên cứu khả diệt côn trùng khả phân giải cacbua hydro nấm sợi từ RNM hai tỉnh Nam Định, Thái Bình Riêng RNM Cần Giờ có số nghiên cứu phân lập Cho đến nay, chưa có nghiên cứu khả sinh enzym cellulase chủng nấm sợi RNM Cần Giờ [19], [20], [21] Mục đích nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ Đề xuất hướng ứng dụng chủng nấm sợi phân lập Đối tượng nghiên cứu - Hệ sinh thái RNM Cần Giờ - Nấm sợi có khả sinh enzym cellulase RNM Cần Giờ - Enzym cellulase sinh từ nấm sợi Phạm vi nghiên cứu Do hạn chế thời gian nên đề tài nghiên cứu phân lập chủng nấm sợi xã huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã An Thới Đơng, xã Tam Thơn Hiệp, xã Long Hòa, xã Thạnh An, xã Lý Nhơn Sau đó, nghiên cứu số chủng nấm sợi có khả sinh loại enzym cellulase hệ enzym Đề tài thực PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ - Tuyển chọn số chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase cao - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa phân loại chủng nấm sợi tuyển chọn - Nghiên cứu yếu tố MT ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển sinh tổng hợp enzym cellulase chủng chọn - Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào việc phân hủy chất phế thải, góp phần hạn chế nhiễm MT Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ - Phương pháp vi sinh - Phương pháp hóa sinh - Phương pháp thực nghiệm - Phương pháp thống kê toán học Dự kiến cấu trúc Luận văn gồm phần mở đầu, chương phần kết luận kiến nghị trình bày sau: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết bàn luận Kết luận kiến nghị Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ RNM chiếm phần đáng kể kiểu rừng ngập nước, thường tồn vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trên giới khoảng 15 triệu RNM phân bố vùng bờ biển có bùn, cửa sơng lớn, vịnh cạn đầm mặn giáp với biển RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, “lá phổi xanh” thành phố Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sơng, điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi tạo MT phát triển ngành thủy sản Bên cạnh đó, RNM Cần Giờ nơi cung cấp thức ăn, nơi cư trú, sinh sản loài thủy sinh vật động vật có xương sống cạn Hiện nay, Cần Giờ địa điểm du lịch hấp dẫn với 3.000 - 5.000 du khách đến tham quan tuần [83] RNM Cần Giờ có diện tích khoảng 29,380 chiếm 41,18 % đất huyện Cần Giờ [87] Khí hậu nóng ẩm chịu chi phối quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm Nhiệt độ trung bình 25,80C, biên độ nhiệt dao động ngày từ 5-7 0C Chế độ bán nhật triều không Độ mặn dao động 18 ‰ – 30 ‰ [1] Một nghiên cứu cho biết RNM Cần Giờ có 157 lồi thực vật; 63 lồi phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc ngành: Tảo khuê, Tảo giáp, Tảo lam; 100 lồi động vật đáy khơng xương sống tơm, cua, sị ốc Ngồi ra, cịn có 120 lồi cá, có lồi có giá trị kinh tế cao cá Ngát, cá Dứa, cá Chẽm; 31 lồi bị sát cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu nhũ khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng 145 loài chim [83] Đây nguồn thức ăn tốt cho hệ nấm sợi sống RNM Nấm sợi có khả tiết hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có cây, thân RNM thành glucose để sử dụng Ngồi ra, nấm sợi cịn sinh loại enzym khác protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tơm, cua, ốc, xác chết lồi động vật khác thành chất dinh dưỡng chúng hấp thu [1] Hình 1.1 Bản đồ RNM Cần Giờ [83] Vậy, hệ nấm sợi mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn, nhân tố thiếu chu trình chuyển hóa vật chất RNM Cần Giờ Chúng sử dụng chất hữu từ thảm thực vật hệ động vật phong phú làm thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm nhiễm MT RNM Cần Giờ 1.2 Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase Rất VSV có khả sinh tất loại enzym cần thiết để phân giải cellulose dạng tinh thể Chúng phải tiết hệ enzym phức tạp, có khả phân hủy cellulose theo phương thức khác thủy phân, oxy hoá [51], [52] Cellulose bị phân rã tác dụng vi khuẩn háo khí kỵ khí Song khả phân hủy cellulose không nấm, vi khuẩn thường tạo enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp 0,1g/l [51] Cellulase sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn cỏ Ruminococcus albus (Berger 1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp (Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khí Clostridium sp (Parsiegla, 1998) [39], loài xạ khuẩn Streptomyces, Thermomonospora …[51] Nấm sợi nhóm nghiên cứu nhiều lĩnh vực phân hủy cellulose Các enzym cellulase sản sinh từ nấm sợi tạo với nồng độ cao, khơng có dạng vật lý phức tạp cellulase bắt nguồn từ vi khuẩn có tác dụng phân hủy mạnh cellulose Các chi nấm có khả sinh cellulase phổ biến là: Aspergillus, Alternaria tenuis, Celluvirio gilvus, Clasdosporium, Penicillium, Fusarium, Myrotheticum, Trichoderma … [39] 1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm sợi Nấm sợi VSV có nhân chuẩn Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ kitin-glucan, kitozan Hệ nấm sợi cấu tạo sợi nấm (hypha) không vách ngang có vách ngang (septum) Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài tăng trưởng ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay gọi khuẩn ty thể (hình 1.2) Hệ sợi nấm phát triển thành dạng KL khác tùy theo chất rắn, lỏng hay mềm (hình 1.3) KL nấm sợi thường có dạng hình trịn, gần trịn Bề mặt KL mượt, nhẳn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có vết khía xuyên tâm, lồi lõm không Mép KL trơn, cưa… Hình 1.2 Bào tử mọc khuẩn ty [78] Hình 1.3 KL nấm [78] Một số sợi nấm tiết sắc tố vào MT tiết chất hữu kết tinh bề mặt sợi nấm Các đặc điểm hình thái khác có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng lồi [78] Phương thức dinh dưỡng nấm hấp phụ qua màng, khơng có quan tiêu hóa, khơng có khả quang hợp Đa phần thể hoại sinh, số kí sinh, số gây bệnh người động thực vật [18] Nấm sợi sinh sản chủ yếu bào tử, bào tử hình thành theo kiểu vơ tính hữu tính Bào tử vơ tính Bao gồm động bào tử, bào tử trần, bào tử kín Bào tử trần dạng bào tử phổ biến Hình 1.4 Các dạng bào tử trần nấm sợi [78] Phụ lục Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Hàm lượng glucose (mg/ml) Chủng A guamensis P oxalicum Chủng Tỉ lệ nguồn nitơ Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại Cao thịt 40 0,672 0,000 1,032 Cao nấm men 20 0,2214 0,000 0,372 Pepton 20 0,2895 0,000 0,490 NH4NO3 60 1,268 0,000 1,801 (NH4)2SO4 10 0,2248 0,000 0,378 Cao thịt 20 0,1466 0,000 0,242 Cao nấm men 30 0,847 0,000 1,274 Pepton 40 1,301 0,001 1,892 NH4NO3 1,511 0,002 2,118 (NH4)2SO4 20 0,1287 0,000 0,211 0,672 0,672 0,671 0,2214 0,2214 0,2214 0,2899 0,2893 0,2893 1,267 1,268 1,268 0,2248 0,2248 0,2248 0,1466 0,1466 0,1466 0,847 0,847 0,848 1,301 1,301 1,302 1,511 1,511 1,512 0,1287 0,1287 0,1287 1,032 1,032 1,032 0,372 0,372 0,372 0,491 0,490 0,491 1,800 1,801 1,801 0,378 0,378 0,378 0,242 0,242 0,242 1,273 1,274 1,275 1,892 1,892 1,893 2,108 2,121 2,124 0,211 0,211 0,211 Tỉ lệ nguồn nitơ Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại Cao thịt 20 0,698 0,000 1,106 0,698 0,698 0,698 1,106 1,106 1,106 A fumigatus Cao nấm men 20 0,2277 0,000 0,383 Pepton 10 0,143 0,000 0,236 NH4NO3 10 0,411 0,001 0,699 (NH4)2SO4 10 0,278 0,000 0,467 0,2277 0,2277 0,2277 0,143 0,143 0,142 0,411 0,410 0,411 0,278 0,278 0,278 0,383 0,383 0,383 0,236 0,236 0,235 0,699 0,698 0,699 0,467 0,467 0,467 Phụ lục Ảnh hưởng pH đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Hàm lượng glucose (mg/ml) Chủng A guamensis pH Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 30 0,3791 0,000 0,646 10 0,5032 0,000 0,862 10 0,3647 0,000 0,621 20 0,712 0,000 1,109 20 0,3770 0,000 0,642 10 0,2525 0,000 0,426 10 0,2586 0,000 0,437 10 0,3457 0,000 0,588 20 0,3176 0,000 0,554 10 0,2225 0,000 0,374 0,3791 0,3791 0,3791 0,5028 0,5034 0,5034 0,3647 0,3647 0,3647 0,712 0,712 0,712 0,3768 0,3768 0,3773 0,2525 0,2525 0,2525 0,2588 0,2582 0,2588 0,3457 0,3457 0,3457 0,3176 0,3176 0,3176 0,2225 0,2225 0,2225 0,646 0,646 0,646 0,861 0,862 0,862 0,621 0,621 0,621 1,109 1,109 1,109 0,642 0,642 0,643 0,426 0,426 0,426 0,437 0,436 0,437 0,588 0,588 0,588 0,554 0,554 0,554 0,374 0,374 0,374 pH Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 4 0,3371 0,000 0,573 0,3371 0,3371 0,3371 0,573 0,573 0,573 P oxalicum Chủng 10 0,1425 0,000 0,235 10 0,1397 0,000 0,230 10 1,0512 0,000 0,899 10 0,3558 0,000 0,571 A fumigatus 0,1425 0,1425 0,1425 0,1397 0,1397 0,1397 1,0512 1,0512 1,0511 0,3558 0,3558 0,3556 0,235 0,235 0,235 0,230 0,230 0,230 0,899 0,899 0,898 0,571 0,571 0,570 Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Hàm lượng glucose (mg/ml) Chủng A guamensis Nhiệt độ ( C) Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 25 10 0,7510 0,000 1,192 30 20 1,029 0,001 1,613 40 10 0,2831 0,001 0,479 50 10 0,5024 0,000 0,860 25 0,5321 0,000 0,912 30 0,2622 0,000 0,443 40 20 0,3397 0,001 0,578 50 0,3977 0,001 0,678 0,0750 0,0751 0,0751 1,027 1,029 1,029 0,2824 0,2835 0,2835 0,5022 0,5022 0,5028 0,5321 0,5321 0,5321 0,2622 0,2622 0,2622 0,3399 0,3399 0,3394 0,3981 0,3975 0,3975 1,191 1,192 1,192 1,613 1,613 1,614 0,478 0,480 0,480 0,860 0,860 0,861 0,912 0,912 0,912 0,443 0,443 0,443 0,578 0,578 0,577 0,679 0,678 0,678 Nhiệt độ Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 25 10 0,2080 0,002 0,354 30 10 0,0910 0,001 0,131 40 10 0,5010 0,000 0,858 50 20 0,3434 0,000 0,584 0,2080 0,2081 0,2080 0,0910 0,0911 0,0910 0,5010 0,5010 0,5010 0,3434 0,3434 0,3434 0,352 0,354 0,352 0,132 0,129 0,132 0,858 0,858 0,858 0,584 0,584 0,584 P oxalicum Chủng A fumigatus Phụ lục Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Hàm lượng glucose (mg/ml) Chủng A guamensis Độ ẩm (%) Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 50 10 1,000 0,001 1,696 55 30 0,3664 0,003 0,624 60 10 0,4594 0,000 0,786 65 0,1938 0,000 0,324 70 40 0,913 0,000 1,139 50 10 0,3119 0,000 0,529 55 10 0,3817 0,000 0,651 60 10 0,2381 0,000 0,401 65 10 0,2766 0,000 0,468 70 20 0,2969 0,000 0,503 1,001 1,000 0,999 0,3635 0,3676 0,3681 0,4591 0,4596 0,4596 0,1938 0,1938 0,1938 0,910 0,913 0,913 0,3117 0,3117 0,3123 0,3814 0,3819 0,3819 0,2381 0,2381 0,2381 0,2766 0,2766 0,2766 0,2968 0,2968 0,2973 1,696 1,694 1,691 0,619 0,626 0,627 0,785 0,786 0,786 0,324 0,324 0,324 1,138 1,139 1,139 0,529 0,529 0,530 0,650 0,651 0,651 0,401 0,401 0,401 0,468 0,468 0,468 0,503 0,503 0,504 Độ ẩm Độ pha lỗng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 50 10 0,1311 0,000 0,443 0,1310 0,1311 0,1311 0,441 0,443 0,443 P oxalicum Chủng A fumigatus 55 10 0,3371 0,001 0,573 60 10 0,1868 0,000 0,3022 65 10 0,4591 0,002 0,7818 70 10 0,4256 0,000 0,7982 0,3371 0,3371 0,3370 0,1868 0,1868 0,1868 0,4590 0,4594 0,4594 0,4255 0,4256 0,4256 0,573 0,573 0,571 0,3022 0,3022 0,3022 0,7815 0,7818 0,7818 0,7981 0,7982 0,7982 Phụ lục Ảnh hưởng độ mặn đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Hàm lượng glucose (mg/ml) Chủng A guamensis P oxalicum Chủng Độ mặn Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 0% 0,1788 0,000 0,298 3% 10 0,791 0,000 1,198 5% 10 0,613 0,000 0,960 10% 25 0,2624 0,000 0,443 20% 10 0,5392 0,000 0,924 0% 10 0,0999 0,000 0,161 3% 10 0,098 0,000 0,119 5% 10 0,3802 0,000 0,648 10% 20 0,4115 0,002 0,702 20% 0,1034 0,000 0,167 0,1788 0,1788 0,1788 0,791 0,791 0,791 0,613 0,613 0,613 0,2622 0,2628 0,2622 0,5390 0,5390 0,5396 0,0999 0,0999 0,0999 0,098 0,098 0,098 0,3802 0,3802 0,3802 0,4113 0,4113 0,4119 0,1034 0,1034 0,1034 0,298 0,298 0,298 1,198 1,198 1,198 0,960 0,960 0,960 0,443 0,444 0,443 0,924 0,924 0,925 0,161 0,161 0,161 0,119 0,119 0,119 0,648 0,648 0,648 0,702 0,702 0,703 0,167 0,167 0,167 Độ mặn Độ pha loãng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 0% 10 0,054 0,000 0,087 3% 10 0,1623 0,001 0,267 5% 10 1,0642 0,000 0,912 10% 30 0,3060 0,001 0,383 20% 20 0,7804 0,002 0,678 A fumigatus 0,054 0,054 0,052 0,1623 0,1623 0,1624 1,0642 1,0642 1,0642 0,3060 0,3060 0,3061 0,7804 0,7804 0,7802 0,087 0,087 0,086 0,267 0,267 0,269 0,912 0,912 0,912 0,383 0,383 0,385 0,678 0,678 0,675 Phụ lục 10 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Hàm lượng glucose (mg/ml) Chủng A guamensis Thời gian (giờ) Độ pha lỗng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 24 10 0,1524 0,001 0,259 36 10 0,2104 0,000 0,353 48 10 0,4118 0,001 0,702 60 10 0,1820 0,000 0,130 72 20 0,2080 0,001 0,350 24 10 0,5041 0,002 0,858 36 10 0,5241 0,000 0,898 48 10 0,1138 0,001 0,185 60 20 0,107 0,000 0,070 72 20 0,1790 0,001 0,299 0,1524 0,1524 0,1526 0,2104 0,2104 0,2104 0,4118 0,4118 0,4117 0,1820 0,1820 0,1820 0,2080 0,2080 0,2081 0,5041 0,5043 0,5040 0,5240 0,5241 0,5241 0,1138 0,1137 0,1138 0,107 0,107 0,107 0,1790 0,1790 0,1791 0,2597 0,2597 0,2599 0,353 0,353 0,353 0,702 0,702 0,700 0,130 0,130 0,130 0,350 0,350 0,353 0,858 0,861 0,860 0,896 0,898 0,898 0,185 0,182 0,185 0,070 0,070 0,070 0,299 0,299 0,301 Thời gian (giờ) Độ pha lỗng Hàm lượng glucose trung bình Sai số Độ hấp thụ trung bình Hàm lượng glucose ba lần lặp lại Độ hấp thụ ba lần lặp lại 24 30 0,2057 0,000 0,702 0,2057 0,2057 0,2057 0,702 0,702 0,702 P oxalicum Chủng 36 10 0,3142 0,000 0,530 48 10 0,3120 0,000 0,531 60 20 0,3411 0,001 0,580 72 20 0,5032 0,000 0,862 A fumigatus 0,3142 0,3142 0,3141 0,3120 0,3120 0,3120 0,3411 0,3410 0,3411 0,5032 0,5032 0,5031 0,530 0,530 0,529 0,531 0,531 0,530 0,580 0,578 0,580 0,862 0,862 0,860 Phụ lục 11 Hình thái đại thể vi thể số chủng nấm có khả sinh enzym cellulase phân lập từ RNM Cần Giờ (a) (b) Chủng C8a (a) (b) Chủng L1.3 (a) (b) Chủng T1.4 (a) (b) Chủng Đk (a) (b) Chủng Đ24 (a) (b) Chủng (T) (a) (b) Chủng L8 (a) (b) Chủng L6 (a) Hình dạng khuẩn lạc (b) Hình thái vi thể Phụ lục 12 Nấm sợi nuôi môi trường bán rắn (a) (b) (c) (a), (b), (c), (d): Chủng A guamensis nuôi MT bán rắn (d) Phụ lục 13 Bảng tổng hợp 312 chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ Địa điểm lấy mẫu Đất mặt 93 chủng Kí hiệu chủng Đ1- Đ34; ĐB1- ĐB7; Đ’0 – Đ’10; Đ’1.1; Đ’1.2; Đ’1.3; Đ’2.1; Đ’2.2; Đ’0a; Đ’9.1; Đ’9.2; Đ9.1- Đ9.4; Đ10.1; Đ10.2;Đ33.1; Đ33.2; Đ34.1- Đ34.4; Đ30.1; Đ30.2; Đ’5.1; Đ’5.2; Đ’9a; Đ’9b; Đ’9c; Đ’24; Đ’14.1; Đ’14.2; Đ2b, Đ’3; Đ1.1; Đ1.2, Đ15.1; Đ15.2 Đất sâu D9.1; Đ’30.1; Đ’9.2; Đ’9.3, D1, D6; Đ33.3; Đ33.4; Đ34.5; Đ30.3; Đ2.1;Đ2.2; Đ’10;Đ’11; Đ’12; Đ’13; 21 chủng Lá vàng Đ’14, Đ’3a, Đ’9.2a; Đ’9.2b; Đ’9.2c L1; L1.1 – L1.7; L5; L5.1; L5.2; L10; L35; L42; L37; L31;L39; L30; L29; L28; L12; L14; L16; L17; L18;L19; 34 chủng Lá phân L20; L25; L27; L26; L16.1; L16.2; L20.1; L20.2 L2 – L9; L11-L13; L15; L21 – L24; L27; L32-L34; L36L39; L3.1- L3.5; L4.1- L4.5; L6.1- L6.5; L22.1- L22.5; hủy 62 chủng Thân khô L15.1- L15.5; L12.1- L12.4; L13.1- L13.5; L33.1L33.3; L34.1- L34.3; L41.1- L41.9 T1; T1.1- T1.4; T’1.1; T’; T4; T4.1- T4.6; T8; T8.1T8.3; T5; T5.1- T5.4; T11.1; T11.2; T11; T12; T12.1- 39 chủng Thân mục T12.3; T7; T7.1- T7.3; T’7; T’7.1; Tc.3; T’7.2; T’7.3; C1-C34; C1.1- C1.5; C3.1- C3.5; C13.1; C13.2; C15.1; C15.1a; C15.2; C16.1; C16.2; C18.1; C18.2; C2.1-C2.4; 63 chủng C11.1- C11.4; C2a, C3a, C3b; CT10; CT10.1T2-T3, (T); T6; T8- T11; T13.1; T13; T’1.4, T5a; ... đích nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ Đề xuất hướng ứng dụng chủng nấm sợi phân lập Đối tượng nghiên cứu - Hệ sinh thái RNM Cần Giờ - Nấm sợi. .. vụ nghiên cứu - Phân lập chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ - Tuyển chọn số chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase cao - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa phân loại chủng nấm sợi. .. chủng nấm sợi RNM Cần Giờ bỏ ngõ Từ sở khoa học thực tiễn gợi ý cho chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ? ?? Lịch sử vấn đề nghiên cứu