age THU BO GIAO DUC VA DAO TAO
~~ VIEN TRUONG DAI HOC SU PHAM TP HO CHi MINH
Nguyễn Thị Thanh Bình
NGHIEN CUU THU NHAN ENZYM AMYLASE CUA
MOT SO CHUNG NAM SOI PHAN LAP TU RUNG
NGAP MAN CAN GIO
Chuyén nganh: Vi sinh vat hoc
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS TRẦN THANH THỦY
Trang 2LỜI CÁM ƠN
Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến TS Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận văn này
Tôi xin ghi nhớ công ơn tất cả Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh, và trong phòng thí nghiệm Vi sinh — Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành công việc nghiên cứu thực hiện luận văn
Ximm chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học,
Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành
thực nghiệm
Cuối cùng tôi xin gởi lời biết ơn đến Ba Má, hai em và bạn bè đã luôn yêu thương và ủng hộ
tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn
Tp Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010
Trang 3LỚI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những số liệu, kết quả trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bồ trong bắt kì công trình nào khác
Tác giả luận văn
Trang 5MO DAU
Amylase là một loại enzym thủy phân tỉnh bột quan trọng nhất trong công nghệ sinh học Nó
có khả năng phân cắt các liên két a-1,4 glucoside, a-1,6 glucoside cia amylose va amilopectin, làm
tăng tốc độ đường hóa tỉnh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chóng, rút ngắn thời
gian hình thành sản phẩm
Amylase thu nhận từ VSV nói chung, từ NS nói riêng có nhiều ưu điểm nổi bật hơn các loại
amylase từ thực vật và động vật như: hoạt tính enzym cao hơn, khả năng chịu nhiệt cao, thời gian thu enzym nhanh, giá thành rẻ, có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn
giản và rẻ tiền Với những ưu thế nồi trội, NS trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho
ngành công nghiệp sản xuất enzym Do đó, trong vòng 50 năm trở lại đây, các chế phẩm enzym từ NS đã dần thay thế enzym từ động vật Các chủng NS sinh amylase cao như: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus,
Với phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực phẩm, dược phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt nên khối lượng chế phẩm amylase được sản xuất hàng năm trên thế giới lên tới hàng chục vạn tấn và ngày một gia tăng Chính vì vậy, việc tìm kiếm các chủng NS sinh amylase cao luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước Trong quá trình tìm kiếm ấy, con người luôn quan tâm đến NS sống trong các hệ sinh thái đặc biệt
Nằm giữa đất liền và biển cả, RNM Cần Giờ có môi trường sống vốn khắc nghiệt, mang tính cạnh tranh cao, làm tăng khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học giúp SV thích nghỉ tốt với
điều kiện sống Nơi đây lưu trữ, bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá của vùng ven biển nhiệt đới từ thực vật, động vật và cả VSV
Hơn nữa, Việt Nam là nước có nguồn tỉnh bột và phụ phẩm nông nghiệp khá đồi dao là điều kiện thuận lợi để ứng dụng amylase thu nhiều sản phẩm
Có thê nói cho đến nay, sự hiểu biết về khu hệ NS ở RNM và vai trò của chúng trong hệ sinh
thái này còn quá ít và chưa đầy đủ Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn enzym từ các NS,
cũng như mong muốn thu nhận được các chủng NS mang đặc tính quý, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận ensym amylase của một số chúng NS phân lập từ rừng
ngập mặn Cần Giờ”
> Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn và khảo sát được một số chung NS sinh a-amylase va glucoamylase cao từ RNM
Can Gid Tp Hé Chi Minh
> Nhiệm vụ cúa đề tài
Trang 6>
~ Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase các chủng NS phân lập được ~ Tuyển chọn 2 chủng sinh amylase cao tiếp tục khảo sát
- Phân loại đến chỉ các chủng NS đã tuyển chọn
- Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn ~ Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thu nhận amylase
- Thu nhận chế phẩm amylase thô và so sánh với enzym thương mại trên thị trường - Khảo sát các đặc tính sinh học khác
Đối tượng và phạm vỉ nghiên cứu
Đối tượng là các chủng NS phân lập từ các mẫu đắt, thân, lá cây, .ở RNM Cần Giờ
Phạm vi nghiên cứu gồm 5 xã: Bình Khánh, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Long Hòa, Lý
Nhơn thuộc RNM huyện Cần Giờ Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài
- Thời gian: Từ tháng 8/2009 — 7/ 2010
- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học,
Trang 7Chương 1
TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 KHAI QUAT VE RNM CAN GIỜ TP HÒ CHÍ MINH 1.1.1 Đặc điểm các nhân tố sinh thai co ban
RNM Cần Giờ là một hệ sinh thái ngập mặn có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với MT và cộng đồng dân cư địa phương trong vùng Là rừng mới tái sinh nhưng RNM Cần Giờ là Khu
Dự trữ Sinh quyền đầu tiên tại Việt Nam với hệ thực vật và động vật rất phong phú mang tính đa
dạng sinh học cao [34], [39]
Hình 1.1 Rừng ngập man Can Gio
Về vị trí địa lý khu dự trữ sinh quyên RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai — Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp Hồ Chí Minh Tọa d6: 10°22’ — 10°40’ d6 vi
Bắc và 106°46° — 107°01” kinh độ Đông Cách trung tâm Tp Hồ Chí Minh khoảng 70km, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An,
phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa — Vũng Tàu Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35 km, từ Đông sang Tây là 30 km [39]
Ở RNM Cần Giờ, nhiệt độ trung bình là 25,8°C, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 — 7°C Khí hậu nóng ẩm và chịu sự chỉ phối của quy luật gió mùa xích đạo Nhiệt độ không khí có ảnh hưởng khá lớn đến sinh trưởng, phát triển của sinh vat RNM Chapman (1977) cho rang RNM chi phát triển khi biên độ nhiệt ở tháng lạnh nhất cao hơn 20°C, và biên độ đao động theo mùa không
qua 10°C [36], [34], [39]
Trong các nhân tố khí hậu ở RNM thì lượng mưa là nhân tố quan trọng Ở đây, mùa mưa từ
tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4 Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400 mm
Trang 8khô là 74 — 77%; ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4 Lượng nước bốc hơi bình quân 4mm/
ngày va 1204mm/thang [34]
Ngoài ra, gió cũng là nhân tố tác động tới sự phân bố của thực vật RNM qua sự ảnh hưởng tới độ thoát hơi nước và tác động tới sự phát tán bào tử VSV [36]
Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá, quá trình nhiễm
mặn đồng thời nó được phát triển trên một đầm mặn mới do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai mang đến lắng đọng tạo thành nền bùn ngập mặn
Độ mặn của nước ở Cần Giờ phụ thuộc rất nhiều yêu tố như gió mùa, thuỷ triều, mưa, nước
dâng và đặc biệt chịu ảnh hưởng rõ rệt từ nguồn nước ngọt ở thượng nguồn chảy xuống (do hoạt động của hồ Trị An, Dầu Tiếng ) đã làm thay đổi qui luật hoạt động nhiễm mặn ở Cần Giờ Độ
mặn nơi đây dao động 1,8 — 3%
Độ mặn là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tỉ lệ sống của các loài cây ngập
mặn và phân bố của RNM Hầu hết cây ngập mặn sinh trưởng tốt ở nước có độ mặn từ 25% đến
50% độ mặn nước biển Nhiều ý kiến cho rằng, muối là nhân tố quan trọng, tác động thông qua quá
trình chọn lọc tự nhiên thích nghi, tạo điều kiện để cây ngập mặn tồn tại, phát triển [36]
RNM Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển Đông Mỗi tháng
có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch Mực
nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [39] Chế độ bán nhật triều với biên độ triều cao là một trong những nhân tố thuận lợi cho RÌNM sinh trưởng so với vùng có nhật triều Các dòng hải lưu ở đây là nhân tố chính giúp phát tán quả, hạt, trụ mầm
và SV dọc theo các vùng ven biển
1.1.2 Đặc điểm cúa các khu hệ SV tại RNM Cần Giờ
RNM Cần Giờ có hệ SV vô cùng đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài đem lại
những giá trị kinh tế cao
Về thực vật: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 150 loài thực vật, các loài chủ yếu như Bần trắng, Mắm trắng, các quần hợp Đước đôi - Bần trắng cùng Xu, Ôi, Trang,
Đưng Các loại cây nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm — ôrô, dừa lá, ráng Thảm cỏ
biển với các loài ưu thé Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp [66]
Động vật: bao gồm động vật thủy sinh không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên 130 loài, 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (Gekko gekko), ky đà nước (Varanus salvator), tran dat (Python molurus), tran gam (Python reticulatus) Khu hé chim cé khoang 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ [66]
Trang 9Vi sinh vật rất đa dạng gồm có: vi khuẩn, nam, tảo
e Vi khuẩn
VK cùng với nắm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM Là những SV phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong hệ sinh thái này Số lượng VK trong rừng ngập mặn chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thé VK di dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, cdc quan thê trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát Nhiều
loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám Do đó, VK có thé tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển [36]
e¢ Nấm
Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng, phần lớn là vi nắm, chỉ có một số loài có kích
thước lớn Nắm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh
xác lá thực vật (Fell và cộng sự, 1975) Người ta có thể phân loại nắm dựa trên môi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hô hap và trong dat, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai
MT trở lên [36]
Người ta tim thấy trên lá cây ngập mặn có các loài nắm ký sinh và hoại sinh nhu: Ascomycetes,
Bacidomycetes và Deufteromycetes Người ta đã tìm thây 6 chỉ nắm có mặt trên lá cây Đước đỏ (Ñ mangle) khi con trén cay: Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium va Aureobacidium [36]
Các chỉ nắm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây
chu nhu: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium va Cercospora Hau hét các loài nẫm trên đất liền
đều có trên lá cây ngập mặn, còn các loài nắm biển thì có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước
mặn Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nắm phân huỷ phát triển Các mẫu gỗ để ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao [36]
Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là sinh vật phân huỷ đầu tiên nhờ khả năng phân giải
cellulose, lignin Fell và Masters (1973) đã nghiên cứu toàn bộ quá trình phân hủy của lá cây ngập
mặn đồng thời phân lập được 66 chỉ nấm, đại diện là các chỉ Phycomycetes, Thraustochytrium,
Aspergillus, Penicillium, Tricoderma, Fusarium Đa số các loại nâm được phân lập trên lá, gỗ và cây con thường là nắm hoại sinh góp phần phân huỷ xác thực vật Chúng còn góp phần phân huỷ cỏ
biển, bùn và đầm lầy mặn Những loài này chịu được điều kiện mặn của RNM [36]
e Tao
Tảo mọc ở RNM thường làm thành lớp phủ màu hồng, nâu hoặc lục nhạt phát
Trang 10loài tảo silic trên mặt bùn quần xã RNM; Chúng không hình thành trên các vùng rõ rằng mà tùy
thuộc vào độ ngập triều [36]
Tảo bùn có tầm quan trọng trong kinh tế đất vì nó làm tăng hàm lượng hữu cơ trong đất nhờ quá trình quang hợp Tảo còn tạo ra độ thoáng khí giữa các hạt đất, tiết ra các chất nhay hinh thanh phức hệ keo, tảo xanh lục dị dưỡng làm tăng hàm lượng đạm cho đất nhờ khả năng cố định đạm [36]
Cac SV trong RNM làm nên sự đa dạng sinh học của các quần xã RNM, chúng là một mắt
xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thé thiếu trong chu trình chuyển hóa vật
chất ở RNM Cần Giờ
1.1.3 Vai trò của RNM đối với hệ sinh thái
RNM có liên quan mật thiết với các đầm lầy mặn, các bãi bùn, bãi cỏ ven biển hoặc các quần
xã cửa sông khác Dòng nước ngọt đồ từ thượng nguồn ra biển, dòng nước triều từ biển lên xuống
các vùng cửa sông đều đi qua RNM Các dòng nước này vận chuyền vật chất, SV từ quần xã này tới
quần xã khác và như vậy hệ sinh thái RNM chính là nơi giao lưu của các quần xã, tạo nên sự phong
phú về thành phần SV cho nơi này [36]
Hệ thực vật RNM bao gồm các loài thực vật (Sú, Vẹt, Mắm, Đước, Ban, ) sống trong vùng
nước mặn, hệ rễ của cây góp phần vào việc làm giảm tốc độ dòng chảy của thủy triều, tạo điều kiện
lắng đọng bùn, các vật chất lơ lửng, chúng góp phần bảo vệ vùng ven bờ; cung cấp các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc, Bên cạnh đó, hệ thực vật còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển [34]
RNM còn là nơi kiếm ăn, sinh sản và cư trú của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như
tôm, cua, cá, Mới đây, Bell và cộng sự (1984) khẳng định RNM là vườn ươm quan trọng cho các loài cá sống ở cửa sông Khi so sánh thành phần các lồi cá và tơm trong một vùng có RNM vào các mùa vụ trong năm đều thấy lượng con non của các loài này đều cao hơn hẳn các vùng đất, cát ở
ngoài đầm Từ đây cho thấy RNM là nơi nuôi dưỡng chính cho con non của nhiều loài hải sản [36] Các loài động thực vật, VSV sống trong MT tự nhiên của RNM Cần Giờ liên kết với nhau
thông qua các quá trình trao đổi chất và đồng hóa năng lượng nhằm khép kín chu trình dinh dưỡng của hệ sinh thái này Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật
chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng đều chịu sự ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngoài
như: thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa RNM phát triển tốt nhất ở nước có nồng độ muối 15 - 25%
[36]
Tuy nhiên, hiện nay RNM đang có những thay đổi đáng kể trước áp lực của việc đánh bắt cá,
tôm, khai thác gỗ, củi, nhiên liệu, nuôi trồng thủy sản, du lịch Sự tác động này nếu quản lý
Trang 111.2 TONG QUAN VE NAM SOI 1.2.1 Đặc điểm sinh học của NS
NS là VSV có nhân chuẩn Hệ nắm có cấu tạo khuẩn ty dạng sợi, sợi nắm (#2) là những ống dài phân nhánh hay không phân nhánh, có hay không có vách ngăn ngang (sep/zzm), đường kính
soi tir 3-3,5 pm Cac soi nam phat trién theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nắm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể [58]
Growing tip
Ruslei : this hy pha is, eenoey tie (areptate) ‘Cell membrane igi apparatus Mitochondr ion Rough endoplasmic: retioulurn Hình1.2 Cấu trúc sơi nắm
Cấu trúc sợi nắm gồm có thành tế bào, màng, tế bào chất và nhân Thành tế bảo NS chứa
kitin-cellulose hoac kitin-glucan [58]
Hệ sợi nắm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chat rắn, lỏng hay mềm Khuan lac NS thường có dạng hình tròn hoặc gần tròn
Bề mặt KL có thể mượt, nhẫn bóng, dang bột, dang sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khứa xuyên tâm hoặc lồ lõm không đều Mép KL trơn, răng cưa [60]
Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tỉnh trên bề mặt sợi nắm Các đặc điểm hình thái khác có tính đặc trưng cho loài như bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nam, giot
tiết, sắc tố hòa tan [58]
Trang 12SN
Hình1.3: Hình thái khuẩn yNS — Hình1.4 Hình thái khuẩn lạc NS
Hình1.5: Hình thái một số dạng bào tử của NS
NS sinh san chu yéu bang bao từ, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tinh Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất Trong sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [59]
NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt
tính sinh học như: enzym, các chất KS, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích kinh tế cao Bên cạnh đó, từ NS còn có các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro ứng
dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ đầu trong lòng đất [1], [57], [59]
>> Khả năng sinh các enzym ngoại bào
NS đã trở thành nguồn VSV chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym Hiện nay, từ NS người ta đã sản xuất được trên 80 loại enzym khác nhau, trong đó có 10 enzym được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật Một số enzym ngoại bào từ NS được tỉnh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phô biến nhu cellulase, protease, amylase, pectinase va chitinase [21], [26], [29]
v Cellulase là enzym xúc tác phân giải các hợp chất lingo -cellulose thanh glucose
Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi-
cellulose va lignin (15-30%) Cac chung NS Trichoderma, Penicillium, Aspergillus cd khả năng sinh enzym cellulase duge sit dung trong san xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ, các xác bã thực vật chứa cellulose ở RNM [21]
Trang 13giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp
thực phẩm, xử lý chất thải [29]
v Amylase 1a enzym xic tac qua trình thủy phân tỉnh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực vật thành đường glucose Tổ hợp phức hệ enzym amylase (a-amylase, B-amylase và glucoamylase)
sẽ cắt đứt các liên kết œ-1,4-glucoside va a-1,6-glucpside trong phân tử tỉnh bột để tạo ra sản phẩm
cuối cùng là glucose NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là những tác nhân không thể thiếu ở RNM nhw Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor Amylase duge ing
dụng rộng rãi trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế
biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt [2 1]
v Chitinase 1a cdc biopolymer chita cdc géc N-acetyl-glucozamin lién két với nhau bởi mối liên kết -1,4-glucoside Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc rất nhiều Nhiều loài NS thuộc chỉ 7richoderma, Glycladium, Chaefomium, có khả năng sinh chitinase, giúp tăng cường khả năng tiêu diệt các loài nam gay bénh va chéng các lồi cơn trùng có vỏ kitin [21]
Các chủng NS thuộc chỉ A4cremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh các
enzym phân giải dầu góp phần xử lý ô nhiễm dầu giúp bảo vệ MT tự nhiên và SV sống ở RNM
Cần Giờ [35]
> Kha nang sinh KS cia NS
KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, !à hiện trượng một WSV với sản phẩm
trao đổi chất của mình có tác dụng kừn hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác
Cac chat KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỷ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nắm bắt toàn Chất KS
được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván Trong phẫu
thuật, chúng được dùng đề chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương [11]
Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS Những vấn đề về chất KS được sinh ra từ VSV đang là mối quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [11]
Ngoài ra, trước nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều trong công nghệ thực phẩm, công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học Axit hữu cơ sản xuất từ NS
được nghiên cứu nhiều hơn: Năm 2004, Võ Thị Hạnh nghiên cứu sản xuất axit citric bằng NS Aspergillus niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì; các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp chất kích
thich sinh truong Giberrelin tt hai chung F monoforme va F oxysporum [29]
Trang 14thư Ví dụ: A /lavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan Một số NS gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm chân tay , bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bông ở lúa [6], [7]
1.2.2 Vị trí phân loại
Cho đến nay, người ta ước tính trong tự nhiên có khoảng I triệu đến 1,5 triệu loài nắm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài
Riêng các loài nắm thuộc lớp Nắm bắt toàn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 loài thuộc
306 chỉ khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004) Việc phân loại NS chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản [6]
Về phân loại nấm, hiện nay có hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là:
Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khóa phân loại được sử
dụng nhu: Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Barnett va cong su (1972), Ainsworth G.C va cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995) Trong luận
văn này, chúng tôi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của
Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Nguyễn Lân Dũng (2006) [57] Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của sinh học phân tử đã đem lại phương pháp mới cho việc nghiên cứu phân loại học Người ta sử dụng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen (PCR-Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả phân loại nhanh và chính xác [40]
1.2.3 Tình hình nghiên cứu khu hệ NS ở RNM nói chung và NÑS sinh amylase ở RNM nói riêng
Hiện nay có khoảng 800 — 1000 loài nắm biển được định loại (Hawkswworth ct al., 1995 ; Jones, 1995), trong khi đó một số lượng lớn các loài nắm trên đất liền đã được phân loại Sự hiểu biết về nắm RNM và vai trò của chúng đối với khu hệ sinh thái này còn quá ít và chưa đầy đủ Có
thể nói đây là một mảng rỗng của ngành VSV học (Agate A.D., Subraramnian, C V and Anuci, V,
1998) [43] Sự nghiên cứu về nắm RNM chỉ được các nhà nắm học quan tâm từ năm 1950 Những
năm đầu, việc nghiên cứu xác định tính da dạng của nấm trong RNM còn tất lẻ tẻ, nhưng sau này
các nhà khoa học đã thành lập hội nghiên cứu nắm toàn thế giới trong đó có nắm biển ở RNM
Nhiều nước trên thế giới đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hóa các loài nắm biển có mặt ở vùng RNM của họ Ví dụ : Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kơng 170
lồi, Đài Loan 7 loài, Singapore 156 loài, Nhật 26 loài, Úc 67 loài, Mexico 94 loài, Đức 4 loài, Thái Lan 83 loài, [49]
Trang 15Năm 1987, Hype và cộng sự công bố phát hiện được 89 lồi nắm từ cây RƯizophora mucronata lanak 6 RNM An D6 [48]
Nam 1988, Agate A D., Subramania C V và Vanuci M., đã nêu ra 8 lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV ở RNM cần các nhà khoa học giải quyết, trong
đó có sự phân loại, hệ thống hóa cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới [43]
Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nắm RNM trên toàn thế giới Trong đó bao gồm 87 loài
thuộc Ascomycefes, 31 loài thuộc Deuferomycefes và 2 loài thuộc Basidiomycetes
Năm 1994, Newell S.Y phân lập được các loài nắm nhay (Oomycetes) ua man tir 14 cay muc ở RNM, có khả năng phân hủy xác động vật, thực vật ở đó
Năm 1995, Hyde va Lee ; Kohlmeyer et al., dua ra nhan định các nam RNM đóng vai trò
quan trọng đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM
Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cộng sự về
nắm sợi RNM Giao Thủy, Nam Định Năm 2001, tác giả này tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh
enzym ngoại bào của 144 chủng phân lập từ RNM Giao Thủy Năm 2002, Mai Thị Hằng nghiên cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbuahydro của nắm sợi RNM ở hai tỉnh Nam
Định, Thái Bình [52]
Với rừng RNM, những phát hiện khoa học đầy thú vị chưa dừng lại ở đó Các nghiên cứu
VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được: ở
các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nắm có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau Đó là các loài NS thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium,
Paecilomyces, Canninghamela c kha nang phan giai dau DO rat mạnh [69]
Theo nhóm nghiên cứu của Phan Nguyên Hồng và Nguyễn Hoàng Trí, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ sinh vật ở đây, làm
trong sạch nước biển Chính vì thế “ngudi ta da ví RNM là quả thận không lô lọc các chất thải cho
MT vùng ven biển” [69]
Năm 2004, Phan Thị Phương Hoa nghiên cứu phân loại 67 chủng NS thuộc chi Aspergillus phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình Đây là một nghiên cứu được đánh giá cao trong số các
nghiên cứu về NS ở RNM Việt Nam [§]
Đến năm 2007 mới có tác giả Khưu Phương Yến Anh“Nghiên cứu khả năng
sinh enzym cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ” [1]
Trang 16Bên cạnh việc tìm kiếm những chủng NS mới ở RNM, người ta còn nghiên cứu các đặc tính sinh học của chủng này Ví dụ, để thu nhận amylase thì dùng cdc ching Aspergillus, Rhizopus Một s6 loai cua Neurospora, Mucor tong hgp rat manh ca hai loai d-amylase và glucoamylse (Rodzevits, Butova 1965, Fennkxova Ru-zakova 1966 ; Phillips, Caldwell 1951 Corman Lanalu-ke, 1948)
[17]
Một số công trình nghiên cứu của Azarova (1981) ; Jerebtxov, Pankratove (1977) cho thấy glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bot, glucogen, amylopectin dextrin cuối tới glucose [17]
Nam 2001, nha khoa hoc Nhat Ban B.N Okolo da tién hanh tinh sạch và xác định một số tính chất của amylase phân giải tỉnh bột sống mới từ 4 cacbonarius
Năm 2008, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình “Nghiên cứu vé a-amylase ngoai bao cua chi Aspergillus” cia Baldwin, Toby M, .cho thấy sự liên quan giữa viéc sinh a- amylase va glucoamylase của chỉ nắm này [15]
Tại Việt Nam, năm 1974, tác giả D V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ 4
niger Nam 1977, tac giả L V Chứ, Ð T T Thu nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase với đối tượng A awamorii
Đến năm 1984, N B Ngà và N L Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài A oryzae, A niger, A awamorii cé hoạt tính a-amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột
sắn
Năm 1993, có công trình : “Nghiên cứu chọn lọc chung Asp niger TH3 — 19K cia Nhat Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của tác giả D V Hợp và cộng
sự
Năm 1998, Hồng Kim Anh, Ngơ Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có công trình “Thu
nhận amlyse từ nắm mốc Aspergillus sp” [2]
Ở Việt Nam, viện Sinh học Nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm Biol, Biol],
Biolll c6 dạng bột, chứa các enzym protease, cellulase, amylase va cac VSV dung bổ sung vào
thức ăn cho cá, heo, bò Chế phẩm có tác dụng phòng chống chứng tối loại tiêu hóa, kích thích tăng
trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao [Š7]
Năm 2002, Mai Thị Hằng và cộng sự cũng có những khảo sát về khả năng sinh enzym amylase của NS phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình [10]
Năm 2009 tác giả Nguyễn Thị Lan Hương “Nghiên cứu về khả năng sinh enzym amylase của
Trang 17Có thể nói những nghiên cứu về NS sinh amylase trên đất liền khá phong phú và đa dạng, còn
những nghiên cứu về amylase của NS từ RNM Cần Giờ vẫn còn khá ít ỏi, chưa tương xứng với tiềm năng 1.3 TINH BOT VA HE ENZYM AMYLASE 1.3.1 Tỉnh bột Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và amilopectin [5]
> Thành phần cấu trúc của amylose
Amilose là loại mạch thẳng, chuỗi đài từ 500-2000 đơn vị glucozơ, liên kết nhau bởi liên kết ø—1,4 glicozit œ-{1->4) linkage ~ \ HO 4 œ on œ kh Km ee Hình1.6— Phân tử Amilose
> Thành phần cấu trúc của amilopectin
Amilopectin là polyme có mạch nhánh, ngoài mạch chính có liên két a-1,4 glucozit còn có
nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết ø-1,6 glucozit
Cấu tạo của amilopectin còn lớn và dị thể hơn amilose nhiều Trong tỉnh bột tỉ lệ amiloza/amilopectin khoảng 1⁄4 Tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ và cách chăm sóc N rn en Py 5 œ-(1->6) linkage cử ỐNG os o | ‘0 ) o0 L,Kẹ X,.K» DL 1 I T T Hình1.7 — Phân tử amilopectin eae cHz:
Ở nước ta, nguồn nguyên liệu chứa tỉnh bột thì vô cùng da dạng và phong phú Nhưng đẻ phù
hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần
phái tính đến chi phi cho giá thành sản phẩm [5], [23], [28]
1.3.2 Hệ enzym amylase
Trang 18glycogen Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin [15], [31],
[44]
Cac amylase chu yéu thủy phân tỉnh bột thường gặp là: 1.3.2.1 œ — amylase hay ø-1,4-glucohydrolase
Là enzym phân cắt các liên kết a-1,4 glucoside trong mạch amilose và amilopectin một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả Việc tác dụng œ — amylase lên hồ tỉnh bột làm giảm nhanh khả năng bắt màu của tỉnh bột với iod và độ nhớt của dịch hồ, amilose tạo thành maltose và maltotriose
Nếu trong thời gian dài thì sản phẩm thủy phân của amilose chứa 13% glucose và 87% maltose Còn
amilopectin sé tao thanh maltose, maltotriose va dextrin phan tir thap cùng 5-10% glucose [5], [21] o.— amylase thủy phân tỉnh bột chủ yếu tạo thanh maltose va dextrin phan tir thấp không tạo màu với iod Chúng có ở thực vật, động vật và đặc biệt là ở rất nhiều VSV
ơ — amylase dé tan trong nước, dung dịch muối, rượu loãng Tất cả các œ — amylase đều chứa
từ 1-30 nguyên tử gam canxi (Ca)/mol Nếu tách hoàn toàn Ca
khỏi phân tử enzym thì ơ — amylase mat khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia hình thành và ồn định enzym Ca còn tác dụng đảm bảo ơ — amylase có độ bền cực lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các enzym phân giải protein [21]
ơ — amylase từ các nguồn thu nhận khác nhau thường không giống nhau
+ pH thích hợp cho hoạt động của đa SỐ œ— amylase từ NS là 4,5 — 5,5; của đại mạch nảy
mam và thóc mầm là 4,7 — 5,4; và của VK là 5,5 — 6 pH tối thích của ơ — amylase từ 4 oryzae là
4,8 — 5,8 [26]
+ Độ bền của œ — amylase với tác dụng của axit từ NS được sắp xếp theo thứ tự sau: 4 batatae > A usamii> A oryzae> A awamori> B subtilis> thóc mầm [21]
+ œ— amylase của NS rất nhạy cảm với hoạt động của nhiệt độ tối thích khoảng 40 - 50°C,
théc mam va malt la 58 — 60°C và VK là 70 — 75°C [21]
ơ — amylase hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tỉnh bột rất nhanh Thủy phân tỉnh bột bang a — amylase thường xảy ra hai giai đoạn:
* Giai đoạn đâu: (Giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt từ hồ tinh bột giảm
Tỉnh bột
* Giai đoạn 2: (Giai đoạn đường hóa) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành [17]
œ-amylase „ dextrin phân tử lượng thấp
Dextrin ——— tetra va trimaltose _———> di & monosaccharide Amylase ——* oligosacharide ——> poliglucose
Maltose ———> maltotriose ——» mmalfotetrose
Trang 19Là ngoại enzym chỉ phân cắt các liên kết œ — 1,4 glucoside ở đầu mạch Chỉ phổ biến ở thực
vật, nhiều ở hạt nảy mầm Vi khuẩn không có enzym này, còn NS chưa được chứng minh hoàn toàn
về sự hiện điện của enzym này [5], [21]
B — amylase kém bén 6 nhiệt độ cao, vơ hoạt hồn toàn ở 70°C nhưng trong dịch nấu thì nhiệt độ tối thích là 60 — 65°C Enzym này khá bên trong MT axit ở pH 3-4 Da sé B — amylase hoạt động
mạnh hơn ở MT pH 4,5-5 và vẫn giữ được hoạt
tính khi không có canxi
Điểm khác biệt của enzym này so với ơ-amylase là hầu như không tác dụng
lên tỉnh bột sống mà chỉ phân giải hồ tỉnh bột Chúng phân giải 100% amilose và 54-58% amilopectin thành maltose [26]
1.3.2.3 Glucoamylase hay amyloglucozidaza, con goi la y-amylae
Đây là enzym đường hóa quan trọng nhất trong hé amylase Glucoamylase xtc tác thủy phân
cc lién két a-1,4 va a-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose và amilopectin tạo
sản phẩm cuối cùng là glucose Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tỉnh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose [21], [26], [44]
Trong số các VSV có khả năng sinh glucoamylase đã được biết cho đến nay, chi Aspergillus là chỉ được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rat cao, đặc biệt là loài 4spergillus niger
Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 —
5,0 Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH kiềm Ví dụ glucoamylase của loài Coniphora cerebella và Corticwm rol§ii tương đối bền ở pH=9, ølucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH=8 [21], [44]
Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 — 60°C Tuy nhiên, cũng có trường hop glucoamylase
hoạt động tốt nhất ở 65 — 70°C, ví đụ như glucoamylase của loài C thermosaccharolytium
Glucoamylase bi ức chế mạnh bởi Hg” nhưng các ion Mn”” và Fe”” lại có tác dụng kích thích
sự hoạt động của enzym nay [5], [21], [29]
1.3.3 Một số yéu té nh hwéng dén sinh téng hop amylase cia NS
a Giống nấm sợi
Trong các yếu tố thì chủng giống NS là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình
thành và hàm lượng amylase Không phải tất cả các chủng nắm đều có khả năng tổng hợp amylase như nhau Ngày cả những chủng cùng chỉ, thậm chí cùng loài cũng rất khác nhau về lượng enzym do chúng sản sinh ra Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng NS có khả năng tạo nhiều amylase là điều vô cùng quan
Trang 20Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng NS có khả năng sinh amylase cao, cần
phải đồng thời tiến hành nuôi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzym cao nhất và ổn định nhất Sau đó, cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cần thận để giữ được hoạt tính ban đầu
b Nguồn dinh dưỡng
Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và sự tạo thành enzym
của NS Vì vậy, trong MT nuôi cấy cần bảo đảm đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất
dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại NS [26]
* Nguồn dinh dưỡng cacbon
Trong MT nuôi cấy NS sinh amylase nhất thiết phải có nguồn tỉnh bột làm chất cảm ứng và
nguồn cacbon NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau Nguồn cacbonhydrat
dễ hấp thu nhất với NS là glucose - là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào chu trình chuyển hóa: con duong Embden Meyerhof (1930), Pentose va Entner Doudoroff [26]
Nông độ tỉnh bột và các nguồn cacbon khác nhau cũng có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành
các enzym riêng biệt của hệ amylase Ví dụ như đề đảm bảo hoạt lực a-amylase cao cần 6% tỉnh bột, còn với glucoamylase là 2% [26]
Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn
gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác Trong đó cám gao, cam mì được sử dụng nhiều hơn cả Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho
VSV phat triển Mặt khác, khi chế tạo MT, các nguyên liệu này chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyên trong khối nguyên liệu [26]
* Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nguồn dinh dưỡng nitơ để nuôi NS tạo amylase thường được dùng đưới các dạng muối vô cơ chủ yếu là NaNO; hoặc NH4NO; voi ham lượng 0,91% có hiệu quả cao hơn các loại muối khác
Các hợp chất N hữu cơ thường dưới dạng nguyên
liệu giàu đạm như: cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô dầu, [21], [26] Khi sử dụng nguồn nito nhất định cho vào MT có thê kích thích tổng hợp
amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, quá
trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp ơ-amylase
Trang 21* Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Cu có vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình chuyên hóa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia vào thành phần cấu tạo protein, enzym,
điều hòa các chất trong tế bào [26]
Một số chất khoáng có vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp enzym amylse như: Canxi là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo amylase vì nó cần cho quá trình tổng hợp và ổn định a-amylase, bảo vệ enzym này khỏi tác động của protease; Magie (Mg) ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym Thiếu MgSO/¿ sẽ ảnh hưởng đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu của muối này cần cho sự tong hop a-amylase và glucoamylase là
0,05%
Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của NS, khi bổ sung phospho hữu cơ vào MT sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2-3 lần; Tuy nhiên, nếu trong MT có nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase [21]
c Điều kiện ni cấy
Ngồi các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuôi cấy VSV các yếu tố như nhiệt độ, độ âm, pH,
thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV - Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng đa số NS trên MT rắn là 28-32°C Chu kỳ sinh trưởng của
NS cé thé chia làm 3 thời kì: Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10-11 giờ đầu tiên), nhiệt
độ cần ở 23-30°C Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4-18 giờ), nắm hô hấp mạnh nên giữ nhiệt độ
phóng ở 28-29°C Và ở thời kì
sinh amylse mạnh (10-12 giờ) ở nhiệt d6 28-29°C [26]
- Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với N§ là 60-65%, VK là khoảng
70%, độ âm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất Độ âm cao sẽ làm giảm độ thoáng
khí của MT, còn khi độ âm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV - Ảnh hưởng của pH
Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi vi khuẩn lại phát triển và sinh enzym cao ở MT trung tính pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà còn ảnh hưởng đến chủng loại enzym được tổng hợp Ví dụ, 4 oryzae khi MT có pH=6,5 thì ưu thé tổng hợp thuộc về œ — amylase, trong khi đó ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH của MT là 4,5
Trang 22Muối ăn NaCl ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của VSV, ngoài tác dụng cung
cấp nguồn ion CT còn có tác dụng làm thay đổi sức thâm thấu của màng tế bào, tạo điều kiện cho
việc tiết các chất ra MT [26]
Hầu hết các chủng nấm sợi RNM đều có khả năng phát triển tốt ở nồng độ muối từ 3-5% (Mai Thị Hằng, 2001) Một số chủng có nguồn gốc tại RNM là có khả năng chịu mặn thì sinh
trưởng tốt ở nồng độ muối 10% Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng từ 20 - 30% thì một số NS có thể
sống được nhưng mọc rất yếu [12] - Ảnh hưởng của thời gian
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym Trong quá trình nuôi cấy NS,
sự hình thành amylase cực đại thường kết thúc khi NS bat đầu sinh bào tử Thời gian kết thúc sự tao thành amylase thường từ 30 đến 42 giờ Còn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất là trong khoảng từ 40 đến 50 giờ [21]
1.3.4 Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận amylase ¢ Phương pháp ni cấy chìm ~ MT nuôi dạng lồng
NS được nuôi trong dung dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tỉnh bột có bổ sung
nguồn nitơ vô cơ (NaNO;) Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều
amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung
cấp ôxy cho NS phát triển Để thu nhận enzym, dịch enzym được cô đặc ở nhiệt độ thấp [26], [28]
Phương pháp này có ưu điểm:
-NS được gieo cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ tiếp
xúc với dịch dinh dưỡng
-Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa và tự động hóa
Song phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:
-Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối
~Trong quá trình nuôi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục -Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ
-Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất
cảm ứng để NS sinh enzym ở mức tối đa * Phương pháp nuôi cấy bề mặt - MT bán rắn
Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT Nguyên liệu chính thường
là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo, được bổ sung lượng nhỏ (10-20%) trấu, hạt
ngũ cốc, mạt cưa, dé làm tăng độ thoáng khí MT được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng
Trang 23atm/45-60 phút, dé nguội rồi cho bao ti nam hay NS vào MT đã cấy giống được tãi lên các khay
sạch với chiều dày từ 2 — 5cm và nuôi ở các điều kiện thích hợp Sau khoảng thời gian nuôi cấy,
người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 40°C đẻ đạt độ âm 8-12%, nghiền nhỏ Đây chính là chế phẩm
enzym dạng thô [26]
Phương pháp này có nhược điểm là:
-Tốn diện tích mặt bằng
-Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được toàn bộ quá trình -Chi phi nhân công, điện nước cho một đơn vị sản phẩm cao
Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao hơn, vì
NS là VSV hiếu khí bắt buộc đo đó nuôi trên MT này thì độ thoáng khí cao Nồng độ enzym tạo thành cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm MT không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm VSV lạ cũng dễ dàng xử lý Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quan, dé vận chuyên và ít tổn hao hoạt tính
enzym Là phương pháp sử dụng trong điều kiện không cần thu enzym tinh khiết, rất dé thực hiện,
quy trình công nghệ đơn giản không đòi hỏi quá cao về trang thiét bi [28]
s* Phương pháp thu nhận amylase
- Từ phương pháp nuôi cấy chìm: Sau khi lọc bỏ sinh khối VSV và các tạp chất rắn không tan
còn khoảng 1-3% chất khô hòa tan, trong đó có enzym Thu dịch lọc, sau đó cô đặc cho giảm thể
tích từ 4-10 lần trong điều kiện chân không ở 25 — 30°C, rồi tiến hành tach enzym
- Từ môi trường nuôi cấy bề mặt: Chễ phẩm enzym thô được bổ sung lượng nước gấp 4 — 5
lần khối lượng canh trường để hòa tan enzym Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 10-12°C Dịch
chiết thu được có màu nâu sam, khé trong
Dịch chiết được cô đặc chân không tới 50-55% chất khô hòa tan, dịch đậm đặc này có thể
bao quan lâu dài mà không mắt hoạt lực và rất dễ hòa tan
- Tinh sạch amylase: Sử dụng cồn lạnh (4°C) lượng gấp 2 — 2,5 lần lượng dịch enzym đồ từ từ vào dịch lọc, khuấy nhẹ để cồn hòa đều với dịch lọc enzym Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh Sau 15 — 24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp Đem ly tâm hay lọc để thu enzym đạng tủa Sấy khô nhẹ ở nhiệt
độ < 40°C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết [26]
1.3.4 Ứng dụng của enzym amylase
Amylase là hệ enzym thủy phân quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm amylase đã được khai thác theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng trong
nhiều lãnh vực khác nhau [29]
a Trong công nghệ rượu, cồn, bia
Trong vài chục năm gần đây, các nhà sản xuất đã st dung ché pham amylse tir NS A oryzae
Trang 24nguyên liệu có chứa tỉnh bột Việc thay thế này giúp tiết kiệm được hàng vạn tan tinh bột loại tốt, giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất Người Nhật đã biết sử dụng enzym của
nắm mốc trong quá trình
đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm Người Trung Quốc thì
đã sử dụng nhiều loại nắm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu từ cách đây 4000 năm Còn
người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm [29], [31]
Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nắm mốc 4spergillus sang
mới biết sử dụng enzym của nấm này thay amylase của malt để sản xuất cồn [29] b Sản xuất bánh mì
Để rút ngắn thời gian ủ bột, khi thêm 0,002 — 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ
nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp Nhiệt độ vô hoạt ơ- amylase của NS tương đối cao (70°C) nên có thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà không có hiện tượng dextrin hóa khi nướng Hơn nữa, hoạt độ a-amylase lại cao nên có thể đạt đến độ đường hóa cần thiết rất nhanh chóng, sau đó bị vô hoạt ngay Tuy nhiên, chế phẩm enzym nắm mốc thường là một phức hệ enzym, trong đó protease có thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi [29]
c Công nghiệp dệt
Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Trong vải thô thường chứa khỏang 5% tỉnh bột và các tạp chất khác Để làm vải mềm, có khả năng nhúng nước,
tây trắng và bắt màu tốt người ta thường sử dụng I lượng chế phẩm amylase (từ VK hay nắm mốc) khéang 0,3-0,6 g/l dung dich và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 90°C Phương pháp này không
làm hại vải, độ mao dẫn tốt, đồng thời đảm bảo vệ sinh
Ngoài ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất đextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose — fructose, san xuat tương và nước chấm .ở quy mô công nghiệp [29]
d Trong sản xuất thức ăn gia súc
Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn với thành
phần tỉnh bột rất cao Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường sử dụng chế phẩm amylase của 4 oryzze, A owamorii thém enzym amylase vào khẩu phần ăn của
động vật, nhất là động vật
non làm tăng khả năng đồng hóa dẫn đến tăng trọng nhanh [3 I ] e Nghiên cứu sinh học, y học
Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng
Trang 25Amylase cùng các enzym khác, được dùng trong chữa bệnh do thiếu enzym, kém khả năng
chuyên hóa chất, bệnh về tiêu hóa, tim, thần kinh,
Ngoài ra, chế phẩm enzym được dùng để điều chế MT nuôi VSV phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh [29], [31]
> Một số chế phẩm enzym amylase trên thế giới và Việt Nam
Bảng 1.1 : Một số chế phẩm enzym amylase thương mại [21]
STT | Chế phẩm enzym Tên thương mại Hãng sản xuất Tenase Miles lab
1 a-amylase vi khuan | Optiamyl Miles Kali-chemie
BAN Novo-nordisk
Termamyl Novo-nordisk 2 ø-amylase vi khuẩn | Opti-therm Miles Kali-chemie
chịu nhiệt Maxamyl Gist-brocades Diazym Miles lab 3 Amyloglucosidase | AMG Novo-nordisk
Spezym Fiun Biochemical 4 B-amylase Dextrozym (chttaAMG) | Novo-nordisk
Promozym Novo-nordisk Biozym Amano 5 MKC Fugal amylase Novo-nordisk
Fungamyl clarase Miles lab
Trang 26Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu
- Các chủng NS phân lập từ mẫu đất, thân, lá cây tại 5 xã của RNM Cần Giờ
- Các VSV kiểm định: E coli, B subiilis từ viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh
- Chế phẩm amylase từ viện Sinh học nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh
- Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym: Cám mì, trau, bot ngô, đậu tương mua từ chợ Tân
Bình
s* Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm
* MTI - MT Czapek— Dox cải tiễn: dùng đề phân lập NS [9J, [22], [43]
NaNO; 3.5g; KH2PO¿ 1.5g; MgSO¿.7H;O 0.5g; KCI 0.5g; FeSO¿.7HạO 0.01g (vết); glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút; Cloramphenicol 1% MT
*MT2 - MT cao nam men (YEA) (Yeast Extraxt Agar) Ding dé nudi cay va giit giéng NS [15]
» [54]
Cao nam men 4g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5.5 — 6.0; khử trùng latm/
30 phút
*MT3 - MT Malt Extract Agar (MEA): Dùng để bảo quản NS [22], [54]
Pepton 1g; Malt Extract 20g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5 - 6; khử trùng Iamt/30 phút
*MT4 - MT cảm ứng tổng hợp amylase: Dùng để phân lập nhanh các chủng NS sinh amylase[11], [13], [21]
NaNO; 3.5g; K2HPO, 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCI 0.5g; FeSO4.7H20 0.1g (vét); tỉnh bột tan 10g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng Iatm/ 30 phút
*MT5 - MT cảm ứng tổng hợp cellulose [1]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g tỉnh bột tan
bằng 10g CMC
*MT6 - MT cảm ứng tổng hợp protease [26J: Tương tự MT4 nhưng không sử dụng NaNO;
và thay 10g tinh bột tan bằng 10g casein
*MT7 - MT cảm ứng tổng hợp chitinase[26J: Tương tự MT4 nhưng thay 10g
tỉnh bột tan bằng 10g chitin
*MTS - MT cam ứng tổng hợp pectinase[26]:
200g cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước biển trong 60 phút, thém 1 it CaCO; dé
Trang 27Pepton 5g; NaC] 5g; cao thịt 5g; agar 20g; nước cat 1000ml; pH = 7.5; khử trùng latm/ 30 phút
*MT10 ~ MT thử khả năng phân giải dau [1],[11], [35]:
KH)PO, 0,3g; MgSO, 0,4g; KNO; 3g; Na;HPO, 0,7g; Dầu DO 50ml; nước biển 950ml; khử
trùng Iatm/ 30 phút
> Một số MT bán rắn khảo sát khả năng sinh amylase
*MTII [1], [11], [26]: Cam mì 65g; trâu 25g; bột bắp 7,5g; NaNO; 2g; MgSO¿ 0,05g;
KH;PO¿ 0,2g; KCI 0,05g; urê 0,2g; độ ầm 50 - 60%, pH = 5 - 6, khử trùng 1atm/ 30 phút
*MT12 [21], [26J: Trâu 55g; cám 30g; bột bắp 5g; bã khoai mì 5g; đường 4g; (NH,);;HPO,
0,1g; ure 0,2g; CaCl,0,1g; KCI 0,05g; HCl 0,05g; d6 4m 50 — 60%; khir trùng latm/45 phút
*MT13 [21], [26]: 90% ba khoai mi; 10% trấu, bổ sung dung dịch khoáng (KH;PO¿ 0,1%;
NH,CI 0,1%; KNO; 0,3%; MgSO¿ 0,05%) cho đủ độ âm 60%; khử trùng 1atm/30 phút
*MT14 [15]: 50% cam gao; 33% ba khoai mi; 17% trau; d6 4m 60%; pH 5-5,5; khử trùng latm/30 phut *MT15 [15]: Cam 60%; bot đậu nành 30%; bột ngd 10%; trau 25%; dd ẩm 60%; pH 5,0-5,5; khử trùng latm/60 phút 2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1 Hóa chất
- Cồn, NaNO;, KạHPO„, MgSO4.7H,O, KCI, FeSO4.7H20, NaCl, HCl
~ Glucose, cao nắm men, nước chiết khoai tay, tinh bột tan, agar, peptone, cao thịt, casein, thuốc thử lugol, HgCl;, Dinitrosalysilic, lactophenol - Chất KS: Cloramphenycol (Ấn Độ) 2.2.2 Dụng cụ Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, que cấy, que gạt, bông mỡ, đèn cồn, cốc thủy tinh, 2.2.3 Thiét bj
Tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ lạnh (National - Nhật), tủ giữ mẫu (Sanyo - Nhật), máy giập mẫu (Đức), máy lắc Gerhardt (Đức), cân điện Sartorius (Đức), tủ sấy Memmert (Đức), nồi hấp áp lực Autoclave (Đài Loan), máy đo quang phổ UV — Visible spectrophometer (Nhật), máy chụp hình kỹ thuật s6 Olympus 5.1 (Nhat), may do pH (Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc), máy ly tâm Rotina (Đức), cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ), máy đo độ âm Startorius (Đức),
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Trang 28Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: Xã Bình Khánh, xã Tam Thôn Hiệp, xã
An Thới Đông, xã Long Hòa Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2km, các điểm lấy mẫu
cách nhau khoảng 200m Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ Khu vực lấy mẫu là
vùng nước lợ có độ mặn 3%, nhiệt độ khoảng 29°C; pH 7,02
Lay các mẫu đất mặt, đất sâu 5-10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thần cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất
Cách lấy: Dùng dao, kéo vô trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi ni lông vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và
giữ ở tủ giống 4°C Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 24 giờ [43]
2.3.2 Phương pháp vi sinh
2.3.2.1 Phân lập mẫu theo phương pháp pha loãng mẫu (F Uyenco, 1988) * Lấy mẫu và pha loãng
Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vô trùng Sau
đó dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phan dich hơi đục chảy ra bên ngoài Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10”
Lắc đều, hút 1ml dung dịch 10” cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được
dung dịch pha loãng nồng độ 10”
Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10, 10 * Cấy mẫu
Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nông độ lên đĩa petri chứa MT czapek- dox cải tiến Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch Sau đó sử dụng que trang đó trang tiếp hai đĩa tiếp theo
Trang 29http://www.saigonesl.com/City_Maps_Collection/pages/County_Can_Gio_gif.htm Hình 2.1 Bản đồ tổng quan về RNM Cân Giờ và các vị trí lấy mẫu * mẫu
Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày Chọn khuẩn lạc riêng
rẽ cây chuyền vào ống thạch nghiêng
* Làm thuân
Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước cắt, trải
đều trên mặt đĩa lần 2 Nếu các dạng khuẩn lạc đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển
vi đều có 1 dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết
Sau đó chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền vào 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên
cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
2.3.2.2 Giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khoáng (Lumiere và Chevrotier — 1914)
Chuan bị ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp Dầu khoáng chứa trong ống eppendorf hấp vô trùng ở 121°C trong 2 giờ rồi sấy khô 6 170°C trong 1-2 giờ, để nguội Dùng
que cấy lấy bào tử N§ cho vào eppendorf chứa dầu khống vơ trùng Hàn kín eppendorf bằng
paraffin, bảo quản ở nhiệt độ 4°C
Phương pháp này có thê bảo quản trong 1-3 năm
2.3.2.3 Quan sát đại thé NS [6], [7]
NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ như sau
- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng
- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm Lắc đều tạo dung dịch huyền phù
- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm
vào mặt thạch ở giữa hộp petri Làm 2-3 hộp
- Ủ ấm trong một tuần để tao KL Hàng ngày lấy ra quan sát
- Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:
+ Hình thái, kích thước KU
+ Màu sắc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc của KL + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra
+ Dạng sợi nắm mọc ở mặt trên MT, đặc điểm của mép KU + Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tỉnh trên bề mặt KI
2.3.2.4 Quan sát vỉ thể NS - Phương pháp cấy khối thạch [8]
- Chuan bị MT thích hợp, đỗ một lớp mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri