NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM CENLLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ. LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH _ KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM CENLLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THANH THỦY TS VÕ THỊ HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 MỞ ĐẦU Sự hữu rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ kết 25 năm phục hồi phát triển nổ lực to lớn quyền nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh Vào ngày 21 tháng năm 2000, Ủy ban MAB/ UNESCO công nhận RNM Cần Giờ khu dự trữ sinh Việt Nam [55] Trước đây, RNM Cần Giờ vùng đất hoang hóa với phần lớn diện tích đất bùn khô nứt nẻ phần thảm thực vật xơ xác mà độ che phủ 40% Sau khơi phục lại rừng việc trồng lồi có giá trị kinh tế quan trọng Đước, Dưng, Dà quánh, Gõ biển, Xu ổi…,đồng thời với việc khoanh nuôi, tu bổ rừng tự nhiên, đến nay, hệ sinh thái RNM tươi tốt hình thành, tạo MT sống cho loài động thực vật, gia tăng mức độ đa dạng sinh học RNM Cần Giờ nơi lưu trữ nguồn gen sinh vật quí bền vững, có khả chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt Là nơi có hệ VSV vô phong phú đa dạng nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…., nấm sợi chiếm số lượng lớn Nấm sợi đóng vai trị quan trọng vịng tuần hồn vật chất lượng hệ sinh thái RNM, nhờ có khả sinh loại enzym ngoại bào cellulase, protease, kitinase, amylase, enzym phân giải dầu… Đặc biệt, enzym cellulase nấm sợi sống RNM sinh lớn, thảm thực vật dày đặc RNM Cần Giờ nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi cho chủng nấm sợi có khả sinh enzym Enzym cellulase hệ enzym bao gồm loại enzym: C1, Cx, βglucosidase, có khả hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose Enzym cellulase ứng dụng nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trình li trích chất từ thực vật, việc phân hủy phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% số tỷ USD thu từ lượng enzym công nghiệp bán giới gồm enzym cellulase, hemicellulase pectinase Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại lượng lớn nguồn enzym cellulase để giải vấn đề sản xuất xử lý ô nhiễm MT RNM Cần Giờ kho dự trữ chủng VSV có hoạt tính enzym cao chưa khai thác Trong đó, cơng trình khoa học nghiên cứu khả sinh enzym cellulase chủng nấm sợi RNM Cần Giờ bỏ ngõ Từ sở khoa học thực tiễn gợi ý cho chọn đề tài: “Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”, nhằm tận dụng nguồn phế thải nơng nghiệp để sản xuất phân bón cho trồng, góp phần xây dựng nơng nghiệp bền vững, giảm thiểu ô nhiễm MT Việt Nam nước nhiệt đới có nơng nghiệp phong phú, đa dạng đà phát triển Vì vậy, lượng phế thải nơng nghiệp dồi dào, với cơng nghiệp hóa, đại hóa đất nước, nhiễm MT trở thành nguy thật Thành phần phế thải rắn sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp cellulose, sản phẩm trình phân hủy chất hữu phế thải mùn làm phân bón tốt cho trồng Do đó, xử lý chất thải VSV hướng tích cực có nhiều ưu điểm so với phương pháp lí, hóa, học, quan tâm khai thác  Mục tiêu đề tài - Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ - Đề xuất hướng ứng dụng chủng nấm sợi phân lập  Nhiệm vụ đề tài Phân lập chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ Tuyển chọn số chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase cao Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa phân loại chủng nấm sợi tuyển chọn Nghiên cứu yếu tố MT ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển sinh tổng hợp enzym cellulase chủng chọn Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào việc phân hủy chất phế thải, góp phần hạn chế ô nhiễm MT  Địa điểm nghiên cứu đề tài Đề tài thực PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu nấm sợi rừng ngập mặn Cần Giờ 1.1.1 Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ RNM chiếm phần đáng kể kiểu rừng ngập nước, thường tồn vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trên giới khoảng 15 triệu RNM phân bố vùng bờ biển có bùn, cửa sơng lớn, vịnh cạn đầm mặn giáp với biển RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, “lá phổi xanh” thành phố Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sơng, điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi tạo MT phát triển ngành thủy sản Bên cạnh đó, RNM Cần Giờ cịn nơi cung cấp thức ăn, nơi cư trú, sinh sản loài thủy sinh vật động vật có xương sống cạn Hiện nay, Cần Giờ địa điểm du lịch hấp dẫn với 3.000 - 5.000 du khách đến tham quan tuần [83] RNM Cần Giờ có diện tích khoảng 29,380 chiếm 41,18 % đất huyện Cần Giờ [87] Khí hậu nóng ẩm chịu chi phối quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm Nhiệt độ trung bình 25,80C, biên độ nhiệt dao động ngày từ 5-70C Chế độ bán nhật triều không Độ mặn dao động 18 ‰ – 30 ‰ [1] Một nghiên cứu cho biết RNM Cần Giờ có 157 lồi thực vật; 63 lồi phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc ngành: Tảo khuê, Tảo giáp, Tảo lam; 100 lồi động vật đáy khơng xương sống tơm, cua, sị ốc Ngồi ra, cịn có 120 lồi cá, có lồi có giá trị kinh tế cao cá Ngát, cá Dứa, cá Chẽm; 31 lồi bị sát cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu nhũ khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng 145 loài chim [83] Đây nguồn thức ăn tốt cho hệ nấm sợi sống RNM Nấm sợi có khả tiết hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có cây, thân RNM thành glucose để sử dụng Ngồi ra, nấm sợi cịn sinh loại enzym khác protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tơm, cua, ốc, xác chết lồi động vật khác thành chất dinh dưỡng chúng hấp thu [1] Hình 1.1 Bản đồ RNM Cần Giờ [83] Vậy, hệ nấm sợi mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn, nhân tố thiếu chu trình chuyển hóa vật chất RNM Cần Giờ Chúng sử dụng chất hữu từ thảm thực vật hệ động vật phong phú làm thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm nhiễm MT RNM Cần Giờ 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM  Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase Khả sinh enzym cellulase chủ yếu tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma Aspergillus Ở Mỹ, năm 1983 PTN Quân đội Mỹ Natik trường đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase Sau đó, gây biến chủng chọn lọc biến chủng QM9414 có khả sinh cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74] Năm 1998, YU nuôi cấy T reesei Rut 30 MT chứa 5% bột cellulose 1% cám mì, thu hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68] Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả sinh tổng hợp enzym polygalacturonase, cellulase, xylanase protease từ A niger 3T5B8 nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác phương pháp lên men bán rắn ứng dụng enzym việc tách chiết dầu thực vật [61] Năm 2002, theo báo cáo gần CORAL, dịch nuôi cấy A niger MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát có hai vạch có hoạt tính CMCase trọng lượng phân tử 83.000 50.000 Dalton [67] Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu sinh tổng hợp số đặc tính cellulase (typ CMCase) A niger VS-1 MT lên men bán rắn [40] Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu nấm sợi T reesei sinh tổng hợp enzym cellulase MT lỏng với nguồn cacbon CMC [40] Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22] Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulase A niger Rnnl 363 Châu Hoàng Vũ nghiên cứu thu nhận tinh enzym cellulase từ nấm mốc T reesei phương pháp lên men bán rắn [24], [57] Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả sinh tổng hợp enzym cellulase từ T reesei A niger MT lên men bán rắn [40] Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng pectinase cellulase số chủng nấm mốc [27]  Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM Cho đến nay, giới có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu phân lập phân loại nấm sợi hệ sinh thái RNM Nhưng kết nghiên cứu sơ sài, chưa đáp ứng nhu cầu hiểu biết đa dạng nấm sợi vai trò chúng hệ sinh thái RNM [64] Trước đây, người ta cho điều kiện MT RNM q khắc nghiệt, khơng thích hợp cho sinh trưởng phát triển nấm sợi Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy điều kiện sống đặc biệt vậy, đường trao đổi chất nấm sợi khác đường trao đổi chất VSV đất liền Vì vậy, có sản phẩm trao đổi chất có tính chất đặc biệt hơn, khác lạ có enzym, chất kháng sinh …[18] Tuy nhiên, chưa có cơng trình sâu nghiên cứu hoạt tính sinh học chủng nấm sợi từ RNM Năm 1955, Gribb cs phân lập hai loài nấm thực vật RNM Phialophloraphoma litoralis (ngành phụ Deuteromycotina) Gnomonia longiostris (ngành phụ Ascomycotina) từ thân Avicennia marina var resinifera [63] Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 loài vi nấm RNM thuộc ngành phụ Ascomycotina, Deuteromycotina Basidiomycotina [64] Năm 1987, Hyde cs công bố phát 89 loài nấm từ Rhizophora mucronata lanak RNM Ấn Độ [66] Năm 1994, Newell S.Y phân lập loài nấm nhày (Oomycetes) ưa mặn từ mục RNM, có khả phân hủy mạnh xác động, thực vật [73] Năm 1997, theo Tadayoshi cs, chủng nấm sợi chủ yếu tìm thấy RNM Thái Lan Nhật Bản thuộc chi Trichoderma (có nhiều thân cây), Oomycetes (có nhiều rụng) [77] Ở Việt Nam, năm 2000 có thơng báo Mai Thị Hằng cs nấm sợi RNM Năm 2002, tác giả tiếp tục nghiên cứu đa dạng, nghiên cứu khả diệt côn trùng khả phân giải cacbua hydro nấm sợi từ RNM hai tỉnh Nam Định, Thái Bình Riêng RNM Cần Giờ có số nghiên cứu phân lập Cho đến nay, chưa có nghiên cứu khả sinh enzym cellulase chủng nấm sợi RNM Cần Giờ [19], [20], [21]  Một số chế phẩm enzym cellulase giới Việt Nam Ngày nay, giới Việt Nam, chế phẩm sinh học chứa VSV có khả sinh loại enzym sản xuất sử dụng ngày rộng rãi phổ biến lĩnh vực chăn nuôi, trồng trọt,… Điều giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế tình trạng nhiễm MT Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu thu nhận từ Trichoderma reesei, Aspergillus niger…và gần chủng vi khuẩn [30] Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk có chế phẩm “Celluclast” dùng thức ăn gia súc [40] Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từ T reesei từ A niger công nghiệp thực phẩm [40] Ở Nhật, hãng Amano hàng năm sản xuất 8000 chế phẩm enzym loại để dùng nông nghiệp Enzym “Panxenlase” chứa cellulase, hemicellulase, protease amylase, hoạt tính dùng chăn ni Chế phẩm “Cellubrix”, “Cellusoft”, “Onozuka” dùng công nghiệp làm mềm vải, thức ăn gia súc [40] Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol [77] Ở Liên Xô, chế phẩm “Cellolignorin” sử dụng chăn ni, hoạt tính 1-50 đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase [77] Ngồi ra, cịn có chế phẩm cellulase khác tạo nhà sản xuất: Cellulaset Novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament CT [RM], Avizyme [FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC [MJ], Cellulase TAP [AM], Cytolase [GR] [74] Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới sản xuất chế phẩm BioI, BioII, BioIII … có dạng bột, chứa enzym amylase, protease, cellulase VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho bị, heo, cá Chế phẩm có tác dụng phịng chống chứng rối loạn tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy thức ăn thừa khí thải đáy ao…[78] Trung tâm Cơng nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm Trichotech chứa vi nấm Trichoderma, chế phẩm có dạng rắn, tơi xốp, nhẹ, màu xám nâu đậm, giúp trồng chống loại nấm bệnh….[82] Công ty TNHH TM sản xuất Mai Xuân (TP Hồ Chí Minh) sản xuất chế phẩm TRICHO-MX chứa vi nấm Trichoderma, có dạng bột Có tác dụng hạn chế nấm hại, cải tạo đất, ủ phân bón cho trồng Công ty TNHH TM sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng (Bình Dương) sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh enzym cellulase, dùng xử lý nước ao ni tơm cá, kích thích tiêu hóa, gia súc…như: MD-Bio-Zemix, Biofat, Bio vitamin, Biolaczym… 1.2 Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase Rất VSV có khả sinh tất loại enzym cần thiết để phân giải cellulose dạng tinh thể Chúng phải tiết hệ enzym phức tạp, có khả phân hủy cellulose theo phương thức khác thủy phân, oxy hoá [51], [52] Cellulose bị phân rã tác dụng vi khuẩn háo khí kỵ khí Song khả phân hủy cellulose khơng nấm, vi khuẩn thường tạo enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp 0,1g/l [51] Cellulase sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn cỏ Ruminococcus albus (Berger 1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp (Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khí Clostridium sp (Parsiegla, 1998) [39], loài xạ khuẩn Streptomyces, 71  Ảnh hƣởng độ pH đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi chủng A guamensis MT 6C: 4BM, chủng P oxalicum MT 6C: 4MD, chủng A fumigatus MT 6C: 4GL Bổ sung thêm 0,5% NH4NO3, dùng HCl, NaOH điều chỉnh pH độ pH 4, 5, 6, 7, Nuôi thời gian 36- 48 Ly trích enzym xác định hoạt độ CMCase theo phương pháp 2.2.7 Kết ghi nhận bảng 3.16, đồ thị 3.9 Bảng 3.16 Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ enzym CMCase Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng A guamensis pH4 28,28 pH5 48,85 pH6 56,85 pH7 56,51 pH8 28,26 P oxalicum 28,18 55,99 56,08 56,15 34,89 A fumigatus 28,38 53,45 54,5 55,89 53,26 (Ghi chú: Số liệu tính từ phụ lục theo cơng thức phần 2.2.7) - Chủng A guamensis có hoạt độ CMCase cao pH6 (56,86 IU/g) - Chủng P oxalicum có hoạt độ cao 56,15 IU/g A fumigatus có hoạt độ cao 55,89 IU/g pH7 Kết thống với nghiên cứu Hoàng Quốc Khánh (2000) khả sinh enzym cellulase A niger RNNL-363 [24] Ở pH thấp (8) hoạt độ CMCase chủng nấm sợi giảm mạnh Nguyên nhân pH thấp, cao làm bất hoạt số enzym cellulase làm cố định enzym bên khuẩn ty nấm, enzym khơng tiết ngồi sợi nấm nên hoạt độ giảm [29] Kết minh họa lại đồ thị 3.9 CMCase (IU/g) 72 60 50 40 30 20 10 pH4 A guamensis pH5 pH6 P oxalicum pH7 A fumigatus pH8 Độ pH Đồ thị 3.9 Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Riêng chủng A fumigatus MT pH8 tổng hợp enzym cellulase cao, nên thích hợp với điều kiện sống RNM Cần Giờ  Ảnh hƣởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi: - Chủng A guamensis MT 6C: 4BM, pH6 - Chủng P oxalicum MT 6C: 4MD, pH7 - Chủng A fumigatus MT 6C: 4GL, pH7 Bổ sung thêm 0,5% NH4NO3 Điều chỉnh độ ẩm nước biển vô trùng độ ẩm 50%, 55%, 60%, 70%, 75% Sau 36-48 ni cấy, ly trích enzym xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.7 Kết ghi nhận bảng 3.17, đồ thị 3.10 Bảng 3.17 Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tên chủng Hoạt độ CMCase (IU/g) 55% 60% 70% 56,28 56,78 55,48 A guamensis 50% 38,84 75% 10,35 P oxalicum 55,9 56,6 56,29 56,15 28,11 A fumigatus 53,69 56,07 56,41 56,52 36,77 (Ghi chú: Số liệu tính từ phụ lục theo cơng thức phần 2.2.7) 73 - Chủng A guamensis có hoạt độ CMCase cao độ ẩm 60% (56,78 IU/g) Kết phù hợp với báo cáo Kim cs (1985) tốc độ sinh trưởng tối ưu Trichoderma reesei độ ẩm 60%, sinh enzym cellulase tối đa độ ẩm khoảng 50% [53] - Chủng P oxalicum có hoạt độ CMCase cao độ ẩm 55% (56,6 IU/g) - Chủng A fumigatus có hoạt độ CMCase cao độ ẩm 70% (56,52 IU/g) CMCase (IU/g) Kết minh họa lần đồ thị 3.10 60 50 40 30 20 10 50% A guamensis 55% P oxalicum 60% A fumigatus 70% 75% độ ẩm Đồ thị 3.10 Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Các tác giả Toyama Ogawa (1997) nhận xét chủng nấm sợi khác cần độ ẩm khác cho trình phát triển chúng Khi tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm chất phồng lên, tăng độ xốp tạo điều kiện cho nấm sợi tiếp xúc với chất dễ dàng Nếu tăng độ ẩm cao làm chất ẩm, độ xốp giảm ngăn khuếch tán O2 từ bên vào MT, sinh trưởng nấm chậm khả sinh enzym giảm [30] 74  Ảnh hƣởng độ mặn đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi ba chủng nấm theo điều kiện giống ảnh hưởng độ ẩm Điều chỉnh độ ẩm nước muối có nồng độ 0%, 3%, 5%, 10%, 20% Ni thời gian thích hợp, ly trích enzym theo phương pháp 2.2.16 xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.7 Kết bảng 3.18 Bảng 3.18 Ảnh hưởng độ mặn đến sinh tổng hợp enzym cellulase 0% 51,98 Hoạt độ CMCase (IU/g) 3% 5% 10% 55,32 48,17 28,43 20% 22,41 P oxalicum 53,49 55,56 40,3 28,31 26,8 A fumigatus 53,47 54,60 48,44 14,15 13,96 Tên chủng A guamensis (Ghi chú: Số liệu tính từ phụ lục theo công thức phần 2.2.7 ) Đối với nấm sợi RNM khả chịu mặn đặc điểm đặc trưng chúng Qua kết bảng 3.18 ta thấy ba chủng có hoạt độ CMCase cao MT khơng có muối, sinh enzym CMCase cao MT có nồng độ muối 3%, sau giảm dần đến 20% CMCase (IU/g) Kết minh họa lại đồ thị 3.11 60 50 40 30 20 10 0% A guamensis 3% 5% P oxalicum A fumigatus 10% 20% Độ mặn Đồ thị 3.11 Ảnh hưởng độ mặn đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi 75  Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi ba chủng MT giống MT xác định ảnh hưởng độ mặn Ly trích enzym xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.7 Kết ghi nhận bảng 3.19, đồ thị 3.12 Bảng 3.19 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh tổng hợp enzym cellulase Tên chủng A guamensis Hoạt độ CMCase (IU/g) 25 C 300C 400C 500C 26,01 56,81 52,68 36,15 P oxalicum 28,24 56,88 56,58 46,07 A fumigatus 28,22 56,49 56,24 47,21 (Ghi chú: Số liệu tính từ phụ lục theo cơng thức phần 2.2.7) Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến khả sinh enzym nấm sợi Kết cho thấy ba chủng có hoạt lực cao 30 - 400C, cao 300C CMCase (IU/g) Kết minh họa lại đồ thị 3.12 60 50 40 30 20 10 25 A guamensis 30 40 P oxalicum A fumigatus 50 nhiệt độ Đồ thị 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Nhiệt độ sinh trưởng trùng với nhiệt độ sinh tổng hợp enzym ba chủng nấm nghiên cứu 300C, nhiệt độ phổ biến RNM Cần Giờ Điều chứng tỏ chủng nấm sợi chúng tơi nghiên cứu có khả đưa vào sản xuất với điều kiện nhiệt độ đất liền 76 Kết phù hợp với kết Norkrans (1967) chủng nấm có hoạt tính phân giải cellulose cao loại nấm ưa ấm, phát triển thích hợp 25-30oC [53] Tóm lại, điều kiện MT thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase ba chủng nấm sợi nghiên cứu sau: - Tỉ lệ nguồn cacbon tốt MT có tỉ lệ cám, thấp MT 6GL: 4C - Ba chủng nấm sinh trưởng phát triển sinh enzym CMCase mạnh MT có nguồn nitơ NH4NO3 - pH thích hợp để ba chủng nấm sinh trưởng sinh enzym CMCase mạnh 6-7 - Độ ẩm thích hợp cho sinh tổng hợp enzym 55% - 70% - Độ mặn thích hợp 3% - Nhiệt độ thích hợp 300C - Thời gian thu nhận enzym tốt 36-48 3.4 Nghiên cứu đặc tính sinh học khác ba chủng nấm sợi  Hoạt tính enzym ngoại bào Chúng tiến hành nuôi chủng nấm sợi môi trường xốp sở (MT11), chiết dịch enzym theo phương pháp mục 2.2.16 Sau đó, kiểm tra khả sinh loại enzym cellulase, protease, amylase, kitinase theo phương pháp 2.2.6, kiểm tra khả phân giải dầu theo phương pháp 2.2.9 Kết bảng 3.20, đồ thị 3.13, hình 3.7-3.10 Bảng 3.20 Khả tạo enzym ngoại bào ba chủng nấm sợi Tên chủng cellulase (D-d), mm protease (D-d), mm amylase (D-d), mm A guamensis P oxalicum A fumigatus 29 27 27,5 15,5 15,5 21 18 14 21 kitinase Phân (D-d) mm giải dầu mg/ml 24 17,5 21 0 77 Kết bảng 3.20 cho thấy ba chủng có hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào mạnh Ngoài khả sinh enzym cellulase cao, ba chủng nấm sinh enzym amylase, protease, kitinase cao Sự kết hợp hoạt động enzym giúp phân giải mạnh biopolymer, nguồn chất phổ biến RNM Cần Giờ Đặc biệt, ba chủng nấm có hoạt tính enzym kitinase cao (D-d= 24mm; 17,5mm; 21mm) Nhờ chúng phân hủy xác động vật biển loài giáp xác, vỏ tôm, cua…hạn chế mùi hôi thối làm ô nhiễm MT RNM Cần Giờ Tuy nhiên ba chủng khơng có khả sinh enzym phân giải dầu Vì RNM Cần Giờ nằm sát biển nên thường bị ô nhiễm dầu tai nạn chìm tàu dầu Nếu chủng nấm sợi sinh trưởng RNM Cần Giờ có khả phân giải dầu góp phần làm MT Ba chủng nấm khơng có đặc tính quý giá (D-d)mm Kết minh họa lại biểu đồ 3.3 35 30 25 20 15 10 cellulase protease A guamensis amylase Kitinase P oxalicum A fumigatus Phân giải dầu Biểu đồ 3.3 Khả tạo enzym, phân giải dầu ba chủng nấm sợi 78 (a) (b) (c) Hình 3.7 Hoạt tính cellulase ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.8 Hoạt tính enzym amylase ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.9 Hoạt tính enzym protease ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.10 Hoạt tính enzym kitinase ba chủng nấm (Ghi chú: a A guamensis; b P oxalicum ; c A fumigatus) 79  Hoạt tính kháng sinh ba chủng nấm sợi Chúng tiến hành nuôi chủng nấm sợi MT xốp sở (MT11), chiết dịch enzym theo phương pháp mục 2.2.16 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.8 Kết bảng 3.21, hình 3.113.12 Bảng 3.21 Khả sinh kháng sinh ba chủng nấm sợi Tên chủng E.coli Bacillus subtillis (D-d), mm (D-d), mm A guamensis 5,0 1,0 P oxalicum 4,0 5,0 A fumigatus 1,0 2,0 (Ghi : Số liệu kết trung bình lần lặp lại thí nghiệm) (a) (b) (c) Hình 3.11 Hoạt tính kháng E coli ba chủng nấm a A guamensis; b P oxalicum ; (a) (b) c A fumigatus (c) Hình 3.12 Hoạt tính kháng B subtilis ba chủng nấm a A guamensis; b P oxalicum ; c A fumigatus 80 Qua kết ta thấy ba chủng nấm có khả sinh kháng sinh tiêu diệt VSV gây bệnh, mức độ đối kháng yếu Chủng P oxalicum có hoạt tính kháng sinh cao hai chủng cịn lại, điều phù hợp với cơng trình nghiên cứu kháng sinh Penicilin sinh từ nấm Penicillium Như vậy, qua kết khảo sát ta thấy ba chủng nấm sợi tổng hợp lúc nhiều loại enzym thủy phân ngoại bào mạnh cellulase, protease, amylase, kitinase, chất kháng sinh chống lại VSV gây bệnh E.coli, B subtilis 3.5 Bƣớc đầu thử nghiệm ứng dụng nấm sợi sinh enzym cellulase thực tế 3.5.1 Khả đƣờng hóa giấy in, giấy báo cũ ba chủng nấm Để thấy khả ứng dụng enzym cellulase thu nhận từ chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, tiến hành khảo sát khả đường hóa giấy in, giấy báo cũ Ba chủng nấm sợi ni cấy điều kiện thích hợp để có hoạt tính CMCase cao nghiên cứu Sau ly trích dung dịch đệm Na-acetate 50mM pH5, lọc thu dịch enzym để đường hóa giấy in, giấy báo cũ theo phương pháp 2.2.19 Sau đo hàm lượng đường khử thuốc thử DNS dựa vào đường chuẩn phụ lục Kết trình bày qua bảng 3.22 Bảng 3.22 Khả đường hóa enzym cellulase từ ba chủng nấm Dịch chiết enzym cellulase từ chủng nấm sợi Ascotricha guamensis % đƣờng hóa 11,41 Penicillium oxalicum 10,12 Aspergillus fumigatus 14,62 Hổn hợp enzym từ chủng 26,02 81 Bảng 3.22 cho thấy, enzym cellulase từ Ascotricha guamensis có khả đường hóa khoảng 11,41%, từ Penicillium oxalicum đường hóa khoảng 10,124%, Aspergillus fumigatus có khả đường hóa 14,62% Kết thấp so với nghiên cứu Trần Thạnh Phong (2004) dịch chiết từ Trichoderma Hỗn hợp dịch nuôi cấy chủng theo tỉ lệ 1:1:1 có khả đường hóa cao chủng riêng rẽ (26,02%) Do có số chủng nấm sinh loại enzym cellulase không phân cắt triệt để cellulose Các chủng nấm khác sinh loại enzym endoglucanse hay exoglucase nhiều khác Các enzym phối hợp hoạt động phân cắt cellulose thành glucose mạnh hơn, triệt để Như vậy, q trình sử dụng enzym cần có phối hợp dịch chiết enzym ba chủng nấm sợi 3.5.2 Bƣớc đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào việc phân hủy phế phụ liệu nông nghiệp làm phân bón Sau chọn ba chủng, tiến hành ủ đống rơm rạ phương pháp ủ quy mô nhỏ theo phương pháp 2.2.19  Theo dõi thay đổi số tiêu đống ủ Sau tháng, tiến hành theo dõi số tiêu so sánh với ủ hộp xốp có bổ sung dịch ni cấy nấm sợi Kết bảng 3.23 Ở lơ thí nghiệm nhiệt độ tăng cao đối chứng tác động dịch chiết enzym phân cắt thành phần cellulose rơm rạ, trình trao đổi chất tăng nhanh nên nhiệt độ tăng cao Đến tuần cuối cùng, trình phân giải rơm rạ hoàn tất, nhiệt độ giảm Trong mẫu đối chứng bắt đầu phân cắt sợi rơm nên nhiệt độ vừa tăng cao thấp so với mẫu thí nghiệm (320C) Kết mẫu thí nghiệm sợi rơm bị phân hủy thành mùn nên 82 màu sẫm lại, nhũn mềm làm phân bón cho trồng Cịn mẫu đối chứng sợi rơm màu nâu nhạt, chưa mềm nhũn Bảng 3.23 Một số tiêu theo dõi mẫu ủ Mẫu ủ Chỉ tiêu Đối chứng - Nhiệt độ đống ủ Thấp (320C) Thí nghiệm Tăng cao (380C) tuần đầu - Nhiệt độ đống ủ Cao (350C) Thấp (320C) tuần cuối - Độ giảm chiều cao 12cm 20 cm đống ủ - Màu sắc rơm rạ Nâu nhạt - Độ dai rơm Sợi mềm, Nâu sẫm không Sợi rơm mềm, nhũn nhũn Ghi chú: Đối chứng: khơng bổ sung dịch ni cấy Thí nghiệm: Có bổ sung dịch nuôi cấy Từ kết bảng 3.23 ta thấy việc bổ sung VSV vào đống ủ có hiệu ủ nhờ VSV tự nhiên có đống ủ, rút ngắn thời gian ủ, giảm ô nhiễm MT gây thời gian ủ kéo dài Mẫu ủ khơng có bổ sung dịch ni cấy nấm sợi phân hủy thời gian chậm hơn, phải kéo dài đến 65 ngày đạt độ phân hủy giống mẫu ủ có bổ sung dịch enzym  Đánh giá độ chín mẫu ủ Tiến hành trồng đậu theo lơ thí nghiệm đối chứng theo phương pháp 2.2.19 (xem kết bảng 3.24) Kết bảng 3.24 cho thấy mẫu bổ sung dịch chiết enzym từ ba chủng cho kết cao mẫu đối chứng Như phân ủ chín có hiệu cao 83 Bảng 3.24 Tỷ lệ hạt nảy mầm, trọng lượng tươi đậu xanh sau ngày trồng phân ủ từ rơm rạ STT Bổ sung dịch chiết Số hạt nảy Tỷ lệ hạt Trọng từ chủng nấm mầm (hạt) nảy mầm lƣợng tƣơi (%) thu đƣợc(g) Đối chứng 29/57 50,8 55 A guamensis 48/57 84,2 150 P oxalicum 42/57 73,7 120 A fumigatus 36/57 63,2 95 Nhiễm hỗn hợp 50,57 87,7 180 dịch chiết enzym (Đối chứng: Không bổ sung dịch chiết enzym) Mẫu nhiễm dịch chiết từ A guamensis có trọng lượng tươi 150g, tỉ lệ hạt nảy mầm 84,2% cao Do chủng có hoạt độ CMCase cao (55,70 IU/g) nên phân hủy rơm rạ thành mùn cao hai chủng lại Mẫu nhiễm hỗn hợp có lượng tươi 180g, cao mẫu nhiễm A guamensis 30g, cao mẫu nhiễm P oxalicum 50g, cao mẫu nhiễm A fumigatus 85g, đặc biệt cao mẫu không bổ sung dịch nuôi cấy nấm sợi 125g Do hoạt động phối hợp enzym từ chủng khác phân cắt sợi rơm rạ thành mùn tốt Như vậy, sử dụng hỗn hợp dịch chiết enzym cho kết cao sử dụng riêng rẽ dịch chiết chủng nấm 84 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Qua kết thí nghiệm, chúng tơi đưa số kết luận sau: Đã phân lập 312 chủng nấm sợi khác từ RNM Cần Giờ Trong có 114 chủng phân lập từ đất, 96 chủng phân lập từ lá, 102 chủng phân lập từ thân, cành Đã xác định 183/312 chủng chiếm 58,65% Trong đó: + 10/183 chủng sinh enzym mạnh chiếm 5,5% + /183 chủng sinh enzym mạnh chiếm 3,3% + 20/183 chủng sinh enzym trung bình chiếm 11% + 147/183 chủng sinh enzym yếu chiếm 80,2% Trên sở tuyển chọn ba chủng có hoạt độ cellulase cao là: chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g) chủng Đ2b (53,10 IU/g) Ba chủng nấm sợi tuyển chọn có nguồn gốc từ đất mặt RNM Cần Giờ định danh sau: - Chủng Đ’0 : Ascotricha guamensis Ames - Chủng Đ’3 : Penicillium oxalicum Currie & Thom - Chủng Đ2b : Aspergillus fumigatus Fresenius Đã xác định điều kiện MT tối ưu cho sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase ba chủng nấm sợi là: - Nguồn cacbon tốt MT có tỉ lệ cám : bã mía - Nguồn nitơ tốt NH4NO3 - Độ pH= 6-7 - Độ ẩm MT 55-70% - Độ mặn thích hợp 3% - Nhiệt độ thích hợp 300C - Thời gian thu enzym tốt 36- 48 85 Kết nghiên cứu số đặc điểm sinh học ba chủng nấm sợi cho thấy chúng có khả sinh loại enzym cellulase, protease, amylase, kitinase Có khả đối kháng với loại VSV kiểm định (G+, G-) E coli, B subtilis Bước đầu thử nghiệm sử dụng ba chủng nấm sợi vào thực tế cho thấy chúng có khả đường hóa giấy in, giấy báo cũ; có khả chuyển hóa nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho trồng  Kiến nghị - Tách chiết tinh enzym cellulase với hàm lượng hoạt tính cao từ MT ni cấy thích hợp chủng - Tiếp tục thử nghiệm ứng dụng enzym cellulase ba chủng nguồn chất khác để làm tăng hiệu ứng dụng đề tài ... giống 0C Các mẫu phân lập không giữ 24 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập mẫu trực tiếp pha loãng mẫu theo Uyenco, 1988 [58], [78] a- Lấy mẫu pha loãng mẫu Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu,