KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN HUYỆN CẦN GIỜ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Để góp phần nghiên cứu, tìm hiểu về giá trị tài nguyên từ nấm sợi ở RNM và tiềm năng của chúng trong thực tiễn,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

PHAN THANH PHƯƠNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN HUYỆN CẦN GIỜ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành : Vi sinh vật

Mã số : 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS TRẦN THỊ THANH

TS TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh – 2007

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong suốt quá trình phát triển của nhân loại, loài người luôn phải đấu tranh vượt qua mọi trở ngại, thách thức khác nhau Bệnh tật chính là một trong số các trở ngại đó và rất nhiều bệnh có nguyên nhân do vi sinh vật (VSV) gây ra Từ rất xa xưa trong lịch sử, bằng con đường tìm tòi, khám phá và tích lũy kinh nghiệm thực tiễn, con người đã phát hiện và ứng dụng hiệu quả nhiều nguồn dược liệu vào mục đích điều trị y học Với sự phát triển của VSV học, với bước ngoặt lịch sử là phát minh vĩ đại của Alexander Fleming (1928) đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra chất kháng sinh và ứng dụng chất kháng sinh vào điều trị cho con người

Chất kháng sinh (CKS) không những trở thành thần dược cứu sống con người

mà còn được ứng dụng rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm

và bảo vệ môi trường Để phòng chống nấm hại cây trồng , trong nền nông nghiệp hiện đại, người ta càng sử dụng nhiều CKS có nguồn gốc VSV để thay thế dần các hóa chất đã sử dụng vốn rất độc đối với con người và môi trường Vì vậy, việc thay thế thuốc trừ sâu hóa học bằng các chế phẩm sinh học là một giải pháp an toàn và hiệu quả, khắc phục được nhược điểm của nông dược trong bảo vệ thực vật và sức khỏe cộng đồng

Ở nước ta cũng như các nước đang phát triển việc lạm dụng thuốc KS, việc các VK gây bệnh ở người đang kháng nhiều loại KS thông thường, ngày càng xuất hiện nhiều chủng VSV kháng thuốc nên việc điều trị bằng kháng sinh trở nên rất khó khăn cho các thầy thuốc lâm sàng.Việc tìm kiếm CKS mới nhất là các CKS có nguồn gốc từ thiên nhiên, do các VSV tiết ra chống lại các VSV gây bệnh đã lờn thuốc đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, đó là một việc làm vô cùng cấp thiết và quan trọng

Trong quá trình tìm kiếm ấy con ngươi luôn quan tâm đến nhóm VSV sinh CKS ở các hệ sinh thái đặc biệt, trong đó có nấm sợi RNM Các nhà khoa học tin rằng với môi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của chúng cũng khác hơn so với với các sinh vật trên đất liền Vì vậy các sản phẩm trao đổi chất có tính chất khác lạ, trong đó sẽ có các CKS mới Tuy nhiên sự hiểu biết về VSV ở RNM

còn rất hạn chế và là lãnh vực còn bỏ ngỏ Nấm sợi là một đại diện quan trọng của hệ VSV RNM Tìm hiểu về nấm sợi có khả năng sinh KS, vai trò của chúng trong hệ sinh thái RNM là việc làm rất cần thiết Đặc biệt đối với nấm sợi sinh KS thì việc nghiên cứu tìm ra chất kháng sinh mới đang là đề tài hấp dẫn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học thuộc các lãnh vực khác nhau vì chất kháng sinh đã vuợt ra khỏi phạm vi y học So với y học việc sử dụng chất kháng sinh sinh ra từ nấm sợi trong bảo vệ thực vật, bảo quản thực phẩm v v còn hạn chế

Để góp phần nghiên cứu, tìm hiểu về giá trị tài nguyên từ nấm sợi ở RNM và tiềm năng của chúng trong thực tiễn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“ Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh”

2 Lược sử vấn đề nghiên cứu

- Chưa có tác giả nào nghiên cứu "Nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ TPHCM có khả năng sinh kháng sinh"

- Có một số đề tài nghiên cứu có liên quan về nấm sợi ở RNM như:

+ “ Tổng kết kết quả nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của nhóm nấm sợi phân lập từ một số RNM ở hai tỉnh Nam Định và Thái Bình” của tác giả Mai Thị Hằng (2002)

+ “ Khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm sợi phân lập từ một số khu RNM Nam Định và Thái Bình” của tác giả Mai Thị Hằng, Lê Thanh Huyền (2002)

+“ Khảo sát khả năng ký sinh gây bệnh côn trùng và tiềm năng kiểm soát sinh học của nấm RNM Nam Định của tác giả Mai Thị Hằng, Nguyễn Vĩnh Hà (2002)

3 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh kháng sinh có thể sử dụng vào ức chế VSV gây bệnh ở người, cây trồng

4 Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM huyện Cần giờ có hoạt tính kháng sinh

- Các VSV kiểm định nhận từ viện Pasteur, Viện khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam, khoa Nông học Đại học Nông Lâm TPHCM, khoa xét nghiệm Bệnh viện Bình Dân

- Sâu tơ nhận từ công ty Vipesco; tằm nhận từ công ty Dâu tằm tơ, Bảo lộc

5 Phạm vi nghiên cứu

Các chủng nấm sợi sinh kháng sinh có nguồn gốc từ RNM

6 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng kháng sinh từ RNM

huyện Cần Giờ

- Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản của các chủng nấm sợi tuyển chọn (đặc

điểm sinh học và phân loại)

- Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn trong phòng và chống bệnh, sâu hại cho cây trồng

7 Phương pháp nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi bằng phương pháp vi sinh

- Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản, phân loại các chủng nấm sợi bằng phương pháp hóa sinh

- Xử lý số liệu thu thập bằng phương pháp sử dụng toán học thống kê đơn giản

8 Dự kiến cấu trúc luận văn

Gồm:

- Mở đầu

- Chương 1: Tổng quan tài liệu

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và bàn luận

- Kết luận và kiến nghị

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 5 năm 2006 đến tháng 7 năm 2007

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nấm sợi và khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi

1.1.1 Đặc điểm của nấm sợi [6]

Nấm sợi là những vi sinh vật có nhân chuẩn thuộc nhóm vi nấm, được phân bố khắp nơi như đất, nước, không khí, sản phẩm từ sinh vật, bản thân các sinh vật kể cả con người

Nấm sợi sống kí sinh ở động, thực vật hoặc hoại sinh trên chất hữu cơ từ xác động, thực vật, chúng là loài hô hấp hiếu khí bắt buộc, không chứa diệp lục tố, không

có khả năng quang hợp [13]

Nấm sợi là VSV ưa mát (Psychrotroph), có nhiệt độ tối ưu khoảng 250C, nhưng cũng có thể thích nghi với 00C Nấm sợi sống trong môi trường có pH hơi axít đến trung tính (pH 3- 6) Mặc dù sự sinh trưởng của nấm sợi không cần ánh sáng nhưng ánh sáng lại có tác dụng hình thành bào tử, tổng hợp sắc tố [8]

1.1.1.1 Hình tháí, cấu tạo [54]

Nấm sợi có cấu tạo sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, có vách ngăn ngang hoặc không có vách ngăn ngang Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn (nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm thông thường là 5-10 µm)

Sợi nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn, vừa dài ra không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony).Tùy theo môi trường cơ chất mà hệ sợi nấm sẽ phát triển thành các dạng khác nhau Vào giai đoạn cuối của sự phát triển, khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm Hiện tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao nhưng lại ít gặp ở các sợi nấm dinh

dưỡng của nấm bậc thấp Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm

có tác dụng tiết xuất các chất nào đó Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen, hạt volutin, các giọt mỡ [51]

Nấm sợi chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, vì thế chúng phát triển trên bề mặt cơ chất (khuẩn ty khí sinh) tạo thành lớp hình sợi, lớp mạng nhện hay lớp sợi bông Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút chất dinh dưỡng (khuẩn ty cơ chất) Bên trong khuẩn ty có một nhân, hai nhân hay nhiều nhân [9]

Vách ngăn

TBC

Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm, sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc Vì bào tử của nấm thường có màu nên cả khuẩn lạc thường có màu [54]

Nấm sợi có cấu tạo của một tế bào có nhân thực, gồm ba thành phần cơ bản của cơ thể sống: thành tế bào, nguyên sinh chất, nhân Màng tế bào có cấu tạo bởi cellulose hoặc các chất gần giống cellulose Màng có cấu trúc đặc trưng từng loài Không có diệp lục nên nấm sợi không có khả năng quang hợp

Trong tế bào nấm còn có các cơ quan như ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), thể ribôxôm (ribosome), bào nang (vesicle), thể Golgi sinh (Golgi body, Golgi apparatus, dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể Vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitôxôm đường kính 40 -70nm (chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5- 8 nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome)

Hình 1.4 Cấu trúc sợi nấm [54]

Không bào

Sợi nấm Vùng kéo dài

Thể Golgi

Màng Tế bào Thành Tế bào

A Nucleic

Ti thể

Màng nhân

1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Nấm sợi là những sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, thuộc loại hoại sinh

Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau nấm sợi thường có những nhu cầu không giống nhau về các nguồn thức ăn cacbon Chúng có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat, amino acid đến amonia Sự thích hợp của một nguồn gốc thức ăn cacbon nào đó có thể được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác nhau như mức độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa số lượng bào tử, mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hóa Sự sinh trưởng tối đa của

hệ sợi nấm thường không phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất Hầu hết các loại nấm sợi có thể đồng hóa trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ đường [12]

Các loài nấm sợi khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn nitơ, chúng sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ lẫn vô cơ Nhiều loài nấm sợi (thuộc các

chi Aspergillus, Penicillium) có khả năng khử nitrat hóa Một số loài như Aspergillus

flavus, Trichoderma lignorum, Myrothecium verrucaria… có khả năng đồng hóa

trực tiếp nitơ phân tử [12]

Các nguyên tố vi lượng có liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh học trong tế bào nấm sợi Các loại nấm sợi có quan hệ rất khác đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm sợi có thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống [12]

Ngoài các chất dinh dưỡng nấm sợi cũng như tất cả các sinh vật khác còn có nhu cầu về nước cho các họat động sinh lý, sinh hóa của tế bào Liên quan đến lượng nước còn có độ ẩm Các yếu tố này ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng (độ ẩm không khí không thấp hơn 60 %) Khả năng hấp thụ hay thoát nước của nấm đều liên quan với nhiệt độ môi trường, khoảng từ 15- 300C, tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 300C, tùy loài [12]

Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi rõ rệt là pH, bình thường chúng tăng trưởng ở pH = 6 Môi trường kiềm hoặc

acid, thì nấm sợi không hoặc tăng trưởng rất yếu [12] Riêng các loài Trichoderma

thường xuất hiện ở đất ưa axít, phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và chúng có thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu ở đó có một lượng lớn CO2 và bicacbonat [22]

1.1.1.3 Phương thức sinh sản

Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử mọc ra từ sợi nấm và sau đó là

hệ sợi nấm Bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính Chúng khác nhau về hình dạng và cách phát sinh

* Sinh sản vô tính: Có 3 loại bào tử vô tính:

tử hình trứng, cầu, hạt chanh [51]

* Sinh sản sinh dưỡng: sinh sản bằng khuẩn ty hoặc bằng hạch nấm, đây cũng

là hình thức sinh sản vô tính

* Sinh sản hữu tính:

+ Phương pháp đẳng giao, dị giao, noãn giao

+ Bào tử tiếp hợp (zygospores)

+ Bào tử túi (ascospores)

+ Bào tử đảm (basidiosppores)

Phương thức sống của nấm sợi: dị dưỡng, phần lớn hoại sinh, một số sống ký

sinh trên người, động thực vật, còn một số khác thì sống cộng sinh

Hình 1.5 Sự tiếp hợp của nấm sợi [54]

a b

Hình 1.6 Dạng bào tử kín Hình 1.7 Dạng bào tử trần của nấm sợi.(a-b)

1.1.1.4 Phân loại nấm sợi

Vi nấm là thuật ngữ dùng để chỉ tất cả các loại nấm hiển vi (nấm men và nấm sợi) không sinh quả thể lớn (mũ nấm).Việc phân loại vi nấm nói chung và nấm sợi nói riêng vẫn đang ở thời kì phân loại học hình thái dựa vào các đặc điểm hình thái nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý sinh hóa và phương thức sinh sản Các phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử được sử dụng ít trong phân loại vi nấm

Nhà nấm học Italia P A Saccardo (1845-1920) đã chỉnh lý các nghiên cứu về

nấm và biên soạn bằng tiếng La Tinh 25 tập Kỷ yếu nấm Các thành tựu nghiên cứu

đã được tổng kết khá đầy đủ trong 5 tập sách Giới nấm (The Fungi) của G C

Ainsworth và cộng sự (Vol 1, 2.3.4A.4B New York and London: Academic Press,

1963-1973) Năm 1995 đã tái bản lần thứ 8 cuốn Từ điển về nấm (Dictionary of the

Fungi) của Ainsworth và Bisby Nấm được chia thành 4 ngành (Division, Phylum):

- Ngành Chytridiomycota

- Ngành Zygomycota

- Ngành Ascomycota

- Ngành Basidiomycota

Các loài nấm không tìm thấy (đúng ra là chưa tìm thấy) dạng sinh sản hữu tính

được xếp chung vào nhóm Nấm bất toàn – Fungi imperfecti Theo hệ thống phân loại

của Saccardo (1880,1886) thì các nấm này được xếp thành một lớp- Lớp

Deuteromycetes Khi phát hiện thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì người ta đổi tên

loài và xếp sang các lớp khác Ví dụ nấm lúa von trước kia được gọi là Fusarium

moniliforme, nhưng sau khi tìm thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì lại chuyển thành

loài Gibberella fujikuroi Các Nấm bất toàn hiện được xếp trong các nhóm conidial

Ascomycetes hay conidial Basidiomycetes

Nấm bất toàn (Deuteromycota), nấm đảm (Basidiomycetes), nấm túi (Ascomycetes) được xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J.Carlile et al, 2001) Nấm

bất toàn là giai đoạn vô tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm.[55]

Khóa phân loại đến lớp (Robert A.Samson, 1984) :

1 Lớp nấm túi (Ascomycetses): bào tử sinh ra trong túi bào tử

2 Lớp nấm tiếp hợp (Zygomycetes) bào tử kín sinh ra trong các nang bào tử

kín, hệ sợi không có hoặc có ít vách ngăn

3 Lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) : sợi nấm có vách ngăn, bào tử trần

Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953) Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm:

- Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá

sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá)

- Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào

tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata [16]

- Nhóm Agonomycetes : gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần

4 Lớp nấm đảm (Bacidiomycetes) : sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính số

ít bằng bào tử trần, chủ yếu bằng bào tử đảm [54]

Người ta cho rằng trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10 000 chi và 70 000 loài, Trung Quốc đã điều tra

được 40 000 loài Riêng các loài nấm thuộc Nấm bất toàn ở nước ta hiện mới chỉ phát

hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004) Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội hiện đang hợp tác với Viện NITE (Nhật Bản) điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm

ở Việt Nam và có nhiều khả năng tìm thấy những loài mới trong quá trình nghiên cứu [54]

Hiện tồn tại nhiều hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, có nhiều khóa phân loại đã được sử dụng như: Saccardo P A (1880- 1886), Barron G.L (1968) Barnett H.L và cộng tác viên (1972), Ainsworth G C (1973), V.Arx (1981), Bùi Xuân Đồng (1984), Alexopoulos & Mins (1996), Nguyễn Lân Dũng (2000), Đặng Hồng Miên (1999), Nguyễn Đức Lượng (2003), Persoon ex Gray (1801) Sự phân loại vi nấm đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic clasifications) và đã bắt đầu dựa vào sự phát triển của sinh học phân tử

Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa phân loại: Nguyễn Lân Dũng (2000)(trong tài liệu này có khóa phân loại của Saccardo P A (cải tiến), Barnett H.L và cộng tác viên (1972)), Bùi Xuân Đồng (1984), Nguyễn Đức Lượng (2003), Đặng Hồng Miên (1999)

1.1.2 Chất kháng sinh từ nấm sợi

1.1.2.1 Những đặc điểm cơ bản về chất kháng sinh

* Chất kháng sinh được hiểu là chất hóa học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật) với đặc tính

là ở ngay nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc các vi sinh vật gây bệnh hay các tế bào ung thư (ở nồng độ thấp:

10-3- 10-2 / g /ml) mà vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị [4]

* Có giả thiết cho rằng chất kháng sinh là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên hoặc cạnh tranh môi trường dinh dưỡng Cũng có giả thiết lại cho rằng chất kháng sinh chỉ là sản phẩm thải trong quá trình trao đổi chất của tế bào[5] Thường các CKS không có chức năng rõ rệt đối với tế bào sản sinh ra chúng Sự mất khả năng hình thành CKS không làm mất khả năng sinh trưởng

* Bản chất của chất kháng sinh : CKS là nhóm chất rất đa dạng về mặt hóa học, trọng lượng phân tử biến động trong khoảng 150 - 5000 Dalton Trong một số kháng

sinh chỉ chứa cacbon (C), hiđrô (H) hoặc thường chứa C, H, O, N, một số khác còn

có S, P, halogen

Trong phân tử kháng sinh thường chứa các nhóm chức như: hydroxyl (-OH), cacboxyl (-COOH), cacbonyl (-CO), các nhóm định chức chứa nitơ đồng thời có cấu trúc đặc trưng của chất hữu cơ (mạch béo, vòng béo, vòng thơm, polipeptit, dị vòng cacbonhydrat ) Cho đến nay, CKS đều ở thể rắn, có cấu tạo hóa học rất khác nhau [41], gồm các nhóm sau:

 Nhóm - lactam: chứa hệ thống vòng - lactam, dị vòng phức tạp

Như Penicillin, Monolactam, Cephalosporin và hàng loạt nấm khác cũng sản sinh ra

CKS chứa hệ thống vòng này

 Nhóm aminoglucoside: chứa nhiều các đường amin nối với các đường amin khác bởi liên kết glucoside, như streptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin

 Nhóm teracylin: có cấu tạo hóa học vòng naphthalen, gồm clotetraxyclin, oxytetraxyclin, tetraxyclin có phổ kháng khuẩn lớn

 Nhóm macrolit: chứa vòng laton lớn nối với aminosacaroza và nhóm polyen, tiểu biểu là erythromycin

 Nhóm polipeptit: có cấu tạo gồm các axít amin [41]

* Tùy theo mục đích và phương pháp nghiên cứu, các nhà nghiên cứu đã phân loại CKS theo nguyên tắc sau:

- Phân loại theo nguồn gốc sinh học của chủng sinh ra chất kháng sinh

- Phân loại theo phổ kháng sinh

- Phân loại theo cơ chế tác dụng hay cơ chế sinh tổng hợp ra CKS đó

- Phân loại theo cấu tạo hóa học

* Cơ chế tác động của kháng sinh lên vi sinh vật [54]

Cơ chế tác động của CKS phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ chế phẩm, cấu trúc hiển vi của tế bào VSV và điều kiện biểu hiện của chúng Khác với các chất độc, CKS có tác dụng đặc hiệu, tính đặc hiệu đó gắn kiền với cơ chế tác động Cơ chế tác động của CKS có thể được chia thành các nhóm cơ bản sau:

- Ức chế quá trình tổng hợp của thành tế bào (vỏ) của vi khuẩn Các nhóm

KS gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác động lên quá trình tổng hợp

thành tế bào nên làm chovi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp xuất thẩm thấu

- Ức chế chức năng họat động của màng tế bào Các nhóm kháng sinh gồm

có: colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

CKS thuộc nhóm này gồm nhiều chất như streptomyxin, erythromixin, tetraxilin, cloramphenicol gây cản trở tổng hợp prôtêin

Tác động của một số loại CKS này như sau:

Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác

Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

- Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

Các CKS có thể gắn vào axít nuclêic (AND, ARN) tạo thành phức phân tử bất hoạt, ngăn cản sự sao chép của các axít này

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA -gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA

Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid

Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nuclêic [54]

CKS nhóm này thì rất độc không những đối với VSV mà còn độc cho người và các VSV khác [11]

1.1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh

Trong quá trình sống, cơ thể vi sinh vật thường xuyên trao đổi chất với môi trường ngoài tạo ra các sản phẩm trao đổi chất khác nhau

- Sản phẩm trao đổi chất sơ cấp là những sản phẩm cần thiết cho sự sống của tế bào, chúng là những vật chất tham gia xây dựng tế bào như các axít amin, vitamin, nuclêôtic

- Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp là những sản phẩm về mặt hóa học là những hợp chất có cấu tạo cực kỳ phức tạp, chúng không có chức năng rõ ràng trong trao đổi chất của tế bào như chất kháng sinh, giberelin, độc tố nấm, các polysacarit

* Quá trình tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố trong

đó có thành phần môi trường (nguồn cacbon, nitơ, nguyên tố vi lượng, phương pháp nuôi cấy, tuổi giống, độ thông khí…) và điều kiện nuôi cấy Vì vậy khi nuôi cấy chúng ta tìm điều kiện tối ưu cho các yếu tố trên để hiệu suất tổng hợp chất kháng sinh cao nhất

- Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc của nguồn thức ăn Tùy thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp như các loại đường đơn như glucose, manitol, các loại đường kép như saccarose, lactose, cũng có thể là các loại đường đa như tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường….Có nhiều chủng nấm sợi có hoạt tính cellulaza cao nên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là CMC [11]

- Nguồn nitơ và nồng độ ni tơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh Quá trình sinh tổng hợp CKS ở nấm sợi thường cần cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môi trường

- Vai trò của phốt phát vô cơ cũng là một trong những yếu tố điều chỉnh sự tổng hợp CKS Nồng độ phốt phát thích hợp cho sinh tổng hợp CKS không quá 10mg/ml Nồng độ phốt phát ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axít nuclêic trong tế bào, làm kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS Ngoài ra sự dư thừa phốtphát cũng ức chế tổng hợp các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp CKS

- Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường nằm trong khoảng từ 28- 30

0C Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc đáng kể vào pH môi trường, pH thích hợp cho việc

tổng hợp CKS là trung tính, môi trường hơi ngả về axít, pH axít hay kiềm đều ức chế quá trình tổng hợp CKS

- Ngoài ra chất lượng bào tử của giống, tuổi, khả năng đồng đều về mặt di truyền, hoạt tính trao đổi chất cũng ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp CKS

1.1.2.3 Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi

Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học Bệnh truyền nhiễm trước đây trong một thời gian dài đã là mối đe dọa rất lớn đối với con người và các VSV khác Do vậy việc tìm kiếm thuốc chữa bệnh cho con người, từ lâu đã là mơ ước của nhiều nhà khoa học nói riêng và của nhân loại nói chung Và đã có nhiều CKS đã được phát hiện từ nấm sợi như:

- Penicillin:

Chất kháng sinh penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928, trong khi làm

vệ sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp pêtri

nuôi Staphylococcus bị niễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện hiện tượng

vòng vô khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm Khi ông cấy nấm mốc trên thử nghiệm lại trên một số loài vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiện tượng tương tự xảy ra Từ đó ông kết luận là nấm mốc đã tiết ra môi trường một chất nhất định làm

tan vi khuẩn và ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất

kháng sinh này (1929) Công trình khoa học của Fleming ngay lập tức thu hút được

sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới, trong đó có các nhà khoa học

Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nổ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh

của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên [4]

Mãi đến năm 1945 , ông mới được nhận giải thưởng Nobel

Năm 1938, ở Oxford, Ernst Boris Chain và Norman Heatley đưa Penicillium

vào sản xuất thử Và chỉ sau hai năm đã tinh chế một lượng lớn penicillin, đủ để thử nghiệm trên chuột thí ngiệm và kết quả điều trị đã thành công mỹ mãn, ngày 25/05/1940 [26]

Năm 1940, Dorothy Hodgkin xác định được cấu trúc phân tử của Penicillium

[26]

Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium chrysogesrum có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium notatum tìm ra trước đó

Năm 1946 – 1950, hàng loạt chất kháng sinh đã được phát hiện, hàng loạt nhà

máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủ yếu là Penicillin, khẳng định giá trị to lớn của

Penicillin sử dụng trong chữa bệnh

Kể từ đó một kỷ nguyên mới trong y học- kỷ nguyên chất kháng sinh ra đời

Tiếp theo Penicillin hàng loạt chất kháng sinh đã được tìm kiếm và phát hiện

-Cephalosporin:

Năm 1948, Brotzu chiết từ chủng nấm mốc thuộc giống Cephalosporium sp có

khả năng chống được cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-) đặc biệt là

Vibriocholerac Ngày nay người ta phát hiện nhiều loài nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn

khác nhau có khả năng tổng hợp cephalosporin[2] Tuy nhiên hoạt tính của

Cephalosporin thì kém hơn hoạt tính của Penicillin

- Griseofulvin:

Năm 1959, Oxford và đồng sự phát hiện do chiết được từ một số loài nấm mốc

thuộc giống Penicilium (Pen.urticae, Pen.nigricans, Pen.raistrichi ) Griseofulvin

không có hoạt tính chống vi khuẩn nhưng có khả năng chống nấm khá mạnh nên dùng để chữa bệnh nấm cho người và gia súc

Năm 1959, các nhà khoa học Anh, Mỹ đã tách được vòng penicillin, mở đầu

cho hàng loạt các loại kháng sinh tổng hợp [26]

Năm 1960, người ta đã bắt đầu tổng hợp được Griseofulvin bằng con đường

Glytoxin không bền vững và bị phân hủy nhanh trong ánh sáng Phổ kháng sinh của nó chống các vi khuẩn gram dương và các nấm gây bệnh Trong kết quả thực nghiệm glytoxin không thể hiện hiệu quả chống nhiễm trùng lao của chuột, không ngăn cản sự phát triển của u ác tính Hoạt tính kháng sinh của glytoxin liên quan với sự có mặt trong phân tử là nhóm chứa lưu huỳnh

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hổ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã tạo điều kiện thuận lợi cho lãnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao

Các phương pháp hiện đại về kỹ thuật di truyền, công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần đã nâng cao khả năng sinh tổng hợp CKS trong thời gian ngắn

Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như AND tái tổ hợp, kỹ thuật

tách dòng gen và biểu thị sự tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những đem lại kết quả

to lớn trong việc phát triển chủng, giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các chất kháng sinh Kỹ thuật enzym bất động được coi là một trong những phương hướng nghiên cứu, sản xuất CKS trong những năm cuối thế kỉ 20 và đầu thế kỉ 21

Ngày nay, tuy đã có hàng ngàn CKS mới được phát hiện nhưng các nhà nghiên cứu trên thế giới vẫn đang chạy đua trong việc tìm tòi và tổng hợp CKS mới, đặc biệt là CKS chống virút và chống ung thư

Ở Việt Nam việc nghiên cứu và sản xuất CKS bắt đầu từ năm 1949 do giáo sư

bác sĩ Đặng Văn Ngữ tiến hành với các chủng Penicillium và thu được dịch lọc

penicillin (sử dụng trong điều trị vết thương cho các bệnh binh) Sau kháng chiến 9 năm, công trình được tiếp tục nghiên cứu ở trường ĐH Y Dược, Hà Nội

Cho đến nay nghiên cứu CKS đã được quan tâm của nhiều nhà khoa học đầu ngành, thuộc viện Công nghệ sinh học – Trung tâm khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, trường Đai học khoa học tự nhiên Trường Đai học Sư Phạm I Hà Nội đã

có nhiều công trình nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng, Nguyễn Thành Đạt về nấm sợi và vai trò đối kháng của chúng trong hệ sinh thái RNM Tác giả Vũ Thị Đoan Chính là người đầu tiên ở Việt Nam đã sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần để nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh

Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng những nghiên cứu về CKS của chúng ta còn hạn chế so với thế giới

1.1.2.4 Lược sử quá trình nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi ở rừng ngập mặn

Nấm trên đất liền đã được hệ thống hóa từ lâu, nhưng sự nghiên cứu về nấm ở rừng ngập mặn mới chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ những năm 1950 và ban đầu rất ít Cho đến nay các nhà nghiên cứu nấm đã thành lập hội nghiên cứu nấm toàn cầu trong đó có các nấm ở rừng ngập mặn

Người ta nhận ra rằng sinh cảnh rừng ngập mặn là môi trường lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nhất là nấm sợi

- 1955-1956 hai loài nấm đầu tiên được phát hiện ở rừng ngập mặn:

Phialophloraphoma litoralis Linder (ngành phụ Deuteromycotina) và Gnomonia longiostris Cribb (ngành phụ Ascomycotina) từ thân cây Avicennia marina var.resinifera do Cribb và cộng tác viên phân lập và phân loại [16]

- 1971- 1975 Jones và Hughes đã xuất bản tài liệu về phương pháp nghiên cứu nấm biển[46]

- Năm 1979 Kohlmeyer và cộng tác viên đã đưa ra danh sách 42 loài vi nấm

rừng ngập mặn, trong đó có 23 loài thuộc ngành phụ Ascomycotina, 17 loài thuộc ngành phụ Deuteromycotia và 2 loài thuộc ngành phụ Basidiomycotina [46]

- Năm 1987, Hyde và cộng tác viên công bố phát hiện 89 loài nấm từ cây

Rhizophora mucronata lanak (Ấn độ) có gần 300 chủng nấm từ lá cây, chủ yếu là

nấm ký sinh

- Năm 1988, Subramanian tìm ra 55 giống nấm sợi kí sinh trên lá R.apiculata

và R.mucrolata [46]

- Năm 1994, Newell S.Y, đã phân lập được các loài nấm nhày (lớp Oomycetes)

ưa mặn, có khả năng phân hủy mạnh xác thực vật ở rừng ngập mặn

- Năm 1997, Tadayoshi và cộng tác viên, đã tìm thấy nấm sợi thuộc chi

Trichoderma (ở thân cây), Oomycetes (có nhiều ở lá rụng) [16]

Hầu hết các nhà nghiên cứu dừng lại ở sự phân lập, phân loại và sự phân bố của chúng ở trong các rừng ngập mặn ở trong các khu vực địa lý khác nhau Với số lượng nấm được phát hiện khá nhiều nhưng các nhà nghiên cứu chưa đi sâu vào

nghiên cứu vai trò của chúng trong quá trình phân hủy xác thực vật Một số ít nghiên cứu về sự phân bố của loài nấm phụ thuộc vào vị trí đại lý, độ màu, độ pH, vi sinh vật, độ mặn của nước biển chảy vào rừng

Các chất có hoạt tính sinh học do VSV rừng ngập mặn sinh ra đang có ít nhà khoa học nghiên cứu, chủ yếu nghiên cứu về enzym phân giải ligno- xenluloza

Trong những năm gần đây, người ta đã phát hiện ra nấm biển, nấm ở rừng ngập mặn là nguồn vi sinh vật có tiềm năng sinh kháng sinh mới chống các vi sinh vật nhờn kháng sinh, hay các tế bào gây ung thư Ở môi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của chúng sẽ có gì đó khác hơn với con đường trao đổi chất của sinh vật đất liền Vì vậy rất có thể có các sản phẩm trao đổi chất có tính chất gì đó hơi khác lạ, trong đó có cả chất kháng sinh mới [16]

Từ các nấm Halocyphina villosa, Kupa và cộng sự (1981) đã thu được chất

kháng sinh có tên Siccayene, có hoạt tính kháng khuẩn cao

Năm 1999, từ thân cây gỗ rừng ngập mặn, Darfenner và cộng sự đã phân lập

được nấm Hypoxylon croceum M 97- 25 sinh ra chất chống nấm mạnh: sordarin và

hyposordarin [46]

Năm 2001, từ Zofiella marina thu được kháng sinh zofimatin có cấu trúc tương

tự sordarin nhưng lại có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gram âm và gram dương Chất himaninide A, B, C, D có khả năng diệt vi khuẩn và nấm rất mạnh Các lòai của

chi Geronema Sing phân lập từ các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới sinh ra chất

geronemins (A,B,C,D), ức chế quá trình tổng hợp các đại phân tử trong tế bào Chất

herical và dẫn xuất của nó thu được từ Hypoxylum ramosum cũng có khả năng ức

chế mạnh các loại tế bào Các chất này đang được nghiên cứu về khả năng diệt các tế

bào ung thư như tế bào Hella S 3 (ung thư biểu mô, ung thư vùng cổ), tế bào L 1210

(ung thư máu), tế bào KB (ung thư miệng, vòm họng…) [16]

Các nấm sợi tồn tại trong hệ sinh thái RNM đã có tài liệu công bố về khả năng

diệt côn trùng của tác giả Nguyễn Vĩnh Hà (2002) [16], chủng P.farinosus NT 33

Đây là lãnh vực còn bỏ ngỏ mà chúng ta cần nghiên cứu để làm giàu thêm bộ sưu tầm

vi nấm diệt sâu hại và sử dụng chúng để kiểm soát quần thể côn trùng gây hại, ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

Ngoài ra còn có các công trình nghiên cứu về vấn đề nấm sợi ở RNM của các tác giả Lê Thanh Huyền, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thị Hiên dưới sự hướng dẫn của

TS Mai Thị Hằng (2002)

1.1.3 Ứng dụng của nấm sợi và các CKS từ nấm sợi

1.1.3.1 Ứng dụng KS từ nấm sợi trong điều trị bệnh truyền nhiễm và hiện tượng lờn thuốc của vi sinh vật gây bệnh

Từ khi Penicillin được sản xuất để đưa vào điều trị, sự phát triển của kỹ nghệ kháng sinh đã giúp cho thầy thuốc những công cụ hữu hiệu trong việc kiểm soát và khống chế các bệnh nhiễm khuẩn Việc sản xuất CKS, sử dụng CKS trong trị liệu cùng với thời gian, nhiều chế phẩm bán tổng hợp và tổng hợp ra đời Song song với

sự kiện này, con người cũng biết đến hiện tượng lờn thuốc mà bản chất là sự phát triển tính đề kháng kháng sinh của tác nhân gây bệnh Tỉ lệ đề kháng của vi khuẩn và

số thuốc bị đề kháng đang ngày càng gia tăng Hiện nay, ngoài các vi khuẩn

Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Enterococcus đã kháng thuốc [Levy, 1998],

chúng ta còn phải chú ý những trường hợp nhiễm khuẩn do S aureus kháng Methicillin thuộc nhóm Penicillins ức chế được -lactamase, và những chủng vi khuẩn đường ruột kháng các Cephalosporins phổ rộng Ở các bệnh viện, chủng phân

lập nhiều nhất từ bệnh phẩm là Pseudomonas aeruginosa, E coli, Enterobacter spp.,

và Staphylococcus aureus Quá trình theo dõi mức độ đề kháng của các tác nhân trên

trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhằm báo động về hiện trạng kháng thuốc ở bệnh viện và cung cấp vài thông tin có thể hữu dụng cho việc trị liệu kháng sinh [56]

* P aeruginosa- trực khuẩn mủ xanh gây bệnh nghiêm trong ở các vết mổ,

viêm niệu đạo, viêm phổi, viêm tai ở người đi bơi, màng não mủ đã đề kháng với hầu

hết các lọai kháng sinh Khi kiểm nghiệm trên bệnh nhân và trong in vitro P

aeruginosa đã đề kháng hàng lọat kháng sinh như mezlocillin, ceftazidin, netilmicin,

aztreonam, mipenem, mezopenen, gentamycin, tobramycin, amikacin, ciproffloxacin, levofloxaxin và cả các kháng sinh thế hệ mới như cephalosporin, floruoquinol Hai loại kháng sinh có thể dùng để điều trị là azlocillin và ceftazedime [60]

* S.aureus gây ngộ độc thực phẩm, gây các bệnh đường tai, mũi, họng Điều trị nhiễm trùng do S.aureus thường dùng các penicillin kháng -lactamase như nafcillin

S.aureus có các prôtêin gắn penicillin được coi là các S.aureus kháng methicillin,

thuốc được chọn trong trường hợp này là vancomycin Vancomycin là loại thuốc độc gây nhiều phản ứng phụ cho cơ thể Gần đây một số chủng trong loài này đã kháng cả vancomycin [56]

Candida albicans là tác nhân gây nhiều bệnh đặc biệt, đặc biệt là niêm mạc

miệng, lưỡi, dạ dày, hành tá tràng, đường ruột, niệu đạo, sinh dục Hiện nay 25 %

bệnh tai mũi, họng do Candida albicans trở nên không kiểm soát nổi do đã đề kháng

với các kháng sinh chống nấm hiện có như nystatin, amphotericin B, vaclotrimazole,

5-fluorocytosine Đối với các bệnh nhân AIDS thì nhiễm Candida albicans là vấn đề

nan giải nhất [16]

Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis nổi kinh hoàng của loài người từ

những thế kỷ trước tưởng đã vĩnh viễn bị chặn lại từ khi phát hiện ra steptomycin Nhưng nó đang trở lại và là nổi lo không của riêng ai, đe dọa tính mạng toàn nhân

loại đặc biệt là các bệnh nhân AIDS vì M tuberculosis đã đề kháng được nhiều loại

kháng sinh hiện có Các kháng sinh được dùng trong chữa lao hiệu quả là streptomycin, muối Para- amino của salicylic acid (PAS) và ionicotinic acid Hydrazide (INH) Tổ hợp các chất streptomycin, PAS, INH là tổ hợp chống lao hiệu quả nhất mà nhân loại có trong nhiều năm qua (từ năm 1945), nay cũng đã giảm hiệu quả

Nhờ dày công nghiên cứu, trước sự tấn công của vi trùng, các nhà bác học đã tìm ra ngày càng nhiều kháng sinh hữu hiệu hơn, tiêu diệt được nhiều loại vi trùng lờn thuốc

Tuy nhiên, một kháng sinh mới được sử dụng thì trong một thời gian ngắn thì lại có một số vi trùng coi thường Cephalosporidines thế hệ thứ 3, thứ 4, Aminoglycosides, Quinolones các thế hệ mới đều đã bị lờn từ 25 đến 50%

Kháng sinh được dùng trong thú y cũng tương tự như trong y học

Vì vậy, nhiều biện pháp đang được nghiên cứu để chống lại sự lờn thuốc của các vi sinh vật gây bệnh Một trong số các biện pháp hữu hiệu là tìm các kháng sinh mới từ các loài VSV trong thiên nhiên Từ RNM người ta đã thu được một số kháng

sinh mới, có khả năng chống các VSV gây bệnh đã lờn các loại kháng sinh hiện có (Isaka M, Suyanrnsestakorn C, Tanticharoen M, Kongsaeree P, Thebtaranonth Y, 2002) Vì vậy việc tìm kiếm các kháng sinh từ các vi sinh vật rừng ngập mặn đang được thế giới hết sức quan tâm[60] Ngày nay, các nhà khoa học đang quay lại nhóm VSV đầu tiên sinh ra chất kháng sinh- đó là nấm sợi nói riêng và nấm nói chung, hy vọng tìm được giải pháp hữu hiệu chống các VSV lờn thuốc Đối tượng hấp dẫn lại chính là nấm trong RNM và nấm biển [60], vì các nhà nghiên cứu tin rằng trong các môi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của VSV sẽ khác hơn các VSV trên cạn, nên sẽ có các chất trao đổi khác hơn trong đó có thể có các hoạt chất quý kể

và trong hạt, diệt bệnh ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất Nhìn chung so với y học, việc sử dụng KS trong bảo vệ thực vật còn mới mẻ Tuy nhiên nhờ những thành tựu của khoa học sinh học hiện đại và xu hướng phát triển tất yếu của công nghệ sản xuất kháng sinh hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng của kháng sinh trong nền nông nghiệp hiện đại Kháng sinh diệt nấm sử dụng trong nông nghiệp

có hiệu quả cao như strobilurin phân lập từ Strobilurus tenacellus (Anke, et al, 1977)

[60]

Người ta sử dụng chất kháng sinh để kiểm soát dịch bệnh do VSV gây ra cho cây trồng CKS có tác dụng nhanh , dễ phân hủy lại có tác dụng chọn lọc cao Dịch lên men của một số chủng sinh chất kháng sinh không chỉ chống bệnh cho cây mà còn dùng để xử lí hạt giống tiêu diệt mầm bệnh, có thể kích thích cây sinh trưởng và tăng số lượng vi sinh vật có ích cho vùng rễ [41]

Hằng năm trên thế giới cũng như ở nước ta bệnh cây đã làm thiệt hai rất lớn đến nền nông nghiệp, khoảng 537 triệu tấn nông sản Các bệnh do vi khuẩn như bệnh bạc lá, loét cam, bạc lá lúa, héo xanh cà chua [5] Các bệnh do nấm gây ra như bệnh thối cổ rễ ở cây bông và cỏ đinh lăng, bệnh đạo ôn ở lúa, bệnh khô vằn hại lúa…trong

đó có 13/ 45 bệnh hại lúa do nấm gây ra, có 26 / 34 bệnh ở ngô do nấm gây ra [18]

Các chế phẩm từ nấm Trichoderma (Trichoderma harzianu, Trichoderma

viride, Glyocladium ) cũng được sử dụng phòng trừ nhiều loài vi sinh vật gây bệnh

như Rhizoctonia, Fusarium, Aspergillus, Pseudomonas….gây bệnh lở cổ rễ, thối gốc

rễ, héo rũ ở nhiều loài cây trồng khác nhau.[5] Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp chất dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây [59]

Trong thực tế sản xuất nhiều nước đã áp dụng phương pháp bón vào đất các loại vi sinh vật đối kháng để tiêu diệt các loại vi sinh vật gây bệnh cho cây Những vi sinh vật đối kháng này hoàn toàn không gây hại cho cây trồng Những ứng dụng của nấm Trichoderma trong đấu tranh sinh học với các nấm gây bệnh ở cây trồng đã đạt được những thành tựu tốt đẹp ở các nước châu Âu, Liên xô…Công trình nghiên cứu

của Wells và cộng sự (1972) đã thông báo ở điều kiện ngoài đồng ruộng Tri

harzianum đã ngăn chặn được bệnh do nấm Sclerotium rolfsii Backman, Redriguer-

Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm Tri herzianum ngăn chặn bệnh do nấm

Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Pythium spp bảo vệ cây họ đậu và củ cải tránh

được bệnh chết ẻo Theo Emxep V.T (1989) cho biết nấm Trichoderma không chỉ tiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh cho cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển các vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển cây trồng Các vi sinh vật đối kháng không chỉ ức chế các vi sinh vật gây bệnh ở vùng rễ mà những chất kháng sinh do chúng tiết ra (Trichodermin, Glitoxin) có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng Vì vậy một số chủng

nấm Trichoderma theo các nhà khoa học các nước thì hoàn toàn có thể sử dụng trong đấu tranh sinh học [44] Các chủng nấm sợi như Trichoderma ssp trong các chế phẩm

phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp nguồn phân bón an toàn hiệu quả mà còn

giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được các ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên

Ở New Zealand, người ta còn trộn nhiều chủng Trichoderma khác nhau để kiểm soát bệnh trên cây nho và các cây dạng quả hạch Ở Mỹ người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi trồng trọt [35]

Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma ssp đó là khả năng

kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật [35] Các chủng nấm sợi có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh thực vật rất hiệu

quả, trong đó phải kể đến chủng Trichoderma harzianum T 22 có hoạt tính mạnh,

thích hợp với đa số loại đất và cây trồng Một số chủng bảo vệ thực vật khi cộng sinh

ở vùng rễ Các nấm Trichoderma có thể kìm hãm nấm gây bệnh cây thông qua các cơ

chế tiết kháng sinh, men đặc trưng và có thể kí sinh trên các nấm gây bệnh cho cây

Hiên tượng kí sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cho cây được gọi là hiện tượng “giao thoa sợi nấm” Trước tiên sợi nấm của Trichoderma thắt chặt lấy các sợi

nấm gây bệnh, xuyên qua sợi nấm gây bệnh, làm thủng màng ngoài của sợi nấm, gây nên sự phân hủy các chất nguyên sinh của nấm gây bệnh [33]

Nấm Aspergillus niger đối kháng với các nấm Fusarium solani, Rhizoctonia

solania, Alternaria alternata Nấm Aureobasidium pollulans và Sporobolomyces roseus đối kháng với nấm Septoria nodorum Nấm Cercospora kikuchii đối kháng

với nấm Diaporthe phaseolorum var.sojae

Các kết quả nghiến cứu của trường Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu lúa Đồng Bằng sông Cứu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện sinh học Nhiệt

đới đã cho thấy vai trò của nấm sợi đối với cây trồng Như nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Fusarium solani (gây bệnh thối rễ) Hoặc để phòng trừ bệnh thối gốc chảy mũ trên cây bưởi (do nấm Phytopthora sp.gây ra) thì dùng một kg nấm

Trichoderma harzianum trộn đều với 40 kg phân chuồng , rồi rải xung quanh cây từ

3- 5 (kg thùy theo cây lớn nhỏ)[22] Dùng các chủng nấm Trichoderma xử lí đất

trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm sợi với phân chuồng hoai mục trước khi bón ruộng 5- 10 ngày, rồi rải lên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp [35]

Hiện nay các chủng Trichoderma ssp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế

phẩm sinh học thương mại như: GlioGard- một chế phẩm với thành phần chính là

Trichoderma virens ngăn chặn sự úng thối của cây con Chế phẩm Trichodex với Trichoderma harzianum là thành phần chính kết hợp với Trichoderma polysporum

trong việc sản xuất Binabt được dùng chữa trị các vết thương đã bị nhiễm trùng ở cây

trồng

Ở Việt Nam, các bệnh do nấm, vi khuẩn, virút đã gây tổn thất lớn cho cây trồng Việc dùng thuốc hóa học đã mang lại hiệu quả tốt, làm giảm đáng kể sự thất thu sản lượng cây trồng Tuy nhiên, việc dùng thuốc hóa học cũng gây nên hậu quả năng nề cho sức khỏe của người tiêu dùng Nhiều hóa chất còn tồn lưu trong sản phẩm là nguyên nhân gây ung thư cho người sử dụng [4]

Việc sử dụng nấm sợi có khả năng sinh kháng sinh để bảo vệ cây trồng là biện pháp an toàn và hiệu quả, làm tăng năng suất cây trồng, giữ được phẩm chất nông sản [41]

Có các công trình nghiên cứu của các sinh viên khoa sinh trường Đại học Sư Phạm, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội về các nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn ở Việt Nam có các hoạt tính đối kháng với các nấm gây bệnh cho cây trống

và các côn trùng gây hại cây trồng, nghiên cứu đặc điểm của nấm sợi Trichoderma,

nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của nấm sợi, khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm sợi, khảo sát khả năng kí sinh gây bệnh côn trùng và tiềm năng kiểm soát sinh học của nấm RNM…v v…Theo công trình nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng, các chủng nấm sợi phân lập được từ rùng ngập mặn ở một số vùng Nam Định, Thái Bình còn thể hiện họat tính diệt sâu tơ mạnh trong đó

có chủng P.farinosus NT 33, thể hiện hoạt tính đối kháng cao với các loại vi sinh vật

có hại cho cây trồng [22]

1.1.3.3.Sử dụng kháng sinh và nấm sợi trong phòng chống côn trùng gây hại cây trồng [16],[19]

Các bệnh gây hại do côn trùng gây ra cho cây trồng luôn là vấn đề lớn đối với các nước nông nghiệp Hàng năm, côn trùng hại cây trồng đã làm giảm 14 % tổng sản lượng của các ngành nông, lâm nghiệp nước ta Côn trùng làm giảm năng suất, chất lượng cây trồng

Việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học để diệt các loại côn trùng gây hại tuy hiệu quả nhanh và cao nhưng lại rất độc hại cho môi trường Việc sử dụng thuốc hóa học bừa bãi, không đúng liều là một tác nhân chọn lọc làm xảy ra hiện tượng lờn thuốc ở côn trùng có hại Thuốc hóa học còn tiêu diệt các sinh vật khác, kể cả các loài

có lợi Việc lạm dụng thuốc hóa học còn ảnh hưởng tới sức khỏe con người, làm ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái

Ngày nay, các biện pháp kiểm soát sinh học các loại côn trùng gây hại có hiệu quả và an toàn cho môi trường đang được quan tâm Tuy biện pháp này có tác dụng chậm hơn song không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng tới các sinh vật khác Và có nhiều loài VSV được sử dụng trong kiểm soát sinh học như vi khuẩn, nấm sợi, virút

Năm 1815 lần đầu tiên Agostino Bassi (Italia) đã mô tả tỉ mỉ về nấm trắng Muscardin (B.bassian) gây bệnh trên tằm và đưa ra biện pháp ngăn ngừa Các loài

nấm sợi được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lãnh vực phòng trừ sinh học

như Beauveria bassiana (Blas), Paecilomyces fumosoroseus thuộc lớp nấm bất toàn,

do tính gây bệnh cao ở nhiều loài côn trùng Vào những năm 70 của thế kỷ 20, Liên

xô (cũ) là nước có số lượng công trình nghiên cứu ứng dụng nấm diệt côn trùng lớn

nhất thế giới Ở Úc thử nghiệm diệt sâu hại mía, diệt loài mối Coptotemes bằng M

.anisopliae Ở Trung Quốc người ta sử dụng nấm P.farinosus, B bassiana, M.anisopliae phòng trừ Dendrolimus tabulaeformis Các nước Bắc Âu cũng sử dụng

nấm sợi trong phòng trừ côn trùng có hại Ở Việt Nam, vào những năm 70 của thế kỷ

20 cũng có những công trình nghiên cứu về nấm diệt côn trùng và ứng dụng sản xuất chế phẩm diệt côn trùng

1.2 Giới thiệu sơ lược về rừng ngập mặn huyện Cần giờ thành phố Hồ Chí Minh

[24], [25], [42]

1.2.1 Đặc điểm chung của rừng ngập mặn

RNM là các vùng sình lầy cát ngập triều ven biển ở các khu vực thuộc kinh độ

ôn hòa trung bình và cao là rừng ngập mặn (mangrove) trong các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới

Đất ngập nước có rừng ven biển là phức hệ thảm thực vật cây gỗ, đất than bùn

bở rời và hầu như không có nền đáy, có khả năng thích nghi cả hai phương diện: ngập lụt và độ mặn

Tầm quan trọng của đầm lầy rừng ngập mặn trong vận chuyển chất hữu cơ đến chuỗi thức ăn ven biển vùng bên cạnh, đến sự ổn định vật lý đối với bờ biển như chống xói mòn, sạt lở, bảo vệ các vùng nội địa khỏi sự phá hoại của gió bão và sóng biển, có tác dụng như những bồn chứa các chất dinh dưỡng và cacbon[24] Chức năng quang trọng của hệ sinh thái rừng ngập mặn là sức sản xuất sơ cấp thuần và sức sản xuất sơ cấp thô [24]

1.2.2.Đặc điểm của RNM huyện Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh:

1.2.2.1.Điều kiện tự nhiên sinh thái của rừng ngập mặn Cần Giờ

Rừng Sác Cần Giờ là vùng rừng ngập mặn của thành phố Hồ Chí Minh

Trước đây, vốn là khu rừng nguyên sinh xuất hiện theo lịch sử của quá trình hình thành bãi bồi vùng cửa sông ven biển với các loài cây phổ biến như Đước

(Rhizophora apiculata), Đưng (Rhizophora mucronata), Dà (Ceriops spp), Vẹt (Bruguiera spp).v.v Theo các tài liệu cũ, một số vết tích gốc cây được phát hiện

trong quá trình đào kênh mương, đào móng làm nhà người dân đã phát hiện rừng ở đây đã từng phát triển khá tốt với những cây to, lớn có chiều cao 20- 25 m, đường kính từ 35- 40 cm hoặc cao hơn

Hình1.8 Cảnh quan nơi lấy mẫu nghiên cứu của RNM Cần Giờ

Hàng trăm năm qua miền đất ngập triều ven biển này đã trải qua nhiều thay đổi Các khu rừng ngập mặn trù phú xưa kia đã bị hũy diệt hoàn toàn, đặc biệt là các

đợt rải chất khai quang trong chiến tranh (1965- 1970)

Sau 23 năm tích cực gây trồng và bảo vệ (từ năm 1978 đến 2002) rừng đã dần được phục hồi với thành phần loài cây phong phú, đa dạng cũng như các quần xã thực vật tiêu biểu và đặc trưng

Năm 2000 tổ chức UNESCO đã công nhận rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển của thế giới, đầu tiên của Việt Nam [25]

1.2.2.2.Vị trí địa lý [42]

Rừng ngập mặn Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai- Sài gòn đổ

ra biển Đông ở cửa Xoài Rạp, Đồng Tranh và vịnh Gành Rái Rừng Sác nằm ở điạ bàn huyện Cần Giờ, là cửa ngõ Đông Nam của Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 30 km và nó được hình thành do bồi tụ phù sa của hệ thống các sông lớn (Soài Rạp, Lòng Tàu) trước khi ra biển Đông

Diện tích tự nhiên: 71.361 ha trong đó diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha [25]

1.2.2.3.Thổ nhưỡng, khí hậu, độ mặn [42], [25]

- Rừng ngập mặn Cần Giờ phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa

sông mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích sét, phèn hóa và nhiễm mặn Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, có chứa lượng cao lưu huỳnh ở dạng khử không có lợi cho nông nghiệp và một lượng muối (NaCl) cao

- Khí hậu rừng mang đặc tính nóng ẩm và chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với 2 mùa: mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 10), mùa khô (từ tháng 11 đến tháng 4)

- Lượng mưa trung bình từ 1.300 mm – 1.400 mm hàng năm (thấp nhất khu vực)

- Qua các số liệu đo độ mặn từ năm 1977 đến năm 2000, cho thấy độ mặn lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém

- Vào tháng 4 nước mặn xâm nhập sâu hơn vào trong đất liền, do đó độ mặn của nước trong rừng được nâng cao lên Còn vào tháng 9, 10 nước ngọt từ sông đẩy lùi nước mặn ra biển làm hạ bớt độ mặn

- Từ khi thủy điện Tri An hoạt động, thì độ mặn đã giảm từ 9 0/00 xuống 4 0/00

và tại Tam Thôn Hiệp độ mặn chỉ đạt 18 0/00 Độ mặn 24 - 30 0/00 mùa khô

- Ngược lại vào mùa mưa, độ mặn lại tăng hơn so với trước do lượng nước xả của hồ Trị An giảm đi [25]

1.2.2.4 Các giá trị chủ yếu của rừng ngập mặn Cần Giờ [25],[19]

Vùng ven biển Cần Giờ có các sinh cảnh tự nhiên và sinh cảnh nhân tạo Sinh cảnh có giá trị đa dạng sinh học cao nhất là các bãi bồi và RNM tự nhiên ít bị tác

động Thực vật ưu thế trong RNM thuộc về loài Trang (Kandelia candel), Bần, Sú, Đước Đôi (Rhizophorz apiculata), Mắn Trắng (Avicennia alba)…và khoảng 30 loài

cây ngập mặn khác là môi trường sống của nhiều loài nấm sợi

Nhờ có chủ trương bảo tồn, trồng lại RNM làm cho các loài cây được phục hồi sau chiến tranh tạo điều kiện cho các loài vi sinh vật trong đất, tảo phù du sinh sôi phát triển, tham gia vào chu trình tuần hoàn vật chất của hệ sinh thái rừng ngập mặn,

bổ sung tính đa dạng sinh học của vùng đất ẩm, ngập triều ven biển này Các loại tảo

là nguồn thức ăn cho các loài thủy sản ở cửa sông, vùng triều Các loài vi khuẩn, sinh vật đáy, nấm sợi, nấm men…giử vai trò quan trọng trong việc phân hủy các chất hữu

cơ rơi rụng, xác bả các loài động vật rừng chết, khoáng hóa cung cấp chất dinh dưỡng cho các loài tảo phù du, ấu trùng tôm cua, cá …trong rừng và cả ven biển Một điều

rất quan trọng là ngay ở cả Cần Giờ có các chủng nấm sợi như Penicilium, Asperillus,

Cladosporium, Canninghamela có khả năng phân giải đến 50- 70 % lượng dầu DO

(Phan Nguyên Hồng và cộng sự 2004), tạo enzym ngoại bào có khả năng phân giải cellulose hoặc có khả năng sinh các loại kháng sinh Đây là nguồn gen quí giá chưa được khai thác đặc biệt là nấm sợi sinh kháng sinh

Với độ che phủ cao chính là lá phổi xanh của thành phố Đây là vùng xử lý khí độc, điều tiết nhiệt độ, độ ẩm, ngăn gió bảo Ngoài ra RNM Cần Giờ là khu vực quan trọng đối với ngư nghiệp, khai thác hải sản ở các bãi bồi ngập triều, nơi kiếm ăn và sinh sản của nhiều loài cá , tôm cua, đồng thời chúng đóng vai trò quan trọng đối với việc duy trì năng suất các sản phẩm của biển vùng ven bờ RNM Cần Giờ còn có tiềm năng lớn về du lịch sinh thái

Chính các yếu tố tự nhiên đã tạo ra nét riêng biệt môi trường sinh thái của Cần Giờ và quyết định đến sự phân bố tài nguyên tại đây

Tóm lại:

Hệ sinh thái RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ nguồn gen quý hiếm do đặc trưng của vùng đất không ổn định, độ ẩm cao, sự dao động của thủy triều ra vào thường xuyên, làm VSV ở đây có nguồn gen dễ biến đổi để thích nghi với môi trường Đây là

hệ sinh thái có năng suất sinh học cao nhất trong hệ sinh thái, nơi hôi tụ của sự đa dạng về sinh vật đất liền lẫn sinh vật biển Nấm sợi được phân bố khắp nơi ở RNM Chúng ta có thể thấy rõ vai trò to lớn của các nhóm nấm sợi trong rừng ngập mặn cũng giống như trong bất kỳ hệ sinh thái nào khác, nó không những tham gia vào vòng tuần hoàn vật chất, khép kín chu trình sinh địa hóa mà còn là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu giữ cân bằng sinh thái Nấm sợi có khả năng sinh kháng sinh là nguồn gen quí hiếm đặc thù cho hệ sinh thái rừng ngập mặn có ý nghĩa sinh thái và công nghệ sinh học Đây là nguồn tài nguyên quí giá của đất nước Vì vậy việc đầu tư tìm hiểu khai thác, lưu giữ và bảo tồn chúng là việc làm hết sức cần thiết và cấp bách

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu

Vị trí lấy mẫu nghiên cứu trên bảng đồ huyện Cần Giờ TP HCM

Ghi chú: : Vị trí lấy mẫu

Hình 2.1 Vị trí lấy mẫu trên bảng đồ huyện Cần Giờ TPHCM [53]

- Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM ở các xã An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp, Long Hòa, Bình Khánh, khu Lâm Viên Cần Giờ thuộc huyện Cần giờ, thành phố Hồ Chí Minh

- Thời gian lấy mẫu vào tháng 7,8,9 (1 lần / tháng - mùa mưa)

- Các vi sinh vật kiểm định gồm:

+ Bacillus subtilis ATCC 6633 nhận từ PTN vi sinh Đại học Khoa học Tự

Nhiên TPHCM

+ Escherichia coli ATCC 15224 nhận từ phòng xét nghiệm vi sinh Bệnh viện

Bình Dân

+ Candida albicans, Staphylococcus aureus 290 P, Pseudomonas aeroginosa

nhận từ phòng vi sinh của Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh

+ VK được phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân tại bệnh viện Bình Dân,

gồm E.coli, Pseu.aeroginosa, Enterobacter (1), (2) các chủng này được phân lập từ 2

bệnh nhân khác nhau và kháng với các loại kháng sinh khác nhau( xem phụ lục)

- Các nấm gây bệnh cây trồng:

Nhận từ Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, TPHCM:

+ Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ và chết vàng ở cây (phân lập từ cây

chè)

+ Rhizoctonia sp gây bệnh khô vằn (phân lập từ cây bồ ngót)

+ Sclerotium sp gây bệnh thối thân (phân lập từ cây thuốc lá)

Nhận từ phòng Bệnh cây trồng của khoa Nông học- Đại học Nông Lâm TPHCM:

+ Curvularia sp gây bệnh đen hạt ở lúa (phân lập từ cây lúa)

+ Phythophthora gây bệnh thối thân (phân lập từ cây dứa)

+ Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn (phân lập từ cây lúa)

- Các loại đường chuẩn: glucoza, fructoza, saccaroza, galactoza, (Trung Quốc),

rĩ đường (Việt Nam)

- Các loại hóa chất khác: KH2 PO4, K2 HPO4, MgSO4.7 H2O, MgSO4, FeSO4.7

H2O, NaCl, KNO3,(NH4 )2SO4, NH4NO3, NaNO3, NaNO2, FeSO4, HCl, Na(OH),HgCl2, KCl, Na2HPO4 (Trung Quốc) Dầu DO (Việt Nam)

- Tinh bột tan, peptôn, CMC, TCA (Trung Quốc), cao nấm men (Mỹ), cao thịt (Đức), thạch (công ty đồ hộp Hạ Long), bột đậu nành (Việt Nam)

- Kính hiển vi quang học, máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật)

- Máy đo pH Pometer KL-009(II) (Trung Quốc)

- Máy li tâm (Rotina, Đức)

- Kính lúp soi nổi

- Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

- Tủ lạnh (National- Nhật)

- Tủ giử mẫu (Sanyo- Nhật)

- Máy giập mẫu

- Máy lắc (Gerhardt- Đức)

- Cân điện (Sartorius -Đức)

- Thiết bị đo độ mặn của nước biển

2.1.4.Các môi trường đã sử dụng khi nghiên cứu

2.1.4.1 Môi trường phân lập, nuôi cấy và giữ giống nấm sợi

- MT 1: Môi trường Czapek- Dox (nuôi cấy, giữ giống nấm sợi kiểm định)

- MT 2: Môi trường Glucose Yeast Extract Agar (môi trường nuôi cấy và giữ

giống nấm sợi RNM- môi trường YEA) [46]

2.1.4.2.Môi trường phân loại nấm sợi:

- MT 4:Môi trường Potato Glucose Aga r(môi trường PGA- môi trường nuôi

cấy nấm sợi gây bệnh ở cây trồng) [8]

Nếu thử hoạt tính kháng sinh thì thay nước biển bằng nước cất

2.1.4.3 Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm men kiểm định [8]

-MT 6: Môi trường Hanxen

2.1.4.4.Môi trường MPA nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định [16]

- MT 7: Môi trường MPA

2.1.4.5 Môi trường thử họat tính enzym ngoại bào [8], [46]

a Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp cấy chấm điểm:

Dùng [MT1] để thử hoạt tính enzym ngoại bào như: xenlulaza, prôteaza, amilaza dùng các cơ chất tương ứng là CMC, casein, tinh bột thay đường glucose với hàm lượng tương đương

b Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp đục lỗ:

Dùng [MT 2, MT 3] để thử hoạt tính enzym ngoại bào, thành phần môi trường tương tự nhưng không có agar

MT8:Môi trường khoáng (phát hiện khả năng phân giải dầu) [19]

Lưu ý: Các môi trường trên trước khi đem sử dụng đều được thanh trùng ở 1atm

trong 30 phút

2.2.Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương phápVSV

2.2.1.1.Phương pháp lấy mẫu [19]

Các mẫu được thu ngẫu nhiên khi thủy triều vừa rút tại các rừng già cách biển

2 km.Các điểm lấy mẫu cách nhau 200 m Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5-10

cm, thân cây tươi, thân cây mục, lá tươi trên cành, lá mục trên mặt đất Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn từ 12 - 18 0 / 00, nhiệt độ trung bình khoảng 25- 280C,

độ ẩm 79- 87 %, pH dao động trong khoảng 4- 4,5

Mẫu bao gồm:lá vàng vừa rụng , lá rụng bị mục, thân cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân giải trên mặt bùn, đất bề mặt

Cách lấy: Dùng dao kéo vô trùng, cắt khoảng 50g mẫu cho vào túi nilon vô trùng bọc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu , ngày tháng , bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và giữ ở tủ giống 40 C Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 48h

2.2.1.2.Phương pháp phân lập [9], [46]

Lấy mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo F.Uyenco (1988)

a.Lấy mẫu và pha loãng mẫu

Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230vòng/ phút Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ phần dịch hơi đục chảy ra bên ngòai

Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1

Lắc đều, rồi hút 1ml dd 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng

ta đựợc dung dịch pha loãng nồng độ 10-2

Tiếp tục pha lõang liên tiếp như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5,

10-6

b- Cấy mẫu

Nhỏ 0,1ml dung dịch ở mỗi nồng độ lên dĩa chứa môi trường

Dùng que trang trải lên khắp mặt thạch Sau đó sử dụng que trang đó trải tiếp 2 đĩa tiếp theo

c- Ủ mẫu

Úp đĩa pêtri xuống, dùng báo gói lại, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày

Chọn khuẩn lạc riêng lẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng

d- Làm thuần

Lấy 1 mẫu khuẩn lạc trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước biển vô trùng, trải lên đĩa lần 2, nếu thuần nhất 1 khuẩn lạc đồng đều, màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có 1 dạng tế bào thì đã thuần, ta cấy sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản ngắn hạn và nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa

2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi

2.2.2.1.Quan sát đại thể nấm sợi

-Phương phápnuôi cấy tạo khuẩn lạc khổng lồ:

- Cho vào ống thạch nghiêng (đã cấy chủng nấm sợi thuần khiết) 5ml nước biển vô trùng, tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa pêtri Quan sát sự hình thành và phát triển của khuẩn lạc hằng ngày theo các đặc điểm sau

+ Đo kích thước khuẩn lạc

+ Quan sát hình dạng khuẩn lạc, màu sắc mặt phải, mặt trái của KL, màu sắc của môi trường, dạng mép KL, chất tiết trên bề mặt KL, mùi…

2.2.2.2.Quan sát vi thể nấm sợi [9], [10]

Phuơng pháp làm phòng ẩm nuôi cấy nấm để quan sát của J.T.Dunean

- Chuẩn bị môi trường thích hợp ( PDA, MEA, YEA) đổ 1 lớp thật mỏng khoảng 1mm trên bề mặt các đĩa petri Khi thạch đã đông hoàn toàn thì dùng dao vô trùng cắt thành từng mẩu hình vuông, diện tích 1cm2

- Chuẩn bị các đĩa pêtri sạch, phiến kính , lá kính, bông thấm nước (hoặc giấy thấm) nước cất, tất cả đều được vô trùng (sấy ở nhiệt độ 1600C, trong 1 giờ)

- Đặt 1 khối thạch lên phiến kính Cấy 1 ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối thạch Đậy lá kính lại và cho vào hộp pêtri có sẳn giấy thấm (bông) vô trùng được làm ẩm bằng nước cất vô trùng Giữ các hộp pêtri này trong tủ ấm 3-4 ngày

- Sau 3- 4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên 1 phiến kính sạch có bề mặt thuốc nhuộm Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta đựơc tiêu bản thứ 2 Quan sát dưới vật kính 40, 100 các đặc điểm:

+ Giá bào tử, các thể bọng, thể bình

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn

+ Màu sắc, kính thước bào tử, có gai hay không có gai

Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đaị 400- 1000 lần

2.2.3.Các phương pháp hóa sinh

2.2.3.1 Kiểm tra họat tính enzym ngoại bào của nấm sợi [9]

Bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch

a Nguyên tắc

Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm sợi phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh khuẩn lạc

b Thực hiện

 Phương pháp cấy chấm điểm

- Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các môi trường thích hợp (MT 1 với cơ chất tương ứng)

- Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp pêtri) lên môi trường thử họat tính tương ứng

- Giữ các hộp pêtri này trong tủ ấm 280 C300 C, trong 3 4 ngày

 Phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch:

- Thu dịch nuôi cấy: dùng que cấy vô trùng, lấy một vòng nấm sợi nghiên cứu vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường lỏng ( MT 2, MT 3 không có thạch) vô trùng Nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút) trong 4 ngày ở nhiệt độ 250C280C Ly tâm 20 ml dịch nuôi cấy ở 3000 vòng/ phút, trong 20 phút Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng, bổ sung 0, 04% NaN3 để khử trùng Dịch ly tâm có thể giữ trong 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -200C

- Dùng khoan nút chai vô trùng (d= 8 mm) khoan các lỗ thạch trên môi trường nghiên cứu tương ứng trong các hộp pêtri (MT 1) với cơ chất tương ứng

- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml dịch enzym vào các lỗ khoan trên các môi trường thử hoạt tính tương ứng.Giữ các hộp pêtri vào tủ lạnh ở 4 0C trong vòng 2 – 4 giờ Sau đó chuyển sang giữ trong tủ ấm ở 280C300C, trong vòng 24 giờ

c Kiểm tra kết quả:

Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng:

+ Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10 % HgCl2 lên bề mặt môi trường nuôi cấy, nếu nấm sợi sinh ra prôteaza sẽ có 1 vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ) do các phân tử prôtêin bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2 Các phân tử prôtêin chưa bị phân giải có màu trắng đục

+ Kiểm tra hoạt tính amilaza: nhỏ dung dịch thuốc thử KI + I 2 (dung dịch lugol loãng) lên bề mặt môi trường nuôi cấy nấm sợi Nếu nấm sợi có enzym amilaza

sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ)

+ Kiểm tra hoạt tính xenlulaza bằng thuốc thử dung dịch lugol loãng hoặc cônggo đỏ 1 % Đổ thuốc thử lên bề mặt môi trường nuôi cấy nấm sợi Nếu nấm sợi

có hoạt tính xenlulaza sẽ tạo 1 vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ) Vùng xenluloza chưa bị phân giải sẽ có màu đỏ đậm với thuốc thử cônggo 1% và màu tím hồng nhạt với thuốc thử là dung dịch lugol loãng

d Đánh giá khả năng tạo enzym

- Hoạt tính enzym = (D- d), mm

với D = đường kính vòng phân giải, d = đường kính khuẩn lạc (lỗ thạch)

- (D-d)  25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20 mm: hoạt tính mạnh

(D-d)  10  19,5: hoạt tính trung bình; (D-d)  10 mm: hoạt tính yếu

2.2.3.2 Kiểm tra khả năng sinh chất kháng sinh của nấm sợi [9]

a.Nguyên tắc

Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành CKS thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch

b.Tiến hành thí nghiệm: