2.1. Vật liệu
2.1.1.Đối tượng nghiên cứu
Vị trí lấy mẫu nghiên cứu trên bảng đồ huyện Cần Giờ TP HCM
Ghi chú: : Vị trí lấy mẫu
Hình 2.1. Vị trí lấy mẫu trên bảng đồ huyện Cần Giờ TPHCM [53].
- Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM ở các xã An Thới Đơng, Tam Thơn Hiệp, Long Hịa, Bình Khánh, khu Lâm Viên Cần Giờ thuộc huyện Cần giờ, thành phố Hồ Chí Minh.
- Thời gian lấy mẫu vào tháng 7,8,9 (1 lần / tháng - mùa mưa). - Các vi sinh vật kiểm định gồm:
+ Bacillus subtilis ATCC 6633 nhận từ PTN vi sinh Đại học Khoa học Tự
+ Escherichia coli ATCC 15224 nhận từ phịng xét nghiệm vi sinh Bệnh viện Bình Dân.
+ Candida albicans, Staphylococcus aureus 290 P, Pseudomonas aeroginosa nhận từ phịng vi sinh của Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh.
+ VK được phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân tại bệnh viện Bình Dân, gồm E.coli, Pseu.aeroginosa, Enterobacter (1), (2) các chủng này được phân lập từ 2 bệnh nhân khác nhau và kháng với các loại kháng sinh khác nhau( xem phụ lục).
- Các nấm gây bệnh cây trồng:
Nhận từ Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp Miền Nam, TPHCM:
+ Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ và chết vàng ở cây (phân lập từ cây chè).
+ Rhizoctonia sp gây bệnh khơ vằn (phân lập từ cây bồ ngĩt). + Sclerotium sp gây bệnh thối thân (phân lập từ cây thuốc lá).
Nhận từ phịng Bệnh cây trồng của khoa Nơng học- Đại học Nơng Lâm TPHCM:
+ Curvularia sp gây bệnh đen hạt ở lúa (phân lập từ cây lúa). + Phythophthora gây bệnh thối thân (phân lập từ cây dứa). + Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ơn (phân lập từ cây lúa). - Các dạng cơn trùng dùng thử nghiệm:
+ Ấu trùng dâu tằm tuổi ba nhận từ cơng ty Dâu tằm tơ – huyện Bảo Lộc, Tỉnh Lâm Đồng.
+ Sâu tơ (rau cải ) tuổi ba nhận từ Viện nghiên cứu của Cơng ty cổ phần Thuốc sát trùng Việt Nam- VIPESCO, Quận Gị vấp, TPHCM.
2.1.2. Hĩa chất
- Các loại đường chuẩn: glucoza, fructoza, saccaroza, galactoza, (Trung Quốc), rĩđường (Việt Nam).
- Các loại hĩa chất khác: KH2 PO4, K2 HPO4, MgSO4.7 H2O, MgSO4, FeSO4.7 H2O, NaCl, KNO3,(NH4 )2SO4, NH4NO3, NaNO3, NaNO2, FeSO4, HCl, Na(OH),HgCl2, KCl, Na2HPO4 (Trung Quốc). Dầu DO (Việt Nam).
- Tinh bột tan, peptơn, CMC, TCA (Trung Quốc), cao nấm men (Mỹ), cao thịt (Đức), thạch (cơng ty đồ hộp Hạ Long), bột đậu nành (Việt Nam).
- Thuốc thử: lugol, HgCl2. - Thuốc nhuộm: lactophenol.
- Chất kháng sinh: Chloramphenycol (Ấn Độ). 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
- Nồi hấp cao áp Autoclave (Đài Loan). - Tủ sấy Memmert (Đức).
- Kính hiển vi quang học, máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật). - Máy đo pH Pometer KL-009(II) (Trung Quốc)
- Máy li tâm (Rotina, Đức). - Kính lúp soi nổi.
- Tủ cấy vơ trùng (Việt Nam). - Tủ lạnh (National- Nhật). - Tủ giử mẫu (Sanyo- Nhật). - Máy giập mẫu. - Máy lắc (Gerhardt- Đức). - Cân điện (Sartorius -Đức). - Thiết bịđo độ mặn của nước biển.
2.1.4.Các mơi trường đã sử dụng khi nghiên cứu
2.1.4.1. Mơi trường phân lập, nuơi cấy và giữ giống nấm sợi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- MT 1: Mơi trường Czapek- Dox (nuơi cấy, giữ giống nấm sợi kiểm định) [8]. Glucơza 20,0g; NaNO3 3,5g; KH2 PO4 1,5g; MgSO4.7 H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7 H2O 0,1g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0; ( thêm 0,5g chloramphenicol khi phân lập)
- MT 2: Mơi trường Glucose Yeast Extract Agar (mơi trường nuơi cấy và giữ
giống nấm sợi RNM- mơi trường YEA) [46]. Glucơza 20,0g
Cao nấm men 4,0g Thạch 20,0g
Nước biển 1000ml, pH 5,5 – 6,0.
- MT 3: Mơi trường D (mơi trường nuơi cấy nấm sợi RNM) [46]. Glucơza 10,0g; Peptơn 2,0g; KH2 PO4 5,0g; MgSO4.7 H2O 0,5g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0 2.1.4.2.Mơi trường phân loại nấm sợi:
- MT 4:Mơi trường Potato Glucose Aga r(mơi trường PGA- mơi trường nuơi cấy nấm sợi gây bệnh ở cây trồng) [8]. Khoai tây 250,0g Glucơza 20,0g Thạch 15,0g (nếu làm mơi trường đặc) Nước cất 1000ml. - Cách chế dịch khoai tây:
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 250g, thái nhỏ, thêm 500ml nước, đun sơi, nhỏ
lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong.
- MT 5:Mơi trường Malt Extract Agar (mơi trường MEA- mơi trường phân loại nấm sợi) Glucơza 20,0g; Peptơn 1,0g; Malt Extract 20,0g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH = 5,5 - 6