Mơi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp đục lỗ:

- Mơi trường YEA (mơi trường 2.1.4.1)

b. Mơi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp đục lỗ:

Dùng [MT 2, MT 3] để thử hoạt tính enzym ngoại bào, thành phần mơi trường tương tự nhưng khơng cĩ agar.

MT8:Mơi trường khống (phát hiện khả năng phân giải dầu) [19]. KH2 PO4 0,3g; MgSO4 0,4g; KNO3 3,0g; Na2 HPO4 0,7g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0; dầu DO hoặc dầu thơ 5 %

Lưu ý: Các mơi trường trên trước khi đem sử dụng đều được thanh trùng ở 1atm trong 30 phút.

2.2.Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương phápVSV

2.2.1.1.Phương pháp lấy mẫu [19].

Các mẫu được thu ngẫu nhiên khi thủy triều vừa rút tại các rừng già cách biển 2 km.Các điểm lấy mẫu cách nhau 200 m. Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5-10 cm, thân cây tươi, thân cây mục, lá tươi trên cành, lá mục trên mặt đất. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ cĩ độ mặn từ 12 - 18 0 / 00, nhiệt độ trung bình khoảng 25- 280C,

độẩm 79- 87 %, pH dao động trong khoảng 4- 4,5.

Mẫu bao gồm:lá vàng vừa rụng , lá rụng bị mục, thân cành chết khơ cịn trên cây, thân cành chết đang bị phân giải trên mặt bùn, đất bề mặt.

Cách lấy: Dùng dao kéo vơ trùng, cắt khoảng 50g mẫu cho vào túi nilon vơ trùng bọc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu , ngày tháng , bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về phịng thí nghiệm và giữ ở tủ giống 40 C .Các mẫu được phân lập ngay khơng giữ quá 48h.

2.2.1.2.Phương pháp phân lập [9], [46].

Lấy mẫu trực tiếp và pha lỗng mẫu theo F.Uyenco (1988)

a.Lấy mẫu và pha lỗng mẫu.

Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ . Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vịng 2 phút, tốc độ 230vịng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ phần dịch hơi đục chảy ra bên ngịai.

Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha lỗng 10-1.

Lắc đều, rồi hút 1ml dd 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vơ trùng ta đựợc dung dịch pha lỗng nồng độ 10-2.

Tiếp tục pha lõang liên tiếp như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.

b- Cấy mẫu

Nhỏ 0,1ml dung dịch ở mỗi nồng độ lên dĩa chứa mơi trường.

Dùng que trang trải lên khắp mặt thạch. Sau đĩ sử dụng que trang đĩ trải tiếp 2

c- Ủ mẫu

Úp đĩa pêtri xuống, dùng báo gĩi lại, ủ ở nhiệt độ phịng từ 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc riêng lẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng.

d- Làm thuần

Lấy 1 mẫu khuẩn lạc trong ống thạch nghiêng, hịa vào nước biển vơ trùng, trải lên đĩa lần 2, nếu thuần nhất 1 khuẩn lạc đồng đều, màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều cĩ 1 dạng tế bào thì đã thuần, ta cấy sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản ngắn hạn và nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hĩa .

2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi. 2.2.2.1.Quan sát đại thể nấm sợi.

-Phương phápnuơi cấy tạo khuẩn lạc khổng lồ:

- Cho vào ống thạch nghiêng (đã cấy chủng nấm sợi thuần khiết) 5ml nước biển vơ trùng, tạo dung dịch huyền phù.

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chĩng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa pêtri. Quan sát sự hình thành và phát triển của khuẩn lạc hằng ngày theo các đặc điểm sau.

+ Đo kích thước khuẩn lạc.

+ Quan sát hình dạng khuẩn lạc, màu sắc mặt phải, mặt trái của KL, màu sắc của mơi trường, dạng mép KL, chất tiết trên bề mặt KL, mùi…

2.2.2.2.Quan sát vi thể nấm sợi [9], [10].

Phuơng pháp làm phịng ẩm nuơi cấy nấm để quan sát của J.T.Dunean.

- Chuẩn bị mơi trường thích hợp ( PDA, MEA, YEA) đổ 1 lớp thật mỏng khoảng 1mm trên bề mặt các đĩa petri. Khi thạch đã đơng hồn tồn thì dùng dao vơ trùng cắt thành từng mẩu hình vuơng, diện tích 1cm2 .

- Chuẩn bị các đĩa pêtri sạch, phiến kính , lá kính, bơng thấm nước (hoặc giấy thấm) nước cất, tất cả đều được vơ trùng (sấy ở nhiệt độ 1600C, trong 1 giờ). - Đặt 1 khối thạch lên phiến kính. Cấy 1 ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối

thạch. Đậy lá kính lại và cho vào hộp pêtri cĩ sẳn giấy thấm (bơng) vơ trùng

được làm ẩm bằng nước cất vơ trùng. Giữ các hộp pêtri này trong tủ ấm 3-4 ngày.

- Sau 3- 4 ngày nuơi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên 1 phiến kính sạch cĩ bề mặt thuốc nhuộm. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta đựơc tiêu bản thứ 2. Quan sát dưới vật kính 40, 100 các đặc điểm:

+ Giá bào tử, các thể bọng, thể bình.

+ Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn. + Màu sắc, kính thước bào tử, cĩ gai hay khơng cĩ gai.

Chụp hình trên kính hiển vi quang học ởđộ phĩng đaị 400- 1000 lần. 2.2.3.Các phương pháp hĩa sinh.

2.2.3.1. Kiểm tra họat tính enzym ngoại bào của nấm sợi [9]. Bằng phương pháp khuếch tán trên mơi trường thạch.

a. Nguyên tắc.

Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, cịn phần cơ chất bị nấm sợi phân hủy sẽ khơng tạo màu mà tạo vịng trong suốt quanh khuẩn lạc.

b. Thực hiện.

 Phương pháp cấy chấm điểm

- Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các mơi trường thích hợp (MT 1 với cơ chất tương ứng).

- Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp pêtri) lên mơi trường thử họat tính tương ứng.

- Giữ các hộp pêtri này trong tủấm 280 C300 C, trong 3 4 ngày.

 Phương pháp đục lỗ trên mơi trường thạch:

- Thu dịch nuơi cấy: dùng que cấy vơ trùng, lấy một vịng nấm sợi nghiên cứu vào bình tam giác chứa 50 ml mơi trường lỏng ( MT 2, MT 3 khơng cĩ thạch) vơ trùng. Nuơi cấy trên máy lắc (160 vịng/phút) trong 4 ngày ở nhiệt độ 250C280C. Ly tâm 20 ml dịch nuơi cấy ở 3000 vịng/ phút, trong 20 phút. Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vơ trùng, bổ sung 0, 04% NaN3 để khử trùng. Dịch ly tâm cĩ thể giữ trong 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -200C.

- Dùng khoan nút chai vơ trùng (d= 8 mm) khoan các lỗ thạch trên mơi trường nghiên cứu tương ứng trong các hộp pêtri (MT 1) với cơ chất tương ứng.

- Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1 ml dịch enzym vào các lỗ khoan trên các mơi trường thử hoạt tính tương ứng.Giữ các hộp pêtri vào tủ lạnh ở 4 0C trong vịng 2 – 4 giờ. Sau đĩ chuyển sang giữ trong tủ ấm ở 280C300C, trong vịng 24 giờ.

c. Kiểm tra kết quả:

Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng:

+ Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10 % HgCl2 lên bề mặt mơi trường nuơi cấy, nếu nấm sợi sinh ra prơteaza sẽ cĩ 1 vịng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan cĩ chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ) do các phân tử prơtêin bị phân giải khơng cịn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tử prơtêin chưa bị phân giải cĩ màu trắng đục.

+ Kiểm tra hoạt tính amilaza: nhỏ dung dịch thuốc thử KI + I 2 (dung dịch lugol lỗng) lên bề mặt mơi trường nuơi cấy nấm sợi. Nếu nấm sợi cĩ enzym amilaza sẽ tạo vịng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ

khoan cĩ chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ).

+ Kiểm tra hoạt tính xenlulaza bằng thuốc thử dung dịch lugol lỗng hoặc cơnggo đỏ 1 %. Đổ thuốc thử lên bề mặt mơi trường nuơi cấy nấm sợi. Nếu nấm sợi cĩ hoạt tính xenlulaza sẽ tạo 1 vịng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm

điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan cĩ chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ). Vùng xenluloza chưa bị phân giải sẽ cĩ màu đỏ đậm với thuốc thử cơnggo 1% và màu tím hồng nhạt với thuốc thử là dung dịch lugol lỗng.

d. Đánh giá khả năng tạo enzym . - Hoạt tính enzym = (D- d), mm

với D = đường kính vịng phân giải, d = .đường kính khuẩn lạc (lỗ thạch). - (D-d)  25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20 mm: hoạt tính mạnh (D-d)  10  19,5: hoạt tính trung bình; (D-d)  10 mm: hoạt tính yếu 2.2.3.2. Kiểm tra khả năng sinh chất kháng sinh của nấm sợi [9].

a.Nguyên tắc

Nếu VSV trên khối thạch cĩ khả năng hình thành CKS thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vịng vơ khuẩn xung quanh khối thạch.

 Phương pháp khối thạch

Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các mơi trường thích hợp ( MT 2) khơng dùng nước biển mà thay bằng nước cất.

Dùng khoan nút chai vơ trùng khoan các khối thạch cĩ vi sinh vật cần thử

họat tính kháng sinh.

Đặt các khối thạch vào đĩa pêtri cĩ mơi trường ( MT7) đã cấy các vi sinh vật kiểm định

 Phương pháp khuếch tán trên mơi trường thạch

- Cách thu dịch kháng sinh tương tự thu dịch enzym. Sau đĩ điểu chỉnh pH của dịch kháng sinh về pH trung tính (6  7). Các vi sinh vật kiểm định được cấy truyền từ ống giống sang mơi trường nước cất vơ trùng.

- Dùng pipet vơ trùng lấy 0,1 ml mơi trường lỏng cĩ chứa vi sinh vật kiểm

định nhỏ vào hộp pêtri cĩ chứa mơi trường dinh dưỡng tương ứng (MT 7). Dùng que trang vơ trùng dàn đều giọt dịch vi sinh vật kiểm định trên bề mặt mơi trường thạch.

- Dùng khoan nút chai vơ trùng dùng d=8mm, khoan các lỗ trên mơi trường cĩ chứa vi sinh vật kiểm định .

- Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1 ml dịch chiết kháng sinh nghiên cứu vào các lỗ

khoan.

c. Kiểm tra kết quả:

- Hoạt tính kháng sinh = (D- d), mm

-Với D = đường kính vịng phân giải, d = đường kính khuẩn lạc (lỗ thạch) (D-d)  25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20 mm: hoạt tính mạnh

(D-d)  10  19,5: hoạt tính trung bình; (D-d)  10 mm: hoạt tính yếu 2.2.3.3.Thử khả năng đồng hĩa nguồn cacbon, nitơ[19].

a. Nguyên tắc

Mức độ phát triển của nấm sợi thể hiện khả năng đồng hĩa các nguồn cacbon, nitơ khác nhau .

Để xác định ảnh hưởng của nguồn Cacbon tới sự sinh trưởng của nấm sợi nghiên cứu chúng tơi sử dụng MT 1 trong nước biển, glucose lần lượt được thay bằng các nguồn hydrat cacbon: lactose, sucrose, maltose, galactose, rỉ đường.Trọng lượng các chất thay thế được lấy đúng bằng hàm lượng cacbon trong MT 1.

Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ (dùng MT 1). Nguồn NaNO3 lần lượt

được thay thế bằng các nguồn Nitơ khác: bột đậu, cao thịt, NH4NO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4 )2SO4. Mẫu đối chứng được nuơi ở mơi trường MT 1.

Cấy chấm điểm các nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt mơi trường tương ứng, sau

đĩ để trong tủ ấm trong 3 ngày. c. Kết quả:

Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon, nitơ bằng mức độ phát triển của các khuẩn lạc bằng cách đo đường kính của các khuẩn lạc.

2.2.3.4. Kiểm tra khả năng chịu mặn [19]. a.Nguyên tắc

Mỗi lồi nấm sợi thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng

độ muối nĩ thể hiện hoạt tính kháng sinh khác nhau. b. Tiến hành thí nghiệm

- Chuẩn bị mơi trường YEA (MT 2) , cĩ bổ sung các nồng độ muối NaCl từ

0%; 3%; 5%; 7%; 10%; 20 %.

- Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các mơi trường nghiên cứu cĩ nồng độ muối khác nhau.

- Nuơi trong tủấm 4 ngày.

Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2 với từng nồng độ muối mơi trường ban đầu.

c. Kết quả.

- Dựa vào thời gian hình thành khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giả khả năng chịu mặn. Mẫu đối chứng nuơi trên mơi trường khơng NaCl.

- Kiểm tra vịng vơ khuẩn (khi thử hoạt tính KS)

2.2.3.5.Thử khả năng phân giải dầu [19]. a. Nguyên tắc

Dựa vào khả năng sinh trưởng của nấm sợi để xác định khả năng phân giải dầu. b. Tiến hành TN

Cấy nấm sợi trong bình tam giác 100ml cĩ chứa 50ml mơi trường khống (MT 8). Nuơi cấy tĩnh ở nhiệt độ phịng trong 15 ngày.

c. Đánh giá khả năng phân giải dầu bằng cách:

Đo sinh khối khơ của nấm sợi

Quan sát xem nấm sợi cĩ khả năng phát triển tốt trên MT cĩ dầu hay khơng Quan sát mức độ mất các giọt dầu và ngửi thấy giảm mùi dầu.

2.2.3.6.Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi

Sử dụng mơi trường (MT 1) thanh trùng rồi cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu. Sau đĩ ủ trong tủ ấm. Mỗi ngày đo đường kính khuẩn lạc vào cùng thời

điểm (sau 24 giờ cấy) để biết tốc độ sinh trưởng của nĩ.

Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2 từ ngày thứ 3 đến ngày thứ

7.

2.2.3.7.Xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và hoạt tính kháng của các chủng nấm sợi nghiên cứu.

Chúng tơi sử dụng mơi trường nuơi cấy (MT 2) nước cất, điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1 M hoặc HCl 1 M để cĩ giá trị pH khác nhau từ 3,0 đến 9,0. Thanh trùng mơi trường rồi cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu, sau đĩ để ở nhiệt độ

phịng trong 3- 4 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào độ lớn của khuẩn lạc.

Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2

2.2.4. Thử họat tính đối kháng với các chủng nấm sợi gây bệnh cho cây trồng

[15]:

Nuơi các chủng nấm nghiên cứu trong mơi trường dịch thể (MT 2), sau 4 ngày lấy dịch nuơi cấy đem ly tâm 3000 vịng/ phút, trong 20 phút. Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vơ trùng ta được dịch chiết kháng sinh thơ.

Đổ mơi trường (MT 4) vào đĩa pêtri, để nguội, sau đĩ đục lổ. Cấy nấm gây bệnh thành 2 chấm đối xứng qua lổ thạch và cách lổ thạch 2 cm. Nhỏ dịch chiết

kháng sinh thơ vào lổ thạch. Để đĩa pêtri này vào tủ lạnh từ 3 đến 5 giờ cho CKS khuếch tán.

Sau đĩ đểở nhiệt độ phịng, quan sát kết quả sau 3- 5 ngày.

2.2.5.Thử khả năng diệt cơn trùng của các chủng nấm sợi rừng ngập mặn.[16]

Nguyên tắc: khả năng diệt sâu của các chủng nấm sợi RNM được đánh giá thơng qua tỉ lệ sâu tơ, tằm chết và LD50 .

Phương pháp:

a-Gây nhiễm trực tiếp bào tử thuần khiết của các chủng nấm sợi RNM với tằm và sâu tơ tuổi ba:

- Đếm 40 tằm hoặc sâu tơ tuổi ba để vào đĩa pêtri đã khử trùng.

- Dùng que cấy vơ trùng gạt các bào tử nấm thuần khiết từ ống giống (tương

đương 0, 25g) lên tằm trong đĩa pêtri thí nghiệm, ghi ký hiệu tên chủng nấm lên hộp pêtri.

- Đối chứng: tằm để nguyên khơng nhiễm nấm.

- Sau khoảng 4 giờ bổ sung đồng đều một lượng lá dâu tươi (4g / 40 con). b-Gây nhiễm bằng dịch nuơi cấy:

Nuơi các chủng nghiên cứu vào mơi trường MT 3 dịch thể trong 3  5 ngày ở

nhiệt độ phịng (280C 300C). Chiết dịch lọc, ly tâm 3000 vịng/ phút, trong 20 phút. Sau đĩ phun 3 ml dịch nuơi cấy lên mỗi đĩa pêtri chứa 40 cá thể sâu tơ (tằm)

Đánh giá:

- Theo dõi sâu, tằm chết trong vịng 15 ngày. - Số sâu, tằm chết ≥ 70%: mạnh

≥ 60 %: khá mạnh ≥ 50 %: trung bình.  40%: yếu.

2.2.6.Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của chất kháng sinh.

Dịch chiết kháng sinh thơ được đặt trong tủ sấy ở 600C; 800C;1000C; 1150C; 1210C kéo dài trong 10, 30, 60 phút rồi xác định họat tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ.

2.2.7.Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên mơi trường thạch cĩ lớp dầu

khống [9], [39].

Dầu khĩang parafin lỏng hay vaselin trung tính, khơng chứa sản phẩm độc đối với vi sinh vật, hấp vơ trùng ở 1210C trong 2 giờ, để nguội.

Chuẩn bị các ống giống đã cấy, ở nhiệt độ phịng và thời gian thích hợp. Đổ lớp dầu khĩang đã vơ trùng lên bề mặt mơi trường cĩ VSV phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm. Hàn kính ống nghiệm bằng parafin rồi đem bảo quản ở nhiệt độ lạnh 40C.

2.2.8.Phương pháp xử lí số liệu bằng tốn thống kê đơn giản

n 1 i 1 X X N   

Trong đĩ X1: giá trị từng lần lặp thí nghiệm N : số lần lặp lại.

i : số lần đo