TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH

RNM (Mangrove) là thuật ngữ dùng để chỉ các loài TV hoặc một khu rừng có nhiều loài sống ở vùng giao thoa giữa đất liền và biển. Chúng có thể mọc tốt ở những vùng khí hậu nóng ẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỰ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- -

Nguyễn Thị Lan Hương

TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN

CẦN GIỜ TP HỒ CHÍ MINH

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT

Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.TRẦN THANH THỦY

Tp.Hồ Chí Minh - 2009

Trang 1

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp

đỡ tôi từ khi thực hiện luận văn tốt nghiệp đến khi thực hiện luận văn thạc sĩ sinh học Cô luôn có mặt bên cạnh, giúp đỡ những khi em gặp khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin ghi nhớ công ơn PGS.TS Lương Đức Phẩm đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, trường Đại học Sư phạm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công viêc nghiên cứu thực hiện luận văn này

Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học, trường Đại học Sư phạm TpHCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

TpHCM, tháng 8 năm 2009 NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận văn này là trung thực thể hiện qua kết

quả thí nghiệm và chưa ai công bố

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lan Hương

MỞ ĐẦU

RNM Cần giờ là một quần thể TV đa dạng sinh học Chiến tranh, bom đạn

và các loại chất độc hóa học đã hủy hoại gần như hoàn toàn khu rừng này Từ năm

1978 đến nay, Thành ủy và UBND Tp.HCM đã phục hồi thành công HST RNM đa dạng độc đáo này Đồng thời, cũng từ đó tạo nên một địa điểm lý tưởng phục vụ cho nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái

Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là nơi lưu giữ nhiều nguồn gen SV quý hiếm, bền vững và có khả năng chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của MT sống Trong đó, ĐV và TV đã được nghiên cứu và thống kê rất chi tiết Riêng hệ VSV phong phú của RNM Cần Giờ vẫn còn nhiều bí ẩn và chưa được khai thác đúng mức Trong số các VSV tại đây thì NS chiếm số lượng rất lớn, giữ vai trò quan trọng trong tuần hoàn vật chất và năng lượng nhờ có hệ enzym phong phú như cellulase, protease, amylase,…

Nổi bật nhất cũng như được ứng dụng nhiều nhất trong hệ enzym thủy phân của NS là amylase Loại enzym phân giải tinh bột này mang lại vị ngọt cho thiên nhiên và con người đã được nghiên cứu từ rất lâu, đến nay các nhà khoa học đã biết khá rõ về nó Hiện nay amylase là một trong những hệ enzym quan trọng nhất của ngành công nghệ sinh học vì chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công nghiệp dệt, Tiếp tực tìm hiểu, khám phá những bí ẩn về cấu trúc và đặc tính của amylase để nâng cao hiệu suất xúc tác của chúng là đề tài hấp dẫn đối với nhiều nhà nghiên cứu

Tuy vậy, nước ta chưa lưu ý nhiều đến lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm amylase từ VSV cũng như NS Việc sản xuất amylase từ NS có rất nhiều

ưu việt như rút ngắn quá trình sản xuất, tận dụng được các nguồn nguyên liệu, phế phẩm nông nghiệp góp phần giảm ô nhiễm MT, enzym có hoạt tính cao và giảm giá thành sản phẩm so với các enzym có nguồn gốc từ TV và ĐV Đặc biệt nếu thu được các chủng NS có khả năng sinh amylase cao và sinh trưởng trong những điều kiện khắc nghiệt như RNM Cần Giờ sẽ rất có ích vì bổ sung thêm được những

chủng NS có đặc tính quý, đầy tiềm năng và ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi Mặc dù vậy, việc nghiên cứu NS sinh amylase từ RNM hiện vẫn chưa được khai thác đúng mức

Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận amylase từ NS, cũng như mong muốn thu nhận được nguồn amylase mang đặc tính quý, chúng tôi tiến

hành đề tài “Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng

NS từ RNM Cần Giờ Tp.HCM”

Mục đích của đề tài

Tuyển chọn được các chủng NS sinh amylase cao từ RNM Cần Giờ

Nhiệm vụ của đề tài

- Phân lập các chủng NS thu nhận được từ RNM Cần Giờ

- Tuyển chọn một số chủng NS có khả năng sinh amylase cao

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại đến loài các NS đã tuyển chọn

- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tổng hợp amylase của các chủng NS đã chọn

- Nghiên cứu một số tính chất của enzym thu được

- Khảo sát các đặc tính sinh học khác

- Thu nhận amylase bán tinh khiết và so sánh với enzym thương mại trên thị trường

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Các chủng NS phân lập từ 5 xã: Long Hòa, Lý Nhơn, An Thới Đông, Tam

Thôn Hiệp và Bình Khánh ở RNM Cần Giờ, Tp.HCM

- Đề tài được tiến hành nghiên cứu tại PTN Vi sinh – Sinh hóa, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Tp.HCM trong thời gian từ tháng 9 năm 2008

đến tháng 5 năm 2009

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét khái quát về RNM Cần Giờ

RNM (Mangrove) là thuật ngữ dùng để chỉ các loài TV hoặc một khu rừng

có nhiều loài sống ở vùng giao thoa giữa đất liền và biển Chúng có thể mọc tốt ở những vùng khí hậu nóng ẩm [4]

Theo GS Phan Nguyên Hồng (1995), diện tích RNM trên thế giới khoảng 16.670.000 ha, và khu vực Châu Á chiếm diện tích lớn nhất trong đó Theo số liệu

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cho thấy, năm 1943 diện tích RNM Việt Nam trên 400.000 ha, đến năm 1996 giảm còn 290.000 ha và 279.000 vào năm

2006 Với diện tích này thì RNM Việt Nam cũng chiếm một phần khá lớn trong khu vực RNM nguyên sinh tự nhiên hiện nay hầu như không còn Đa số RNM hiện nay

là rừng trồng (62%) còn lại là rừng thứ sinh nghèo hoặc rừng mới tái sinh trên bãi bồi HST RNM phân bố dọc bờ biển Việt Nam thuộc 28 tỉnh và thành phố, tập trung chủ yếu ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, bán đảo Cà Mau và hai tỉnh phía Bắc

là Nam Định và Thái Bình Các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long có diện tích RNM chưa đến 100.000 ha Riêng RNM Cần Giờ hay rừng Sác, sau những nỗ lực khôi phục thành công, hiện nay có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha [74]

Với diện tích đạt được như trên, cùng với độ đa dạng sinh học bậc nhất trong các RNM ở Đông - Nam Á , RNM Cần Giờ đã được Tổ chức Văn hóa, Khoa học và Giáo dục LHQ (UNESCO) công nhận là Khu dự trữ sinh quyển của thế giới từ tháng 1-2000 Đây cũng là Khu dự trữ sinh quyển RNM đầu tiên của nước ta và cũng được xem lá “lá phổi” rất quan trọng của Tp.HCM [69]

Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp.HCM:

Về tọa độ địa lý: vĩ độ Bắc 10o22’ – 100o40’09”, kinh độ Đông 106046’ – 107°00’59”

Về ranh giới, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35km, từ Đông sang Tây là

30km Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [5]

RNM Cần Giờ phát triển trên nền một đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng

tụ trầm tích đất sét, phèn hóa và nhiễm mặn Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, có hàm lượng lưu huỳnh dạng khử khá cao và một lượng muối cao không có lợi cho nông nghiệp [21]

Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4 Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400mm hàng năm Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.HCM: mùa mưa là 79 – 83%, mùa khô là 74 – 77% Nhiệt độ trung bình là 25,8oC, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 đến 7oC Chế độ bán nhật triều không đều Độ mặn dao động 1,8 – 3% [5]

RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng xu ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ

biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác

nông nghiệp được trồng lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa v.v…; các vườn cây ăn trái

Thảm TV này là MT sống cho nhiều loài ĐV, theo thống kê năm 1999 như: trên 700 loài ĐV thuỷ sinh không xương sống, 9 loài lưõng thê, 31 loài bò sát, trên

137 loài cá, khoảng 130 loài chim và nhiều ĐV có xương sống có trong sách đỏ Việt Nam Ngoài ra còn có 63 loài phiêu SV, 130 loài tảo [4]

Tuy chưa có nhiều số liệu thống kê về hệ NS RNM Cần Giờ, nhưng chúng ta

có thể thấy các loài TV và ĐV trên chính là nguồn thức ăn tốt nhất cung cấp cho hệ

NS RNM Cần Giờ NS chính là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là tác nhân phân giải các chất hữu cơ, cung cấp thức ăn cho các SV khác trong HST, là một nhân tố không thể thiếu tham gia khép kín chu trình sinh địa hóa của RNM Cần Giờ HST này nằm ở lưu vực ven bờ có nhiều thành phần C phức tạp do thủy triều

đưa vào NS có khả năng sinh các loại amylase, protease, cellulase, chitinase, phân hủy các chất hữu cơ đó để sử dụng và đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ Đặc biệt nơi đây có nguồn tinh bột sẵn có trong lá cây, thân cây (nhất là lá mục và thân mục) sẽ là nguyên liệu cho amylase phân giải tạo glucose cho hoạt động sống của chúng

Hình 1.1 Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và vị trí 5 xã thu mẫu [65]

Ký hiệu : vị trí thu mẫu

Do những đặc điểm trên, RNM Cần Giờ có vai trò là “lá phổi xanh” làm giảm ô nhiễm MT, giảm sự nóng lên của Trái đất và ngăn ngừa tình trạng dâng lên của nước biển RNM Cần Giờ còn là “chiếc lọc sinh học” trong xử lý chất thải, xử

lý chất dinh dưỡng từ đất liền và giữ vai trò vùng đệm chống lại các dòng chảy ô nhiễm đồng thời lọc thức ăn cho các ĐV biển; giúp bảo vệ các loài ĐV trên đất liền khi nước triều lên cao và sóng lớn; bảo vệ bờ biển và cửa sông tránh tình trạng tác hại và xói lở của bão, sóng đối với hệ thống đê biển, giảm chi phí tu bổ đê điều hàng năm; là nơi có lợi nhuận kinh tế cao, cung cấp nguồn hải sản phong phú để sử dụng trong nước và xuất khẩu cũng như các nguồn lợi khác từ rừng, RNM chính

là HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST, nơi hội tụ sự đa dạng của cả

SV biển và đất liền Vì thế, nó còn là PTN sống để nghiên cứu về khả năng chịu đựng và phục hồi của các tổ hợp gen, khả năng phát tán và định cư của các dạng sống [74]

1.2 Sơ lược về NS

1.2.1 Hình thái và cấu trúc NS

NS là VSV có nhân chuẩn, dị dưỡng Sợi nấm có thể có vách ngăn như các

lớp nấm bậc cao như Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes hay không có vách ngăn như các nấm bậc thấp Oomycetes và Zygomycetes Các sợi nấm vừa phát

triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn và phân nhánh tạo hệ sợi nấm còn gọi là khuẩn ty Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm KL NS phát triển từ một bào tử có dạng tròn hay gần tròn Bề mặt

KL có thể mượt, nhung mịn, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có vết khía xuyên tâm, có rãnh hay lồi lõm không đều; mép KL có thể trơn hay răng cưa tùy vào từng loại nấm khác nhau [11, 13, 61, 78]

Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường

có màu Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của KL…có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm [3, 61]

NS sinh sản chủ yếu bằng bào tử Bào tử của NS có thể hình thành theo kiểu

vô tính hay hữu tính Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong

đó bào tử trần là phổ biến nhất Trong sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [11]

NS ngày càng được quan tâm nghiên cứu ngày càng sâu rộng hơn do chúng

có khả năng sinh nhiều các chất có hoạt tính sinh học cao được ứng dụng rộng rãi đem lại nhiều nguồn lợi kinh tế cao như tạo ra các loại enzym, các chất KS, các axit

hữu cơ, các chất có khả năng phân giải các nguồn cacbuahydro (ứng dụng trong xử

 Khả năng sinh các enzym ngoại bào

Enzym được sản xuất từ VSV ngày càng nhiều VSV là nhóm đối tượng duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp So với ĐV

và TV, việc thu nhận enzym từ VSV nói chung và NS nói riêng có rất nhiều ưu điểm như: tốc độ sinh sản nhanh, enzym thu được có hoạt tính rất cao, quá trình sinh trưởng phát triển và tổng hợp enzym của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm (đây là lợi thế rất quan trọng) và VSV có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzym khác nhau Ngày nay, nhiều loại enzym ngoại bào của NS đã được nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng phổ biến như: amylase, protease, cellulase, pectinase, chitinase, [9, 25]

 Khả năng sinh các chất KS

KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác KS được tạo ra từ VSV đang rất được quan tâm và ngày càng phát triển mạnh mẽ trong thời đại hiện nay

Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp Nấm bất toàn Các chất KS được sử dụng chủ yếu trong y tế hiện nay như Penicillin, Cephaco-sporin-C, [11]

 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng [19,73] Ngày nay, nhu cầu sử dụng các axit hữu cơ ngày càng nhiều trong thực phẩm, công nghiệp Một số axit hữu cơ phổ biến được sản xuất từ NS như: axít

xitric từ Asp.niger; axít gluconic thu nhận từ Asp.niger và Asp foetidus; axít lactic sản xuất từ Rhizopus oryzae (Mattey, 1992)

Tại Nhật Bản, các nhà khoa học đã tổng hợp được chất kích thích sinh

trưởng Giberelin từ hai chủng NS Furasium monoforme và Furasium oxysporum

Ngoài lên men sản xuất KS, enzym, các axit hữu cơ, , Penicillium chrysogenum và Asp niger còn tạo ra một lượng lớn sản phẩm phụ của sự lên men

Khuẩn ty của nấm không độc là một thành phần thức ăn lý tưởng bởi vì nó có hàm lượng đạm thô cao (xấp xỉ 12% trên trọng lượng tươi) Khuẩn ty được sử dụng như thành phần thức ăn gia súc NS cũng được sử dụng làm giàu thêm đạm cho thức ăn gia súc,

Tuy vậy, rất nhiều loài NS cũng gây ra những tác hại cho đời sống như mọc trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực phẩm là hư hỏng hay giảm chất lượng sản

phẩm Một số NS cũng tiết ra độc tố gây ung thư (Asp.flavus sinh độc tố Aflatoxin

gây ung thư gan), gây bệnh cho người, ĐV và TV, [56, 72, 73, 74]

1.2.2 Phân loại NS

Hiện nay chỉ mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài trong số khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm có trong tự nhiên Riêng các loài nấm thuộc Nấm bất toàn ở nước ta hiện mới chỉ phát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác

nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004) Bảo tàng giống chuẩn VSV (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đang hợp tác với Viện NITE của Nhật Bản điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm ở Việt Nam và có nhiều khả năng tìm thấy những loài mới nữa

Về phân loại nấm, hiện nay tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1983), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996) Trong luận văn này, chúng tôi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Lân Dũng (2006) [61]

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, để phân loại VSV nói chung,

NS nói riêng, người ta thường dùng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen (PCR – Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả nhanh và chính xác

Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt Phản ứng PCR là một chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu

tự DNA, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút

Sau đó, người ta sẽ tiến hành giải trình tự các axit nucleic

Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc

- Nguyên tắc hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotid

- Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và phương pháp cải biên) : dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase Với việc tổng hợp thêm các deoxynucleotid cùng với các deoxynucleotid thông thường Kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotid

Ở cả 2 phương pháp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình

tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ ghi từ bản điện di [61]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu NS sinh amylase

Ở nước ta và trên thế giới đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về NS sinh amylase đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm enzym này và là cơ sở để ứng dụng vào đời sống

Trên thế giới, trong thời gian gần đây có một số công trình nghiên cứu về amylase của NS khá nổi bật như:

Từ năm 1990, Marianne Graber và Didier Combes đã có công trình nghiên

cứu “Kiểu hoạt động của anpha-amylase từ chủng Asp.oryzae trong MT đậm đặc”

[52]

Trong công trình nghiên cứu năm 1997, P.Woloshuk đã nghiên cứu về các chất gây cảm ứng sự sinh tổng hợp aflatoxin từ hạt ngô bị xâm nhập tạo ra bởi hoạt

tính amylaza từ Asp flavus [56]

Để tận dụng các phế phẩm nông nghiệp trong sản xuất men phân giải tinh

bột, Akpan M.o.Bankole A.M.Adesemowo, đã sử dụng Asp.niger trong công trình

nghiên cứu năm 1999 [50]

Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B N Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính chất của amylaza phân giải tinh bột sống mới từ

Asp.carbonarius vào năm 2001 [55]

Gần đây, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công

trình nghiên cứu “Nghiên cứu về alpha amylase ngoại bào của chi Aspergillus”,

(2008) của Baldwin, Toby M, cho thấy sự liên quan giữa việc sinh alpha amylase

và glucoamylase của chi nấm này [42]

Tại Việt Nam, vào năm 1974, D.V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm

glucoamylase từ Asp.niger và L.V Chứ, Đ.T.T Thu nghiên cứu với đối tượng Asp.awamorii năm 1977 [14]

Đến năm 1984, N.B.Ngà và N.L.Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc

các loài Asp.awamorii, Asp.niger và Asp.oryzae có hoạt tính α – amylase và

glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn [14]

Năm 1977, cũng với đối tượng nghiên cứu Asp.niger, L.V.Nhương và cộng

sự đã thành công khi thu nhận và sử dụng pectinase, amylase để xử lý dược liệu nguồn gốc TV [14]

Nghiên cứu về glucoamylase có công trình “Nghiên cứu chọn lọc được

chủng Asp.niger TH3 – 19K của Nhật Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để

thủy phân tinh bột sống” của D.V.Hợp và cộng sự, năm 1993 [14]

Asp.niger BS cũng được Đặng Văn Lợi, Lê Văn Hoàng đưa vào nghiên cứu

nhằm tối ưu hoá quá trình sinh tổng hợp enzim amylase và cellulase [23]

Năm 1998, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có

công trình “Thu nhận amylase từ nấm mốc Asp sp” [2]

Nổi bật nhất trong các nghiên cứu gần đây nhất là các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu và sản xuất thành công hai loại thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi (kể cả thuỷ sản) là sản phẩm lên men từ bã sắn

và góp phần giải quyết ô nhiễm MT Hai sản phẩm đó có tên gọi là ProBio-S và Bio-E (quá trình lên men tạo ra ba loại enzym là α – amylase, glucoamylase và cellulase) Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên 15-20 lợn con một tháng tuổi cho thấy sau ba tháng được ăn hai chế phẩm trên, lợn tăng trọng nhanh hơn 1,1-1,3kg so với những con đối chứng [14, 40]

1.3 Tinh bột và hệ enzym amylase

Amilopectin có các gốc glucose gắn với nhau không chỉ nhờ liên kết glucoside mà còn nhờ liên kết α-1,6-glucoside, chính liên kết này hình thành cấu trúc nhánh trong amilopectin Phân tử amilopectin chứa khoảng 200.000 đến 1.000.000 phân tử glucose, phân bố ở mặt ngoài hạt tinh bột Amilopectin chỉ hoà tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao, amilopectin tạo màu đỏ với iod [7, 8, 29, 33]

α-1,4-1.3.2 Hệ enzym amylase

Amylase là tên gọi của một nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin [8,11]

Cơ chất chủ yếu của amylase là tinh bột Đây là một polysaccharide phổ biến

ở TV, được tích lũy nhiều trong các hạt hòa thảo, trong củ, thân cây và lá cây Tinh bột có vai trò dinh dưỡng đặc biệt lớn vì trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn năng lượng chính cho SV

Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là:

a α – amylase hay glucohydrolase là enzym phân cắt các liên kết

α-1,4-glucoside trong mạch amylose và amilopectin một cách ngẫu nhiên Đây là enzym

có ở TV, ĐV và đặc biệt có nhiều ở VSV, thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành

maltose và glucose Dưới tác động của α – amylase, tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt của tinh bột giảm nhanh Nếu thời gian tác dụng dài thì sản phẩm thủy phân amylose chứa 13% glucose và 87% maltose, còn với amilopectin

sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose Enzym này hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột rất nhanh

Một số đặc tính của α – amylase:

- Dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu loãng Phân tử lượng α – amylase giảm (14.000 – 15.000) còn canxi tăng theo nhiệt độ nuôi cấy VSV Nếu tách hoàn toàn canxi khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì canxi tham gia hình thành và ổn định enzym Canxi còn có tác dụng đảm bảo α – amylase có độ bền cực lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các protease [7, 29]

- pH tối thích α – amylase từ NS là 4,5 – 4,8 (hoạt động 4,5 – 5,8), từ đại mạch và thóc mầm là 5,3 (4,7 – 5,4), và VK là 5,8 – 6,0 (5,8 – 7,0) pH tối thích của

α – amylase từ Asp.oryzae là 4,8 – 5,8 pH <3, đa số α – amylase bị bất hoạt hoàn toàn, trừ α – amylase của Asp.niger có thể chịu được pH 2,5 – 2,8 [7, 25, 29]

- α – amylase của NS rất nhạy cảm với nhiệt độ (tối thích 50oC), thóc mầm

và malt 58 – 60oC trong khi nhiều VK, chúng có thể giữ hoạt tính ở 70 – 90oC Tính bền nhiệt của α – amylase do sự có mặt của canxi trong phân tử enzym [6, 27, 28] Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn:

- Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân, tạo một lượng dextrin và độ nhớt từ hồ tinh bột giảm nhanh Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành tiếp tục tạo các dextrin phân tử thấp hơn, maltose, isomaltose và glucose

Tuy nhiên, thông thường trong một thời gian ngắn (30 – 60 phút), α – amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose Khả năng dextrin hóa cao của α – amylase là tính chất đặc trưng của

nó Vì vậy người ta còn gọi loại amylase này là amylase dextrin hay amylase dịch hóa

Những chủng VSV có khả năng tổng hợp α – amylase có ý nghĩa công

nghiệp: Baccillus subtilis, Baccillus licheniformis, Asp.oryzae [7]

b β – amylase (α -1,4 – glucan – mantohidrolase) chỉ phân cắt các liên kết

α – 1,4 glucoside ở đầu mạch Enzym này phổ biến ở TV, nhiều ở hạt nảy mầm β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 70oC nhưng trong dịch nấu thì nhiệt độ tối thích là 60 – 65oC Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3 – 4 Đa số

β – amylase hoạt động mạnh hơn ở MT pH 4,5 – 5 và vẫn giữ được hoạt tính khi không có canxi

Điểm khác biệt cùa enzym này so với α – amylase là hầu như không tác dụng lên tinh bột sống mà chỉ phân giải mạnh hồ tinh bột Chúng phân giải 100% amylose và 54 – 58% amylopectin thành maltose

β – amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có canxi [15, 29]

c Glucoamylase (γ – amylase hay α – 1,4 – glucan – glucohydrolase) thủy

phân liên kết α-1,4 glucosid và α-1,6 glucosid trong chuỗi polysaccharide Enzym này có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose (Azarova, 1981; Jerebtxov, Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia, Rodzevits, 1974; Logina Karpukhina, 1978)

Phân tử lượng gucoamylase thường không ổn định, dao động từ 50.000 đến 95.000 dalton Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 – 5,0 Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH kiềm Ví dụ glucoamylase của loài

Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH 9, glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH 8 [25]

Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 60oC Hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70oC Tuy nhiên cũng có trường hợp glucoamylase hoạt động tốt nhất ở 65 – 70oC, ví dụ như ở loài C thermosaccharolytium Enzym

này bị ức chế mạnh bởi Hg+ nhưng các ion Mn2+ và Fe2+ lại có tác dụng kích thích Sản phẩm của giai đoạn đường hóa chủ yếu tạo ra glucose

Một số VSV có khả năng tổng hợp glucoamylase có ý nghĩa công nghiệp:

nấm mốc Rhizopus, Asp.awamori, Asp.niger; nấm men Endomycopsis [25, 29]

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của VSV

NS có khả năng sinh enzym này cao là điều quan trọng đầu tiên Ngoài ra chủng NS thu được cũng cần được bảo quản và nuôi cấy trong những điều kiện tốt nhất, nhằm hạn chế việc bị biến tính, nhất là trong điều kiện NS phân lập từ RNM Trong nghiên cứu cũng như sản xuất, việc tuyển chọn và bảo quản giống là điều rất quan trọng Vì nếu chủng VSV tuyển chọn không giữ được hoạt tính ban đầu thì những thành quả thu được cũng vô ích Vì tầm quan trọng như vậy, nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này lên tầm cỡ quốc gia và đã thành lập các trung tâm, các chi nhánh giữ giống gọi là bảo tàng VSV [31,33]

b Nguồn dinh dưỡng

Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống và tạo thành enzym của VSV MT nuôi cấy VSV phải bảo đảm có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với nhu cầu của từng VSV

cụ thể

 Ảnh hưởng của nguồn C

Thành phần và hàm lượng C có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp enzym Nhiều tác giả cho rằng: muốn thu được hàm lượng amylase cao thì trong MT nuôi cấy VSV không được chứa nguồn C dễ hấp thu Nói chung amylase thủy phân tinh

bột là enzym cảm ứng nên sự có mặt của cơ chất tinh bột thường thúc đẩy quá trình tạo amylase [25]

Theo Grigorev, ảnh hưởng nguồn C đến cường độ sinh tổng hợp amylase có thể xếp theo thứ tự sau:

- Đối với α – amylase: tinh bột > dextrin > maltose > lactose > glucose > saccharose > galactose > manose > arabinose

- Đối với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltose > saccharose > glucose > lactose > arabinose > galactose > manose [31]

Nồng độ nguồn C trong MT cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym Mỗi loài VSV chỉ có thể tạo lượng amylase cao nhất ở một nồng độ hydratcacbon nhất định Ví dụ trên MT Czapek, nồng độ tinh bột ảnh hưởng rõ rệt đến sinh tổng hợp enzym amylase Nồng độ tinh bột tối thích cho sinh tổng hợp α – amylase là 6% , đối với glucoamylase là 3%

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác Trong đó, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả vì có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển Mặt khác khi tạo MT, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu [25]

Bảng 1.1 Ảnh hưởng cơ chất đến sinh tổng hợp α – amylase và glucoamylase của

Ngoài ra, để giảm giá thành sản phẩm khi ứng dụng sản xuất amylase cho chăn nuôi, người ta có thể dùng khoai mì hay bã khoai mì như một chất cảm ứng rẻ tiền và thường có sẵn trong thức ăn gia súc

Ở nước ta, các phụ phẩm nông nghiệp trên như: rơm, cám gạo, cám mì, bã khoai mì, trấu, có đến hàng 20 – 30 tấn/năm Đây là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi cũng như là các cơ chất lên men rẻ tiền trong công nghệ lên men VSV [47,56]

 Ảnh hưỏng của nguồn N

N cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên protein cấu trúc cũng như các enzym Nguồn N bổ sung vào MT nuôi cấy có thể là N vô cơ hay N hữu cơ Việc chọn nguồn N bổ sung vào MT nuôi cấy là rất cần thiết để bảo đảm hiệu suất sinh tổng hợp cao đồng thời có lợi về mặt kinh tế Nguồn N vô cơ thường dùng là nitrat amon, nitrat natri (có hiệu quả hơn các loại khác) hay sulfat amon, urê, Nitrat natri là nguồn dinh dưỡng N thường dùng để nuôi nhiều loại NS sinh amylase với hàm lượng 0,91% Các hợp chất N hữu cơ có thể là nguyên liệu giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô đâu, Ngoài ra, một số axit amin cũng thường được

bổ sung vào MT nuôi cấy VSV [7]

Khi sử dụng nguồn N nhất định cho vào MT nuôi cấy VSV có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, quá trình tổng hợp enzym sẽ chuyển theo hướng tích cực tổng hợp glucoamylase và ức chế tổng hợp α – amylase

Sự cân bằng giữa C và N trong MT có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối VSV và sự tạo thành amylase Khi MT có đủ lượng C và N cần thiết sẽ tích lũy được lượng amylase cực lớn Tỉ lượng tối ưu của C và N cho sinh tổng hợp amylase

là 10:1 đến 40:1 Trong MT Czapeck, tỉ lượng giữa tinh bột và NaNO3 tối ưu cho sinh tổng hợp các amylase vào khoảng 18:1.[25]

 Các nguồn dinh dưỡng khoáng

Magie ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng xấu đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối

ưu của muối này cho sự tổng hợp α – amylase và glucoamylase là 0,05%

Phosphore ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của NS nên sẽ tăng cường tổng hợp các amylase Khi bổ sung phosphore hữu cơ vào MT sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2- 3 lần

Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α – amylase hoạt động vì là thành phần không thể thiếu được của enzym này và bảo vệ amylase khỏi tác động của protease

Ngoài ra, sự có mặt của Mn, Cu, Hg sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase

Nguồn S thích hợp nhất đối với sự sinh tổng hợp amylase là methionin, muối sulfat (trừ CuSO4)

 Điều kiện nuôi cấy

Ngoài các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuôi cấy VSV các yếu tố như nhiệt

độ, độ ẩm, pH, thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV

- Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của đa số NS là 28 – 32oC Chu kì sinh trưởng NS có thể chia làm 3 thời kì: thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10 – 11giờ đầu tiên), nhiệt độ cần cung cấp không thấp hơn 23 – 30oC Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4 – 18giờ), nấm hô hấp mạnh nên giữ nhiệt độ phòng nuôi khoảng 28 – 29oC Ở thời kì sinh amylase mạnh (10 – 12giờ), nên giữ nhiệt độ khoảng 28 – 29oC Đây chính là nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase của đa số NS trên MT rắn

- pH của MT

Khi nuôi cấy VSV bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt thì pH MT ít bị thay đổi trong quá trình nuôi do MT có dung đệm cao và hàm độ ẩm thấp Tuy nhiên, pH ban đầu cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển và hình thành enzym của VSV Ở pH 4,5 – 5,0 NS tạo hệ amylase tốt nhất sau đó đến hệ pectinase còn protease thì kém hơn Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi

VK lại phát triển và sinh enzym cao ở MT trung tính pH MT không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà còn ảnh hưởng đến chủng loại enzym được tổng

hợp Ví dụ, A.oryzae khi MT pH 6,5 thì ưu thế tổng hợp thuộc về α – amylase, trong

khi đó ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH MT là 4,5 [45]

Trong suốt quá trình nuôi cấy NS, ta có thể điều chỉnh pH MT bằng axit HCl, H2SO4, NaOH, KOH Việc điều chỉnh pH thích hợp trong quá trình nuôi cấy

NS còn hạn chế sự tạp nhiễm do VK làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [54]

- Độ ẩm MT

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, độ ẩm MT là một trong những yều

tố cần thiết cho sự sinh trưởng NS Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu thích hợp với NS là 58 - 60%, độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất

Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thoáng khí của MT, còn khi độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như kìm hãm sự tạo amylase [25, 31]

- Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym Trong quá trình nuôi cấy NS, sự hình thành bào tử làm giảm khả năng tạo amylase Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của từng chủng nấm và sự ngừng tổng hợp enzym mà có thể ngừng sinh trưởng NS vào lúc cần thiết Ở đa số NS, sự hình thành amylase cực đại thường kết thúc khi NS bắt đầu sinh bào tử Thời gian kết thúc sự tạo thành amylase thường từ 30 đến 42 giờ [31, 33]

1.3.4 Các phương pháp thu nhận amylase từ NS

a Phương pháp nuôi bề mặt - MT nuôi dạng rắn

NS phát triển trên bề mặt MT chất dinh dưỡng dạng rắn, xốp, ẩm Nguyên liệu chính thường là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo, gạo nếp,…được bổ sung lượng nhỏ (10 – 20%) trấu, mạt cưa, MT sau khi được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác thì hấp thanh trùng ở 1 – 1,5 atm/45 – 60 phút,

để nguội rồi cho bào tử nấm hay NS vào MT đã cấy giống được trải trên khay nuôi

ở điều kiện tối thích Sau khoảng thời gian thích hợp, người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 40oC để đạt độ ẩm 8 – 12%, nghiền nhỏ Đây chính là chế phẩm enzym dạng rắn – thô Sau đó, chế phẩm này còn phải trải qua giai đoạn tinh chế để thu được enzym bán tinh khiết hay tinh khiết

b Phương pháp nuôi bề sâu (chìm) - MT nuôi dạng lỏng

Nguyên liệu chính thường dùng là dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tinh bột có bổ sung nguồn N vô cơ (NaNO3) Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng tốt và tổng hợp nhiều amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô,….Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung cấp oxy cho NS phát triển

Để thu nhận enzym, dịch lên men được cô đặc ở nhiệt độ thấp

Phương pháp nuôi cấy bề mặt được sử dụng từ rất lâu và hiện nay cũng được ứng dụng nhiều hơn so với phương pháp nuôi bề sâu vì chi phí thấp mà khả năng sinh tổng hợp enzym cao [26]

1.3.5 Một số ứng dụng amylase trong công nghệ sinh học

a Công nghệ rượu, bia, cồn

Vài chục năm gần đây, người ta đã bắt đầu sử dụng chế phẩm amylase từ NS

Asp oryzae hay Asp.awamori, VK Baccillus subtilis để thay thế malt trong việc

đường hóa tinh bột sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có chứa tinh bột Việc sử dụng chế phẩm amylase từ VSV thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch tốt, giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất [35]

Trước đây, sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột thường sử dụng malt giống trong sản xuất bia Sau đó, các nhà khoa học Nhật Bản đưa ra phương pháp sản xuất amylase từ NS thay thế amylase của malt và được ứng dụng đến nay

Amylase đầu tiên sử dụng trong sản xuất cồn là amylase thu được từ Asp.oryzae

Tại Việt Nam hiện nay, người ta thường dùng chế phẩm Asp.usamii để sản

xuất rượu từ tinh bột [26]

b Sản xuất bánh mì

Khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp Nhiệt độ vô hoạt α – amylase của NS tương đối cao (70oC) nên có thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà vẫn không có hiện tượng dextrin hóa khi nướng Hơn nữa, hoạt độ α – amylase cao nên có thể đạt đến độ đường hóa cần thiết rất nhanh chóng, sau đó bị

vô hoạt ngay Tuy nhiên, chế phẩm enzym NS (thường dùng từ Asp.oryzae) thường

là phức hệ enzym Trong đó protease có thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi, do

đó phải loại bỏ protease trước khi sử dụng [26]

c Sản xuất thức ăn chăn nuôi

Bổ sung chế phẩm amylase của Asp.oryzae, Asp awamorii vào khẩu phần ăn

của ĐV nhất là ĐV non làm tăng khả năng đồng hóa dẫn đến tăng trọng nhanh

Amylase là một trong những enzym được chú trọng trong chăn nuôi gia súc, đặc biệt là lợn con cai sữa và sau cai sữa (từ 5 – 20kg) Đây là giai đoạn mà việc bổ sung enzym vào thức ăn có tác dụng nhất để tăng trọng vả bảo vệ lợn Enzym bổ sung sử dụng theo 2 cách: trộn vào thức ăn hay dùng enzym xử lý thức ăn rồi mới cho ĐV ăn nhằm làm tăng hệ số sử dụng thức ăn [36]

Tại Việt Nam, các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu và sản xuất thành công hai loại thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi,

kể cả thuỷ sản từ bã sắn là sản phẩm lên men từ bã sắn sử dụng làm thức ăn gia súc

và giải quyết ô nhiễm MT: ProBio-S và Bio-E

d Một số ứng dụng khác

-Trong y học và lâm sàng, chế phẩm amylase cho phép phát hiện các

oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy cao

- Trong công nghệ dệt, chế phẩm amylase được dùng để phân hủy tinh bột trên sợi vải

- Các VSV kiểm định: Escherichia coli, Bacillius subtilis

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

a Hóa chất

- Cồn, NaNO3, NaNO2, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, NaCl, HCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Dinitrosalisilic, sodium potassium tartrate (Trung Quốc), dầu DO (Việt Nam)

- Glucose, maltose, lactose, sucrose, galactose, tinh bột tan, pepton, cao thịt, casein (Trung Quốc) , thuốc thử lugol, HgCl2, nước chiết khoai tây, agar (Việt Nam), cao nấm men (Mỹ), cao malt (Đức), cao thịt (Đức),

- Cám, bã khoai mì, bột bắp, bột đậu nành, trấu (Việt Nam)

- Chế phẩm amylase Ter của Viện sinh học nhiệt đới cung cấp

b Dụng cụ

Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, que cấy, que gạt, bông không thấm nước, bông thấm nước, khoan nút chai, đèn cồn, cốc thủy tinh, cối, chày, phiến kính, lá kính,

2.1.3 Các MT sử dụng trong thí nghiệm

a MT phân lập, nuôi cấy, giữ giống và định danh NS

- MT1 - MT Czapek – Dox cải tiến: 3,5g NaNO3; 1,5g K2HPO4; 0,5g KCl ; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,01g FeSO4.7H2O; 20g glucose; 20g agar; 1000ml nước biển;

pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút

- MT2 - MT cao nấm men-YEA (Glucose Yeast Extract Agar): 4g cao nấm men; 20g glucose; 20g agar; 1000ml nước biển; pH = 5,5 – 6,0; khử trùng 1atm/ 30 phút

b MT định tính khả năng phân giải các hệ enzym thủy phân amylase, cellulose, protease, pectinase

- MT3 - MT cảm ứng tổng hợp amylase: 35g NaNO3; 1,5g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KCl; 0,01g FeSO4.7H2O; 10g tinh bột tan; 20g agar; 1000ml nước biển; pH = 6,5; khử trùng 1atm/ 30 phút

- MT4 - MT cảm ứng tổng hợp cellulose: Tương tự MT3 nhưng thay 10g tinh bột tan bằng 10g CMC

- MT5 - MT cảm ứng tổng hợp protease: Tương tự MT3 nhưng không sử dụng NaNO3 và thay 10g tinh bột tan bằng 10g casein

- MT6 - MT cảm ứng tổng hợp chitinase: Tương tự MT3 nhưng thay 10g tinh bột bằng 10g bột chitin

- MT7 - MT cảm ứng tổng hợp pectinase: 200g cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước biển trong 60 phút, thêm một tít CaCO3 để trung hòa MT Lọc lấy nước trong, bổ sung 20g agar Chỉnh MT để có pH = 6,5 Khử trủng 1atm/30phút

- MT8: MT phát hiện khả năng phân giải dầu: 0,3g KH2PO4; 0,4g MgSO4; 3g KNO3; 0,7g Na2HPO4; 1000ml nước biển; 5ml dầu DO; pH = 5,5 – 6,0; khử trùng 1atm/30phút

c MT khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase

- MT9: 70% cám gạo; 25% trấu; 5% bã khoai mì; độ ẩm 60%; pH = 5 – 5,5; khử trùng 1atm/ 30 phút

- MT10 [16]: 50% cám gạo; 33% bắp mảnh; 17% trấu; pH = 5 – 5,5; độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/ 30 phút

- MT11: 50% cám gạo; 16,5% bã khoai mì; 16,5% bắp mảnh; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH = 5 – 5,5; khử trùng 1atm/30 phút

- MT12 [22]: 90% bã khoai mì; 10% trấu; bổ sung dung dịch khoáng (K2HPO4

0,1%; NH4Cl 0,1%; KNO3 0,3%; MgSO4 0,05%) cho đủ độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/30 phút

- MT13: 50% cám gạo; 33% bã khoai mì; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH = 5 – 5,5; khử trùng 1atm/30 phút

d MT nuôi cấy giống VK kiểm định

MT14 - MT MPA (Meat peptone agar): 5g pepton; 5g NaCl; 5g cao thịt; 20g agar; 1000ml nước biển; pH = 7,5; khử trùng 1atm/ 30 phút

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu

a Phương pháp phân lập mẫu truyền thống (F.Uyenco, 1988)

- Lấy mẫu và pha loãng mẫu: lấy 10g mẫu lá, đất, thân cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển vô trùng, dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong 2 phút, tốc độ

230 vòng/phút Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngoài Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1 Lắc đều rồi hút 1ml dung dịch

10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2, tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5

- Cấy mẫu: Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa MT1 Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch Sau đó sử dụng que trang đó gạt trên 2 đĩa tiếp theo

- Ủ mẫu: Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phòng 3 – 7 ngày Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng

- Làm thuần: Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng hòa vào nước biển

vô trùng, trải lên đĩa lần 2 Nếu các dạng KL mọc lên đồng đều, màu sắc giống

nhau, soi dưới kính hiển vi đều có một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết

Sau đó chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa

- Quy ước chủng

+ Chữ cái đầu tiên: cơ chất lấy mẫu (L: lá vàng; LM: lá mục; CM: cành mục; CK: cành khô; Đ: đất sâu; ĐM: đất mặt)

+ Chữ số kế tiếp: số thự tự mẫu thu được từ cơ chất nào đó

+ Chữ số cuối cùng: xã lấy mẫu (1: Long Hoà; 2: Lý Nhơn; 3: Anh Thới Đông; 4: Tam Thôn Hiệp)

b Phương pháp phân lập có mục tiêu

Sử dụng MT cảm ứng có sẵn cơ chất tinh bột đặt tại RNM Cần Giờ trong 07 ngày rồi thu mẫu

- MT cảm ứng có cơ chất tinh bột: Sử dụng 2 loại MT: MT11 và MT13; cân 15

g mẫu MT11 hay MT13 cho vào bình tam giác 250ml, hấp tiệt trùng rồi đặt tại các gốc cây, trên mặt đất, trên thân cây; số lượng bình cảm ứng: 02 bình mỗi loại/địa điểm; 03 địa điểm/xã

- Lấy mẫu: Sau 07 ngày, thu lại các bình tam giác chứa MT cảm ứng đã có các loại NS mọc trong đó; dùng que cấy lấy các sợi nấm trong mỗi bình, cấy chấm điểm vào đĩa petri đã có sẵn MT1

Các bước ủ mẫu và làm thuần tiến hành tương tự phương pháp phân lập truyền thống

2.2.1.2 Phương pháp giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khoáng (Lumiere

4oC Phương pháp này có thể bảo quản 1 -3 năm

2.2.1.3 Phương pháp quan sát đại thể NS

NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau:

- Cho vào ống nghiệm 5ml nước biển vô trùng, dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm, lắc đều tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào giữa mặt thạch ở giữa hộp petri Làm 2, 3 hộp

- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL Hàng ngày lấy ra quan sát

- Quan sát dưới kính lúp 3 chiều để mô tả các đặc điểm:

+ Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nó

+ Hình dạng KL

+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc

+ Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT

+ Đặc điểm của mép KL

+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL,…

2.2.1.4 Phương pháp quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch (J T Dunean)

- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri

- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8mm, khoan các khối thạch

- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất

- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc nhuộm lactophenol, được tiêu bản thứ nhất

- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên, được tiêu bản thứ hai

- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm:

* Hình dạng cuống sinh bào tử

* Hình dạng thể bình

* Hình dạng các thể bọng

* Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn

* Đặc điểm bào tử đính

* Màu sắc, kích thước bào tử…

- Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần

2.2.1.5 Xác định hoạt tính enzym ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên thạch (William, 1983)

a Nguyên tắc

Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải trong suốt quanh KL

b Cách tiến hành

- Dùng MT định tính khả năng phân giải các loại enzym ngoại bào

- Phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và MT thử hoạt tính enzym ngoại bào tương ứng (MT3, MT4, MT5, MT6, MT7), cấy chấm

điểm các chủng NS nghiên cứu lên các đĩa MT (3 điểm/đĩa), giữ các đĩa trong

28-30oC, 3-4 ngày

- Phương pháp đục lỗ trên thạch:

+ Thu dịch nuôi cấy: dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng NS vào bình tam giác 50ml MT dịch thể vô trùng (MT3, MT4, MT5, MT6, MT7)

+ Nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút), 4 ngày, 25-28oC

+ Ly tâm 20ml dịch nuôi cấy 3000 vòng/phút, 20 phút

+ Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng là dịch enzym thô, bổ sung 0,04% NaN3 để khử trùng; có thể giữ dịch ly tâm 1 tháng trong

tủ lạnh sâu ở -20oC

+ Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 8mm) khoan các lỗ thạch trên MT nghiên cứu tương ứng trong các đĩa

+ Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym thô vào các lỗ khoan trên các

MT thử hoạt tính tương ứng Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 4oC, 2-4 giờ, sau đó chuyển sang tủ ấm 28-30oC trong vòng 24giờ

+ Thuốc thử lugol (hỗn hợp 0,05% I2 với 2,65%KI) cho amylase, cellulase, chitinase, dung dịch 10%HgCl2 cho protease

c Kiểm tra kết quả

- Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase

+ Nếu NS có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hay lỗ khoan chứa dịch enzym do tinh bột đã bị phân giải Vùng tinh bột chưa bị phân giải

có màu xanh tím đậm

+ Nếu NS có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hay lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose đã bị phân giải Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt

+ Nếu NS có hoạt tính chitinase, vùng chitin chưa bị phân giải có màu nâu

đỏ nhạt

- Kiểm tra hoạt tính protease Nếu NS sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL hay quanh lỗ khoan chứa dịch enzym do các phân tử protein bị phân

giải không phản ứng với HgCl2 Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 bị kết tủa

d Đánh giá khả năng tạo enzym

- Đặt sấp hộp petri Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đường kính KL (d) hay đường kính lỗ thạch (d = 8mm)

- Dựa vào kết quả (D – d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng NS Giá trị (D – d) càng lớn thì khả năng sinh enzym của các chủng NS càng cao

-Quy ước: D – d >= 25mm: hoạt tính enzym mạnh; D – d >= 20mm: khá mạnh;

b Cách tiến hành

- Phương pháp khối thạch

+ Cấy các chủng NS nghiên cứu vào MT2 (thay nước biển bằng nước cất)

+ Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có NS cần thử hoạt tính KS

+ Đặt các khối thạch vào đĩa petri có MT14 đã cấy VSV kiểm định

- Phương pháp khuếch tán trên MT thạch

+ Cách thu dịch KS tương tự thu dịch enzym Sau đó điều chỉnh pH của dịch thể về pH trung tính Các VSV kiểm định được cấy truyền từ ống giống sang MT lỏng

+ Dùng pipet vô trùng lấy 0,1ml MT lỏng có chứa VSV kiểm định nhỏ vào đĩa petri có chứa MT dinh dưỡng tương ứng (MT14) Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt dịch VSV kiểm dịnh trên bề mặt thạch

+ Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 8mm) khoan các lỗ trên MT thạch có chứa VSV kiểm định

+ Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch chiết KS nghiên cứu vào các lỗ khoan + Để các đĩa petri vào tủ lạnh 4oC trong 4-8 giờ để dịch KS khuếch tán vào trong thạch rồi chuyển sang tủ ấm 30oC Kiểm tra vòng ức chế sau 24 giờ

c Kiểm tra kết quả

Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số (D – d, mm) D: đường kính vòng phân giải, d: đường kính KL (lỗ thạch) D – d >= 25mm: hoạt tính KS rất mạnh; D – d >= 20mm: mạnh; D – d = 15 – 18mm: trung bình; D – d <10mm: yếu

2.2.1.7 Phương pháp thử khả năng phân giải dầu

a Cách tiến hành

Cấy NS trong bình tam giác 100ml chứa 50ml dầu khoáng (MT8) Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, đo sinh khối của NS, kiểm tra sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải dầu của NS

b Cách đo sinh khối NS

Cấy bào tử NS vào bình tam giác và cân trọng lượng ban đầu bằng cân phân tích Sau khi nuôi cấy 15 ngày, cân lại bình tam giác để biết được sinh khối NS

2.2.1.8 Phương pháp định danh vi nấm bằng di truyền phân tử (PCR)

- Lấy mẫu nấm nuôi cấy một lượng khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendorf

- Cho thêm 180μl TE1X và 20μl Prokprep rồi đem ủ ở 56oC qua đêm

- Thêm 500μl Phenol Buffer và 500μl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi

- Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC Đổ bỏ dịch nổi

- Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500μl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3 – 4 lần Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút Đổ bỏ dịch nổi

- Làm khô cặn DNA ở 56oC trong 10 – 15 phút

- Hòa tan cặn DNA trong 50μl TE1X Lấy 5μl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuận PCR nấm

- Lấy 5μl DNA của vi nấm sau khi ly trích cho vào PCR mix

- Phân tích kết quả: Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% hoặc điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer Sản phẩm PCR có độ dài 260bp

- Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và tiến hành giải trình tự trên hệ thống ABI 3130X hoặc CEQ 8000

Sau khi có trình tự gen của NS nghiên cứu, tiến hành so sánh với trình tự gen trong hệ thống ngân hàng gen của Mỹ để xác định chi và loài của chúng

2.2.1.9 Phương pháp nuôi cấy NS trên MT xốp [41,42]

Cho vào mỗi bình tam giác (250ml) 15g MT xốp, hấp khử trùng

Cho 10ml nước cất vào ống thạch nghiêng nuôi NS, hòa đều Dùng que cấy, móc cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù

Lấy 2ml dịch bào tử (khoảng 105 – 106 bào tử/1g MT) Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết dịch amylase thô từ canh trường nuôi cấy

Sau thời gian nuôi cấy NS, dịch chiết enzym thô được tách chiết theo phương pháp sau:

Cho 100ml nước cất vào mỗi bình tam giác MT xốp đang nuôi NS Lắc đều, giữ ở nhiệt độ 3 – 4oC, trong 30 – 45 phút để enzym khuếch tán Sau đó, đem hỗn hợp lọc qua vải và ly tâm dịch lọc 5000 vòng/ phút trong 15 phút Thu dịch ly tâm, rồi định mức 100ml Ta thu được dịch enzym thô và đem xác định hoạt độ amylase

2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ dịch hóa (Phương pháp Henkeil, 1956)

a Nguyên tắc

Amylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bột thành đường Lượng tinh bột còn lại sẽ phản ứng màu với iod Xác định lượng tinh bột bị thủy giải, từ đó tính ra hoạt độ amylase theo định nghĩa:

Hoạt độ amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thủy giải bởi 1ml dịch enzym (hay mg nguyên liệu chứa enzym) trong 1 phút ở điều kiện chuẩn 50oC, pH

6

b Hóa chất

Dung dịch NaH2PO4 0,05M

Dung dịch Na2HPO4 0,05M

- Dung dịch đệm phosphate 0,05M pH6: trộn 87,7ml dung dịch NaH2PO4 0,05M

và 12,3ml dung dịch Na2HPO4 0,05M, thêm 100ml nước cất, đo lại pH bằng máy

đo pH

- Dung dịch tinh bột 1% pha trong pH 6: lấy 50ml dung dịch đệm phosphate 0,05M đem đun sôi Cân 1g tinh bột tan, hòa vào một ít đệm, khuấy đều, đổ vào dung dịch đệm đang sôi, vừa khuấy vừa đun sôi trong 3 phút cho đến khi dung dịch trong suốt Định mức đến 100ml bằng dung dịch đệm

- Dung dịch iod: 1gI2 và 2gKI, thêm nước thành 100ml, bảo quản lạnh Khi dùng pha loãng 500 lần

+ Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 5ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lần

+ Đo OD ở bước sóng 560nm

+ Vẽ đồ thị mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị ΔOD

Dung dịch enzym (ml) 0 0,5

* Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên Thêm vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch I2KI đã pha loãng

* Lắc đều đem đo OD tại bước sóng 560nm

Công thức tính hoạt độ α – amylase trong 1ml dịch enzym:

X * V * k Hoạt độ enzym (UI/g/phút) =

t * v * m

X: số tinh bột suy ra từ đường chuẩn (mg)

V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzym (ml)

k: hệ số pha loãng

v: thể tích enzym cho vào hỗn hợp phản ứng enzym (ml)

t: thời gian enzym phản ứng (phút)

m: khối lượng canh trường NS (g)

2.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (theo Miller)

Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate Đun nhẹ cho tan rồi định mức đến 100ml

Dung dịch glucose mẫu (500μ/ml) cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1l

+ Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose

+ Mẫu thí nghiệm: Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn

+ Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng

2.2.2.4 Phương pháp xác định khả năng đường hóa

- Dịch enzym được pha loãng thêm 10 lần

- Lần lượt cho các dung dịch vào ống nghiệm theo thứ tự

- Công thức tính: Một đơn vị hoạt độ tương ứng với 1μg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất tinh bột trong 30 phút ở nhiệt độ 30oC

a * n * V Hoạt độ enzym (UI/g/phút) =

m: khối lượng canh trưởng (g)

2.2.2.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng các chủng NS

a Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng NS

- Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa petri

- Quan sát sự phát triển KL sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày Đo đường kính KL mỗi ngày để xác định tốc độ sinh trưởng của KL

Quy ước: d = 1 – 2mm: mọc yếu; d = 2,1 – 5mm: mọc trung bình; d = 5,5 – 10mm: mọc tốt; d = 11 – 30mm: mọc rất tốt

b Xác định khả năng đồng hóa nguồn C

- Sử dụng MT1, glucose lần lượt được thay thế bằng các nguồn C khác nhau: tinh bột, lactose, surcrose, maltose và galactose Trọng lượng các chất thay thế được lấy đúng bằng hàm lượng C trong MT1

- Cấy chấm điểm các chủng NS lên các MT nghiên cứu trong đĩa petri, ủ trong

tủ ấm 3 ngày

- Mẫu đối chứng là MT1

c Xác định khả năng đồng hóa nguồn N

- Sử dụng MT1 và NaNO3 lần lượt được thay bằng các nguồn N khác: NaNO2, (NH4)2SO4, NaNO3, pepton, cao thịt, cao nấm men, cao malt, bột đậu nành với hàm lượng tương tự

- Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT nghiên cứu, ủ trong tủ ấm 3 ngày

d Xác định khả năng chịu nhiệt của NS

Cấy chấm điểm NS nghiên cứu lên MT1, ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 25, 30,

35, 40, 45 và 50oC trong 3 ngày Đánh giá mức độ sinh trưởng KL dựa vào đường kính KL d (mm)

e Xác định khả năng chịu mặn của NS

- Chuẩn bị MT2 bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau: 2; 3; 5; 7; 10 và 20%

- Cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu lên MT với các nồng độ NaCl khác nhau

- Nuôi trong tủ ấm 3 ngày

- Đo đường kính KL d (mm) của các chủng NS nghiên cứu để đánh giá khả năng chịu mặn

- Mẫu đối chứng không có nước biển

f Xác định ảnh hưởng pH đến sự sinh trưởng NS

- Sử dụng MT1, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay HCl 10% để có các giá trị

pH khác nhau: 3; 4; 5; 6; 7; 8 Thanh trùng MT rồi cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày Đánh giá mức độ sinh trưởng dựa vào đường kính KL d (mm)

- Mẫu đối chứng có pH là 6,5

2.2.2.6 Xác định các yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh amylase của

NS

a Ảnh hưởng của các nguồn tinh bột

- Cấy NS nghiên cứu vào các loại MT xốp: MT9, MT10, MT11, MT12, MT13 Sau 3 ngày, thu dịch enzym thô, tiến hành đo OD để chọn loại MT thích hợp

- Từ MT đã chọn, tiến hành chọn tỉ lệ tinh bột thích hợp cho sự tổng hợp amylase

b Ảnh hưởng của các nguồn N

- Cấy các chủng NS nghiên cứu vào MT xốp có nguồn tinh bột tối ưu đã chọn

- Bổ sung vào MT xốp các nguồn N (tỉ lệ 0,5%) khác nhau: bột đậu nành, NaNO3, cao nấm men, cao thịt, pepton, (NH4)2SO4

- Sau 3 ngày nuôi cấy, thu dịch enzym thô, tiến hành đo OD để chọn MT có bổ sung nguồn N thích hợp

- Sau khi chọn được nguồn N thích hợp, tiến hành chọn tỉ lệ N tối ưu cho sự tổng hợp amylase của các chủng NS nghiên cứu Các tỉ lệ nghiên cứu: 0,5%, 1%, 2%, 3% và 5%

c Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh amylase của NS

- Cấy chủng NS nghiên cứu vào MT xốp thích hợp

- Xác định ảnh hưởng nhiệt độ khả năng sinh amylase các chủng NS ở các nhiệt

độ nuôi cấy từ 25, 30, 35, 40, 45 và 50oC

- Khảo sát khả năng sinh amylase bằng đo OD

d Ảnh hưởng của độ mặn MT đến khả năng sinh amylase của NS

- Nuôi cấy các chủng NS trên MT xốp có nguồn C và N tối ưu, với các nồng độ muối khác nhau NaCl 0, 2, 3, 5, 7 và 10%

- Ủ ở nhiệt độ tối ưu

e Ảnh hưởng của pH MT đến khả năng sinh amylase của NS

- Nuôi cấy các chủng NS ở những pH khác nhau 4 đến 8 (bước nhảy 0,5) để xác định ảnh hưởng pH đến khả năng sinh amylase của các chủng NS