Sử dụng MT cảm ứng có sẵn cơ chất tinh bột đặt tại RNM Cần Giờ trong 07 ngày rồi thu mẫu.
- MT cảm ứng có cơ chất tinh bột: Sử dụng 2 loại MT: MT11 và MT13; cân 15 g mẫu MT11 hay MT13 cho vào bình tam giác 250ml, hấp tiệt trùng rồi đặt tại các gốc cây, trên mặt đất, trên thân cây; số lượng bình cảm ứng: 02 bình mỗi loại/địa
điểm; 03 địa điểm/xã.
- Lấy mẫu: Sau 07 ngày, thu lại các bình tam giác chứa MT cảm ứng đã có các loại NS mọc trong đó; dùng que cấy lấy các sợi nấm trong mỗi bình, cấy chấm điểm vào đĩa petri đã có sẵn MT1.
Các bước ủ mẫu và làm thuần tiến hành tương tự phương pháp phân lập truyền thống.
- Quy ước chủng:
+ Chữ cái: vị trí xã đặt bình cơ chất cảm ứng. (LH: Long Hòa; LN: Lý Nhơn; A: An Thới Đông; T: Tam Thôn Hiệp; B: Bình Khánh).
+ Chữ cái kế tiếp: cơ chất cảm ứng sử dụng (KM: khoai mì; KMB: khoai mì và bắp).
+ Chữ số tiếp theo: số thứ tự chủng thu được từ bình cơ chất đặt tại xã nhất
2.2.1.2. Phương pháp giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khoáng (Lumiere và Chevrotier).
Chuẩn bị ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp. Dầu khoáng chứa trong ống eppendoff hấp vô trùng ở 121oC trong 2 giờ rồi sấy khô ở
170oC trong 1-2 giờ, để nguội. Dùng que cấy lấy một ít bào tử cho vào eppendoff chứa dầu khoáng vô trùng. Hàn kín eppendoff bằng paraffin, bảo quản ở nhiệt độ
4oC. Phương pháp này có thể bảo quản 1 -3 năm. 2.2.1.3. Phương pháp quan sát đại thể NS.
NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau:
- Cho vào ống nghiệm 5ml nước biển vô trùng, dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm, lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào giữa mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2, 3 hộp.
- Ủấm trong một tuần để tạo KL . Hàng ngày lấy ra quan sát. - Quan sát dưới kính lúp 3 chiều để mô tả các đặc điểm:
+ Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nó + Hình dạng KL
+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra.
+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL.
+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL,…
2.2.1.4. Phương pháp quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch (J. T. Dunean) Dunean)
- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri.
- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô trùng.
- Đặt 1 hay 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên bề mặt các khối thạch.
- Các phiến kính có khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẵn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp petri trong tủấm 3 – 4 ngày.
- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc nhuộm lactophenol, được tiêu bản thứ nhất.
- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên, được tiêu bản thứ hai.
- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm: * Hình dạng cuống sinh bào tử.
* Hình dạng thể bình * Hình dạng các thể bọng
* Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn * Đặc điểm bào tửđính (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Màu sắc, kích thước bào tử….
- Chụp hình trên kính hiển vi quang học ởđộ phóng đại 400 – 1000 lần.
2.2.1.5. Xác định hoạt tính enzym ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên thạch (William, 1983). khuếch tán trên thạch (William, 1983).