- Dựng đường chuẩn tinh bột.
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Tinh bột 10mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5
Dung dịch đệm 10 9 8 7 6 5
Nồng độ tinh bột (mg/ml) 0 1 2 3 4 5
+ Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 5ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lần.
+ Vẽđồ thị mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị ΔOD. -Phản ứng enzym. Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Tinh bột 1% (ml) 5 5 Dung dịch enzym (ml) 0,5 0 Đểổn nhiệt ở 50oC, 10 phút Dung dịch HCl 0,1N 5 5 Dung dịch enzym (ml) 0 0,5
* Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên. Thêm vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch I2KI đã pha loãng.
* Lắc đều đem đo OD tại bước sóng 560nm.
Công thức tính hoạt độα – amylase trong 1ml dịch enzym:
X * V * k Hoạt độ enzym (UI/g/phút) =
t * v * m
X: số tinh bột suy ra từđường chuẩn (mg) V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzym (ml) k: hệ số pha loãng
v: thể tích enzym cho vào hỗn hợp phản ứng enzym (ml) t: thời gian enzym phản ứng (phút)
m: khối lượng canh trường NS (g)
2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (theo Miller) a. Nguyên tắc a. Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo
đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức đến 100ml.
Dung dịch glucose mẫu (500μ/ml) cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1l.
c. Cách tiến hành
- Dựng đồ thị chuẩn glucose: Từ dung dịch glucose 500μ/ml chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 50 - 250 μg/ml
- Xây dựng đường chuẩn glucose
Nồng độ glucose (μg /ml) 0 50 100 150 200 250
Thể tích dung dịch glucose mẫu (ml) 0 10 20 30 40 50
Nước cất 100 90 80 70 60 50
+ Cho 0,5ml dung dịch glucose chuẩn vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5 ml thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ
phòng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 530nm với ống đối chứng là nước cất.
+ Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose.
+ Mẫu thí nghiệm: Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn.
+ Nồng độđường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng đường hóa.
- Dịch enzym được pha loãng thêm 10 lần.
Thử thật Thử không Tinh bột 1% (ml) 2 2 Nước cất (ml) 5 5 Đặt vào nồi cách thủy 30oC, 10 phút Dung dịch enzym (ml) 0.5 0 Khuấy nhẹ và giữở nồi cách thủy 30oC, 30 phút Dung dịch HCl 1N (ml) 0.5 0.5 Dung dịch enzym (ml) 0 0.5
- Hút 0,5ml dung dịch từ mỗi ống nghiệm trên vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5 ml thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ
phòng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 530nm với ống đối chứng là nước cất.
- Công thức tính: Một đơn vị hoạt độ tương ứng với 1μg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất tinh bột trong 30 phút ở nhiệt độ 30oC.
a * n * V Hoạt độ enzym (UI/g/phút) = t * v * m a: hàm lượng glucose (μg/ml) V: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml) n: hệ số pha loãng v: thể tích enzym ban đầu (ml) t: thời gian phản ứng (phút) m: khối lượng canh trưởng (g)
2.2.2.5. Xác định các yếu tốảnh hưởng đến sinh trưởng các chủng NS. a. Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng NS. a. Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng NS.
- Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa petri.
- Quan sát sự phát triển KL sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Đo đường kính KL mỗi ngày để xác định tốc độ sinh trưởng của KL.
Quy ước: d = 1 – 2mm: mọc yếu; d = 2,1 – 5mm: mọc trung bình; d = 5,5 – 10mm: mọc tốt; d = 11 – 30mm: mọc rất tốt.