Cấy bào tử NS vào bình tam giác và cân trọng lượng ban đầu bằng cân phân tích. Sau khi nuôi cấy 15 ngày, cân lại bình tam giác để biết được sinh khối NS.
2.2.1.8. Phương pháp định danh vi nấm bằng di truyền phân tử (PCR)
- Lấy mẫu nấm nuôi cấy một lượng khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendorf.
- Cho thêm 180μl TE1X và 20μl Prokprep rồi đem ủở 56oC qua đêm.
- Thêm 500μl Phenol Buffer và 500μl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi
ở 100oC trong 15 phút.
- Sấy nhẹ rồi thêm vào 250μl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 10 phút.
- Hút 450 μl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đó thêm vào 500μl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ - 20oC trong 1 đến 2 giờ.
- Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi.
- Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500μl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3 – 4 lần. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi.
- Hòa tan cặn DNA trong 50μl TE1X. Lấy 5μl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuận PCR nấm.
- Lấy 5μl DNA của vi nấm sau khi ly trích cho vào PCR mix.
- Phân tích kết quả: Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% hoặc điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer. Sản phẩm PCR có độ dài 260bp.
- Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và tiến hành giải trình tự trên hệ thống ABI 3130X hoặc CEQ 8000.
Sau khi có trình tự gen của NS nghiên cứu, tiến hành so sánh với trình tự
gen trong hệ thống ngân hàng gen của Mỹđể xác định chi và loài của chúng. 2.2.1.9. Phương pháp nuôi cấy NS trên MT xốp [41,42]
Cho vào mỗi bình tam giác (250ml) 15g MT xốp, hấp khử trùng.
Cho 10ml nước cất vào ống thạch nghiêng nuôi NS, hòa đều. Dùng que cấy, móc cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù.
Lấy 2ml dịch bào tử (khoảng 105 – 106 bào tử/1g MT). Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp.
2.2.2. Phương pháp hóa sinh.
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết dịch amylase thô từ canh trường nuôi cấy.
Sau thời gian nuôi cấy NS, dịch chiết enzym thô được tách chiết theo phương pháp sau:
Cho 100ml nước cất vào mỗi bình tam giác MT xốp đang nuôi NS. Lắc đều, giữ ở nhiệt độ 3 – 4oC, trong 30 – 45 phút để enzym khuếch tán. Sau đó, đem hỗn hợp lọc qua vải và ly tâm dịch lọc 5000 vòng/ phút trong 15 phút. Thu dịch ly tâm, rồi định mức 100ml. Ta thu được dịch enzym thô và đem xác định hoạt độ amylase.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ dịch hóa (Phương pháp Henkeil, 1956). 1956).
Amylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bột thành đường. Lượng tinh bột còn lại sẽ phản ứng màu với iod. Xác định lượng tinh bột bị thủy giải, từ đó tính ra hoạt độ amylase theo định nghĩa:
Hoạt độ amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thủy giải bởi 1ml dịch enzym (hay mg nguyên liệu chứa enzym) trong 1 phút ở điều kiện chuẩn 50oC, pH 6.
b. Hóa chất
Dung dịch NaH2PO4 0,05M Dung dịch Na2HPO4 0,05M
- Dung dịch đệm phosphate 0,05M pH6: trộn 87,7ml dung dịch NaH2PO4 0,05M và 12,3ml dung dịch Na2HPO4 0,05M, thêm 100ml nước cất, đo lại pH bằng máy
đo pH.
- Dung dịch tinh bột 1% pha trong pH 6: lấy 50ml dung dịch đệm phosphate 0,05M đem đun sôi. Cân 1g tinh bột tan, hòa vào một ít đệm, khuấy đều, đổ vào dung dịch đệm đang sôi, vừa khuấy vừa đun sôi trong 3 phút cho đến khi dung dịch trong suốt. Định mức đến 100ml bằng dung dịch đệm.
- Dung dịch iod: 1gI2 và 2gKI, thêm nước thành 100ml, bảo quản lạnh. Khi dùng pha loãng 500 lần.
- Dung dịch HCl 1N: 8,4ml HCl đậm đặc pha thành 100ml. - Dung dịch HCl 0.1N: pha loãng từ dung dịch HCl 1N.