KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC CHI ASPERGILLUS VÀ PENICILLIUM TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH

Nấm sợi hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm. Trong tự nhiên, nấm sợi phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Võ Thị Bích Viên

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ

CHỦNG NẤM SỢI THUỘC CHI ASPERGILLUS VÀ PENICILLIUM TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

LỜI CẢM M ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thanh Thủy đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Sở Giáo dục đào tạo tỉnh Khánh Hoà, Trường THPT Ngô Gia Tự - Khánh Hoà đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học

Tôi xin chân thành cám ơn Thầy Cô trong bộ môn Vi sinh, quý Thầy

Cô trong khoa Sinh học, cùng toàn thể quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy trong suốt khoá học

Tôi xin chân thành cám ơn phòng KHCN – SĐH Trường ĐH Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học

Tôi xin chân thành cám ơn những người thân trong gia đình, bạn bè

đã động viên và tạo mọi điều kiện thuân lợi cho tôi trong suốt thời gian qua Cuối cùng, tôi xin gởi lời cám ơn đến các bạn cùng khoá, các học viên SĐH Khóa 18 chuyên ngành Vi sinh vật đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tp Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2009

Võ Thị Bích Viên

MỞ ĐẦU

Nấm sợi hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm Trong tự nhiên, nấm sợi phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn

Ngoài ra, có rất nhiều loài nấm sợi được sử dụng rộng rải trong CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước chấm…), trong CN enzim (sản xuất amilaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối nấm sợi để phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng nấm sợi để xử lý ô nhiễm

MT [4]

Bên cạnh đó còn có nhiều loài nấm sợi ký sinh trên người, ĐV, TV gây ra nhiều bệnh khá nguy hiểm Nhiều nấm sợi sinh ra các độc tố nấm có thể gây ra bệnh ung thư và nhiều bệnh khác Nấm mốc còn có thể phát triển, sinh axít và làm

mờ các vật liệu vô cơ (thấu kính ở ống nhòm, kính hiển vi và một số dụng cụ quang học khác)

Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ nấm sợi đồng thời hạn chế các tác hại

do nấm sợi gây ra, con người đã tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến nấm sợi Trước đây, các nhà nghiên cứu thường tập trung tìm hiểu nấm sợi phân

bố ở đất liền Những năm gần đây, con người mới nhận thấy hết được tầm quan trọng của hệ sinh thái RNM - HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST Với điều kiện sinh thái của RNM con người có thể nghiên cứu khả năng chịu đựng

và phục hồi của các tổ hợp gen Có thể tìm ra được các chủng nấm sợi có hệ gen bền vững mang nhiều đặc tính có lợi cho con người

Nhiều loài thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân bố rộng rải trên rất

nhiều loại cơ chất tự nhiên, phổ biến khắp nơi trên trái đất Theo E Kister, M

Morelet (2000) thì ước tính số lượng loài hiện biết của chi Penicillium là khoảng

233 loài, chi Aspergillus khoảng 185 loài.[52] Sự phong phú và đa dạng trong

thành phần loài của chúng sẽ mang lại những lợi ích sinh thái và kinh tế vô cùng to

lớn Bên cạnh đó là những tác hại không nhỏ, cùng với những khó khăn trong công tác phân loại, hệ thống hai chi nấm này

Trong hệ sinh thái RNM Cần Giờ hai chi Aspergillus và Penicillium có vai

trò rất quan trọng, tham gia vào phân huỷ nhanh xác TV, ĐV, góp phần khép kín chu trình vật chất nhờ có khả năng sinh ra các enzim như cellulaza, proteaza, amilaza, kitinaza để phân giải các hợp chất hữu cơ trong MT Ngoài ra, nấm sợi còn có khả năng phân giải các hợp chất hydrocacbon giúp bảo vệ MT, nấm sợi còn

có khả năng sinh ra KS Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về phân loại,

ứng dụng của chi Aspergillus và Penicillium khá nhiều và chỉ tập trung trên đất

liền Rất hiếm có nghiên cứu về hai chi này trên biển hay RNM Cho đến nay, chưa

có một công trình khoa học chính thức có hệ thống về VSV, đặc biệt khu hệ nấm sợi ở RNM Việt Nam nói chung, RNM Cần Giờ nói riêng Để góp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt là khu hệ nấm sợi chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát đặc điểm sinh học một số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố

Hồ Chí Minh”

Mục tiêu của đề tài nhằm tìm hiểu tính đa dạng và vai trò của một số chủng

nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium ở RNM Cần Giờ Tp Hồ Chí Minh

Nhiệm vụ của đề tài

+ Phân lập các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium ở RNM

Cần Giờ

+ Khảo sát một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi phân lập được + Từ các chủng phân lập được tuyển chọn ra các chủng có các đặc điểm nổi bật Bước đầu nhận xét sơ bộ về đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi thuộc

chi Aspergillus và Penicillium

Đề tài được tiến hành từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 7 năm 2009 tại phòng thí nghiệm Sinh hoá – Vi sinh, khoa Sinh, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trên thế giới, RNM thường gặp ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam, RNM đã từng bao phủ diện tích khoảng 400,000 ha vào năm 1943 (Maurand, 1943) Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau như chiến tranh, chuyển đổi mục đích sử dụng, đốn củi, đã làm cho diện tích RNM ngày càng thu hẹp Hơn 60 năm qua, trên 80% diện tích RNM bị tàn phá hoặc suy giảm chất lượng (worldbank, 2003) Đặc biệt trong những năm 1995 trở lại đây, RNM bị thu hẹp một cách nhanh chóng nguyên nhân do con người đã phá RNM để nuôi

Thổ nhưỡng phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá và quá trình nhiễm mặn

Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm và chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa mưa nắng rõ rệt

Lượng mưa: thấp nhất TP Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng 6 và tháng 9.[35]

- Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt trong ngày từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35]

- Độ ẩm không khí: cao hơn các nơi khác trong TP Hồ Chí Minh, mùa mưa

độ ẩm từ 79 – 83%, mùa khô độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4 [36]

- Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn và hai lần nước ròng trong ngày Các tháng có đỉnh triều cực đại là tháng 10 và tháng 11, đỉnh triều thấp nhất là tháng 4 và tháng 5 [36]

- Độ mặn: trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực có thể lên đến 18% [13], lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém, nước mặn xâm nhập sâu vào tháng 4 và bị đẩy xa vào tháng 9 và tháng 10

* Khu hệ thực vật

Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng sú, ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá,

ráng, v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa v.v…;

các vườn cây ăn trái [34]

molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)…[34]

+ Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau.[35]

Phân vùng khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: Tổng diện tích Khu dự trữ sinh

quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139

ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha.[35]

* Khu hệ VSV

- Vi khuẩn

VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM

Là những SV phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong HST này Số lượng VK trong RNM chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát [34] Nhiều loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển

- Nấm

Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng Phần lớn là vi nấm, chỉ có một

số loài có kích thước lớn Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác lá TV (Fell và cộng sự 1975) Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai MT trở lên [33]

Ở Ấn Độ, muời loài nấm được phân lập từ lá RNM của Pichavaram là

Aspergillus flavus, A ochraceus, Alternaria alternata, A tenuissima, Rhizopus nigricans, Penicillum funiculosum, P expansum, Humicola fuscoatra, Mucor racemosa và Fusarium oxysporum Aspergillus và Penicillium chiếm số lượng rất

nhiều trong tất cả các lá RNM tiếp theo là các lọai Alternaria alternata và

Rhizopus nigricans (Sivakumar and Kathiresan, 1990) Số nấm đếm được trên lá

mục RNM nhiều hơn trên lá tươi [41]

Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn có các loài nấm ký sinh và hoại sinh

như: Ascomycetes, Bacidiomycetes và Deuteromycetes Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm có mặt trên lá cây Đước đỏ (R mangle): Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và Aureobacidium.[34]

Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh

cho các cây chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium, Nigrospora và Cercospora Hầu hết các loài nấm trên đất liền đều có trên lá cây ngập mặn, còn

các loài nấm biển thì có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển Các mẫu gỗ để ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao [34]

Nấm trong đất RNM có thể phân ra các loại nấm ở trong đất và loại nấm sống trên các mảnh vụn lá trên mặt đất Cả hai loại này đều phụ thuộc vào lượng chất hữu cơ có trên bề mặt và trong đất

Một vài loài, đặc biệt là Aspergillus candidus cho thấy khả năng tạo ra các

hợp chất phosphate tan từ các chất phosphorus không tan cho các SV khác sử dụng Vì vậy, những nấm này đóng vai trò tạo chất dinh dưỡng trong HST

(Prabhakaran et al., 1987) [41]

Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là SV phân huỷ đầu tiên, nhờ khả năng phân giải cellulose và lignin Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và cây con thường là nấm hoại sinh góp phần phân huỷ xác TV Chúng cũng góp phần phân huỷ cỏ biển, bùn và đầm lầy mặn [46]

Nấm đóng một vai trò rất quan trọng trong HST Cùng với VK, nấm là SV phân hủy chính ở hầu hết các HST Bởi vậy, nấm sợicó vai trò quan trọng các chu trình sinh địa hóa ở nhiều lưới thức ăn Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy những vật chất hữu cơ thành những phân tử vô cơ, rồi sau đó những chất này sẽ được đồng hóa ở TV hay những SV khác [46] Bản thân nấm sợi RNM

cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài ĐV nhỏ và ấu trùng của một

số loài (Odum, 1980; Alongi, 1989)

Tuy nhiên, các hoạt động sống của nấm sợi RNM lại làm giảm lượng oxi trong đất, bùn RNM do quá trình hô hấp, gây bệnh cho động thực vật hoặc thải vào

MT một số chất độc như amoniac, sunfuahidrô…[13]

VSV ở RNM ngoài VK và nấm sợi còn có nấm men, xạ khuẩn… chúng đóng vai trò hết sức quan trọng đối với chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM Có vai trò bảo vệ MT sinh thái RNM nói riêng và MT sinh thái nói chung, cũng như vai trò to lớn trong mối quan hệ sinh học giữa các loài SV Từ đó, đóng

góp vào việc giữ cân bằng cho HST đặc biệt này

 Vai trò của RNM đối với nền kinh tế

Một số loài TV ở RNM có thể xếp vào nhóm công dụng chủ yếu: 30 loài cây cho gỗ, than, củi, 14 loài cây cho tannin, 24 loài cây làm phân xanh, 21 loài cây dùng làm thuốc, 9 loài cây chủ thả kiến cánh đỏ, 21 loài cây cho mật nuôi ong, 1 loài cây cho nhựa để sản xuất nước giải khát [2]

Ngoài ra, RNM còn có nguồn tài nguyên ĐV phong phú như 9 loài lưỡng cư,

22 loài bò sát, 67 loài chim, 21 loài thú… SV ở nước phong phú gồm 64 loài cá thuộc 35 họ, 25 loài tôm, 66 loài TV phiêu sinh, 26 loài ĐV phiêu sinh và 22 loài

ĐV đáy [2]

Trong hệ sinh thái RNM, các loài động thực vật, VSV trong đất và MT tự nhiên được liên kết với nhau thông qua quá trình trao đổi và đồng hóa năng lượng Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngoài gồm nước, thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa RNM phát triển tốt nhất ở nước có nồng độ muối 15 - 25‰ [2]

 Vai trò của RNM đối với MT

Bên cạnh các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở và quá trình xâm thực bờ biển RNM cung cấp chất hữu cơ để tăng

năng suất cho vùng ven biển, là nơi sinh sản hoặc ươm nuôi của nhiều loài hải sản

có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,…

Mặt khác, RNM còn có tác dụng làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sóng khi triều cường Hạn chế tác hại của sóng thần và bão lớn, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ nước ngầm RNM bảo vệ

đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, làm sạch MT nước khi có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất.[4][18]

1.2 Sơ lược về nấm sợi

1.2.1 Phân loại của nấm sợi

Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng MT sống khác nhau, kể cả sa mạc Đa phần nấm sống ở trên cạn, nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở MT nước Nấm và VK là những SV phân huỷ chính, có vai trò quan trọng đối với các HST trên cạn Dựa theo tỉ lệ giữa số loài nấm với số loài TV ở trong cùng một MT, người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu loài [38]

Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống của giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota và Eumycota Eumycota bao gồm 5 ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina, Ascomycotina và Basidiomycotina [49]

Ngành phụ Deuteromycotina được chia theo 3 lớp: [50]

+ Khuẩn ty không phát triển hoặc phát triển yếu; dạng cơ thể giống như

nấm men và có sự nảy chồi: Blastomycetes

+ Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục hoặc sinh BT trên cuống,

không có sự tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT: Hyphomycetes

+ Khuẩn ty thật, BT tập trung trong túi BT hoặc trên cụm cuống BT:

Coelomycetes

Lớp Hyphomycetes được chia thành 3 bộ: Moniliales, Melanconiales và Sphaeropsidales Có thể tóm tắt phần phân loại nấm ở sơ đồ 1 (xem phần phụ lục 12)

Theo C J Alexopoulos (2002), nấm có 3 phần trong giới nấm, giới Stramenopila (một giới mới bao gồm các SV có cấu trúc lông roi được tách ra từ

protista) và giới Protista Giới nấm có 4 ngành: Chytridiomycota, Zygomycota,

Ascomycota, Basidiomycota Phần của nấm trong giới Stramenopila có 3 ngành: Oomycota, Hyphochytriomycota, Labryrinthulomycota Bốn ngành khác của nấm

được xem như là các SV nguyên sinh trong giới protista: Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota, Myxomycota Lý do của sự phân chia này là

từ những bằng chứng mới của các nghiên cứu về rRNA và hoá sinh học Các bằng

chứng chứng minh sự tồn tại của 3 nhóm nấm khác nhau Gần đây, sau khi hệ

thống phân loại giới xuất hiện, giới nấm được tái cấu trúc và sắp xếp lại Tất cả các

phần trong các giới khác nhau được tập hợp lại chỉ trong một giới nấm Các nhà nấm học phân chia giới này thành hai phần: nấm giả, bao gồm 7 ngành: Oomycota, Hyphochytridiomycota, Labyrinthulomycota, Plasmodiophoromycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota và Myxomycota và nấm thật là những phần

còn lại [49]

1.2.2 Hình thái và cấu tạo chung của nấm sợi

Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể chuyển động Có đường kính 1-30µm (thông thường là 5-10 µm)

Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón không tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần

ngọn của sợi nấm Phần này chất nguyên sinh không có nhân và chứa ít cơ quan tử

Tiếp đến là phần tăng trưởng chứa nhiều nhân, nhiều cơ quan tử và nhiều enzim Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và phân nhánh của sợi nấm Dưới nữa là phần thành cứng - phần thành thục của sợi nấm Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm (xem hình 1a) [4] [50]

Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ nhỏ,

trong nhân có hạch nhân (nucleolus) Trong tế bào nấm còn có ty thể

(mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle) , thể golgi [4], các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitô đường kính 40-

70nm(chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome) (xem hình 1b) [50]

Ribosome của nấm thuộc loại 80S (S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm 2 tiểu phần: tiểu phần lớn 60S và tiểu phần nhỏ 40S [51]

Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL Vì BT của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường có màu

Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn Ngược lại, các nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách ngăn (xem hình 2) Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có thể gọi là đơn bào Ở các nấm không vách ngăn thì vách ngăn vẫn có thể hình thành khi cơ thể sinh sản, tại các bộ phận bị thương tổn sợi nấm cũng có thể hình thành vách ngăn Đó là loại vách ngăn liền, không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ cơ thể [5]

(a) Cấu tạo của phần ngọn sợi nấm [51]

Hình 1.1: Cấu tạo phần ngọn và cấu trúc của sợi nấm

(b) Cấu trúc của sợi nấm [51]

Vách tế bào

Màng tế bào Nhân

Thể golgi Không bào

Ti thểLuới nội

Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đa bào Mỗi tế bào có 1 nhân hoặc nhiều nhân Tuy nhiên, sợi nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều tế bào

Vách ngăn ngang được hình thành từ thành tế bào Lúc đầu là một gờ nhỏ hình khuyên sao đó tiến dần vào trong và lấp kín lại Tuy nhiên, vách ngăn thường

có một hay nhiều lỗ thủng Các lỗ có kích thước bằng nhau hay có một lỗ lớn nhất

ở giữa và nhiều lỗ nhỏ ở xung quanh

Ngoài những đặc điểm chung thì nấm sợi RNM còn có những đặc trưng riêng đáng được quan tâm và cần có nhiều công trình nghiên cứu hơn nữa trên những đối tượng này bởi các lý do sau:

Ở MT sống khắc nghiệt, kiểu trao đổi chất của chúng sẽ khác biệt hơn so với các nấm ở đất liền Do đó, các sản phẩm trao đổi chất, đặc biệt là chất KS cũng mang tính chất khác lạ hơn [14]

Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của nấm sợi RNM Do đó, phần lớn các nấm sợi RNM đều có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm giúp chúng thích ứng với điều kiện sống Điển hình là khả năng sinh nhiều loại enzim, nhất là các ezim ngoại bào có chức năng phân giải xác động thực vật là thành phần hữu cơ chính của RNM, các chất KS và các độc tố giúp làm tăng khả năng ĐK của nấm sợi trong quá trình cạnh tranh ở MT sống Gần đây, người ta phát hiện ra nấm biển và nấm sợi RNM

là nguồn VSV có tiềm năng sinh các chất KS mới, chống lại các VSV nhờn thuốc

Sống trong MT biến động, MT chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền, ô nhiễm do tràn dầu…đã tạo cho các nấm sợi RNM có những cơ chế phản ứng lại

Hình 1.2: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không có vách ngăn

với những tác động này, bằng khả năng phân giải những chất thải độc hại nhờ sinh tổng hợp được hệ enzim phân giải

RNM là một HST chịu nhiều tác động của gió bão Sau những tác động trên, vấn đề ô nhiễm là điều không thể tránh khỏi, nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh [13] Nhờ có những đặc tính sinh học đáng quí như khả năng sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại Từ đó, có thể cải thiện MT sống cũng như giúp con người nâng cao khả năng điều trị bệnh tật

Đa số các nấm sợi RNM đều có khả năng chịu mặn cao Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ muối từ 2% - 20% Thậm chí, một số nấm sợi RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30% [13] Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM

Nấm sợi ở RNM có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con người Tuy nhiên, những nghiên cứu về nấm sợi RNM còn rất khiêm tốn, chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của chúng,

1.2.4 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM trên thế giới và Việt Nam

Hiện nay, có khoảng 800 – 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995; Jones, 1995), trong khi đó có một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại Sự hiểu biết của loài người về nấm RNM

và vai trò của chúng đối với khu HST này còn quá ít và chưa đầy đủ (Agate A.D., Subramania, C.V và Anuci, V.1998) Sự nghiên cứu về nấm RNM mới chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950

Theo cơ sở dữ liệu (chưa đầy đủ) của mạng nấm RNM toàn cầu có thể thấy nhiều nước đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hoá các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ Cụ thể: Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông: 170 loài, Đài Loan: 7 loài, Trung Quốc: 2 loài, Singapore: 116 loài, Nhật:

26 loài, Úc: 67 loài, Mỹ: 18 loài, Malaysia: 164 loài, Indonesia: 7 loài, Thái Lan:

83 loài, Brasil: 48 loài, Mexico: 94 loài, Kuwait: 14 loài, Đức: 4 loài Qua đó, có

thể thấy phân loại nấm biển RNM còn rất ít và chưa đáp ứng đủ yêu cầu cấp bách cho sự tiến bộ của ngành VSV học [51]

Năm 1988, Agate A.D., Subramania C.V và Vanuci M., đã nêu ra tám lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV học RNM cần các nhà khoa học giải quyết Trong đó, có lĩnh vực phân loại và hệ thống hoá cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới

Năm 1979, Kohlmeyer là người đầu tiên đánh giá vai trò quan trọng của các nấm đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM Đã nhận

dạng được 43 loài nấm bậc cao, bao gồm 23 loài Ascomycetes, 17 loài Deuteromycetes và 3 loài Basidiomycetes

Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới Trong đó,

bao gồm 87 loài Ascomycetes, 31 loài Deuteromycetes và 2 loài Basidiomycetes

Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra một số lượng lớn loài mới, thậm chí là chi mới Bộ sưu tập nấm RNM ở Macau và Hồng Kông tìm được 45 loài mới, 28 loài trong số mới này tìm được ở Macau và 21 loài được tìm thấy ở Hồng Kông (Vrijmoed et al., 1994)

Năm 1990, Sivakumar và Kathiresan đã phân lập được 10 loài nấm từ bề mặt lá của 7 loài cây ngập mặn Trong số đó, loài chiếm ưu thế trên bề mặt lá là

các loài Alternaria alternate, Rhizopus nigricans, Aspergillus spp.[41]

Một số nấm sợi còn có hoạt tính diệt côn trùng mạnh, có thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm diệt côn trùng một cách an toàn Đây là một nguồn gen quí, rất

có giá trị đối với sinh học và y học (theo Mai Thị Hằng và cộng sự) [11]

Theo nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) đã phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có hoạt tính cellulaza cao, có khả năng đường hoá giấy in, giấy báo cũ, chuyển hoá nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho cây trồng Với đặc tính này nấm sợi góp phần phân giải xác TV ở RNM Cần Giờ [1]

Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thanh Thuý (2007) đã tuyển chọn được các chủng nấm sợi có khả năng phân giải dầu, góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu, xử lý ô nhiễm MT dầu ngày nay.[30]

Nấm sợi RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống với việc phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng [13] Bên cạnh vai trò làm sạch MT sống nói chung, nấm sợi RNM còn có vai trò làm sạch MT sinh vật với chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái

Ngoài ra, nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) đã tuyển chọn được các chủng có hoạt tính ĐK với VSV gây bệnh, hoạt tính phân giải phốt phát khó tan, lại thêm hoạt tính chịu mặn Điều này, có ý nghĩa hết sức quan trọng trong chu trình photpho của RNM Cần Giờ [27]

1.3 Đặc điểm của Aspergillus

1.3.1 Vị trí phân loại của chi Aspergillus trong các hệ thống phân loại nấm

- Năm 1729 P A Micheli lần đầu tiên mô tả chi Aspergillus (Maren A

Klich, 2002)

- Năm 1900, Lindau lại xếp Aspergillus vào trật tự:

Lớp (Class) : Fungi imperfect

Bộ (Order): Hyphomycetes

Họ (Family): Mucedinaceae

Họ phụ (Subfamily): Aspergillaceae

Chi (Genus): Aspergillus

- Năm 1950, Bessey đã xếp Aspergillus vào hai lớp khác nhau:

Lớp 1 (Class): Ascomycetes Lớp 2 (Class): Ascomycetes

Bộ (Order): Aspergillaces Bộ (Order): Moniliales (Hyphomycetes)

Họ (Family): Aspergillaceae Họ (Family): Moniliaceae

Chi (Genus): Eurotium Chi (Genus): Aspergillus

- Năm 1962, Alexopoulos trong cuốn “Introductory Mycology” đã xếp Aspergillus vào hai lớp: Ascomycetes (khi người ta tìm thấy hình thức sinh sản của

nó) và vào Form class: Deuteromycetes (ở trường hợp ngược lại)

Lớp (Class) : Ascomycetes Lớp (Class) : Deuteromycetes Dưới lớp (Subclass) : Euroascomycetidae Bộ (Order) : Moniliales

(series: Plectomycetes ) Họ (Family) : Moniliaceae

Bộ (Order): Eurotiales Chi (Genus) : Aspergillus

Họ (Family) : Eurotiaceae

Chi (Genus) : Eurotium, Sartorya,

Emerycella (hình thức vô tính Aspergillus )

- Năm 1973, Ainsworth đã xếp Aspergillus thuộc tổ chi Phialoconidiae lớp

Hyphomycetes, ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina [51]

- Năm 1977, Bùi Xuân Đồng căn cứ vào đặc điểm hình thái phát sinh BTT

của Deuteromycota đã xếp chi Aspergillus vào tổ chi Phialocolidiae, lớp phụ

Euhiphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Nấm bất toàn (Deuteromycotina) (Bùi Xuân Đồng, 2001 )

- Năm 2000, Robert K Noyd, lại xếp Aspergillus thuộc họ Monilaceae, bộ

Moniliales, lớp Hyphomycetes, ngành Deuteromycota [50]

1.3.2 Hình thái của Aspegillus

Chi Aspergillus Micheli ex Fries đặc trưng bởi những đặc điểm sau:

Hệ sợi nấm gồm các sợi vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất định của KL

Sinh sản vô tính bằng BTT (conidia) Hình thái cơ quan sinh BTT là một đặc điểm chủ yếu đặc trưng dùng trong phân loại chi này

Đặc điểm của cơ quan sinh BTT:

Hình 1.3: Hệ bào tử trần của chi Aspergillus

A- Bọng; B- Bộ cuống đính BT đầu tiên; C- Bộ cuống đính BT thứ hai;

D- Bào tử trần; E- Sợi cuống; F- Tế bào gốc ( Nguyễn Đức Lượng- Thí nghiệm VSV học)

Bộ máy mang BTT phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của sợi nấm (tế bào chân – foot cell) Gíá BTT phát triển

từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm, gần thẳng gốc với trục của tế bào

chân và thường ở trên mặt cơ chất (Hình1.3) Giá BTT không có nhánh, không có hoặc có ít vách ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy ( Hình 1.4k), hình quả bầu (Hình 1.4b ,d, g), hình bàn trang (phần đỉnh bọng giá thẳng-Hình 1.4a, c, e) hình nửa cầu (Hình 1.4l, m…) hoặc hình cầu (Hình 1.4q), bọng này mang các

thể bình Các thể bình này hoặc song song và hợp thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt bọng [6]

Thể bình hoặc chỉ có một tầng hoặc hai tầng Trong trường hợp sau, mỗi thể bình cấp một (cũng gọi là cuống thể bình, metula) mang một cụm gồm hai hoặc ba (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp hai (gọi là thể bình) ở phần đỉnh Các BTT được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng góc (BT ở ngay

Hình 1.4: Bọng đỉnh giá mang thể bình hoặc mang cả cuống thể bình và thể bình ở một số

loài thuộc chi Aspergillus Mich Ex Fr. [6]

a- A conicus Blochw; b- A clavatus Desm; c- A nidulans (Eid); d- A fumigatus Fres; e- A

sersicolor (Vuill); g- A.malinus Lindt; h- A.sydowi (Bain.et Sart) Thom et Church; i- A.niveus Blochw; k- A.vảaans Wehm; l- A.glaucus Link; ; m- A.citrispóu Hohn; n- A.terreus Thom; o- luchuensis Inui; p- A ustus (Bain) Thom et Church, q- A.sulphureus (Fres) Thon et Church ( M.A.Litimov 1967)

miệng thể bình là BT non nhất, càng xa miệng thể bình càng già), không phân nhánh.[6]

BTT không vách ngăn, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết

ở mặt ngoài (nhẵn, có gai, có nốt sần) tuỳ từng loài Tất cả các chuỗi BTT tạo thành từ các thể bình của một bọng đỉnh giá hợp thành khối BTT đỉnh bọng – bông nấm (conidial head) Khối BTT đỉnh bọng có thể có các dạng hình cột (các chuỗi BTT song song, sát nhau), hình cầu hoặc hình tia toả tròn Một số loài có BT túi (ascosporum) trong các thể quả kín (cleitothecium) [6]

1.3.3 Các chất có hoạt tính sinh học của Aspegillus

Nhiều loài thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rải trên các cơ chất tự nhiên,

trong các sản phẩm công nông nghệp, ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới

Một số loài, đặc biệt là A oryzae đã được dùng rộng rãi trong công nghệ lên men

truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như Việt Nam (làm tương), Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Philipin…

Hiện nay, công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các loài A niger, A oryzae trong CN sản xuất enzym (amylaza,

glucoamylaza, pectinaza, proteaza, cellulaza), trong CN chế biến thực phẩm, CN sản xuất acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic.[6]

Nhiều loài thuộc chi nấm này có hoạt tính biến đổi sinh học, một số loài tạo thành độc tố (mycotoxin), đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các độc tố gây

ung thư gan như các loài A flavus, A parasiticus tạo thành aflatoxin, A versicolor

để khử lông da súc vật Thu nhận và sử dụng pectinaza, amylaza từ A niger để xử

lý dược liệu nguồn gốc từ TV Nghiên cứu sử dụng một số chủng thuộc loài A niger để nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi Nghiên cứu khả năng sinh tổng

hợp acid citric của một số chủng lựa chọn của loài A niger Nghiên cứu lựa chọn được chủng A niger TH3-19K của Nhật Bản có hoạt tính glucoamylaza cao dùng

để phân huỷ tinh bột sống Nghiên cứu hoạt tính phân giải phosphat khó tan và

cellulose của A japonicus, khả năng phân giải cellulose của một chủng ưu nhiệt thuộc loài A unilateralis Nghiên cứu hệ vi nấm ĐK với các VK kháng KS ở Việt Nam, trong đó có 14 loài thuộc chi Aspergillus có hoạt tính này [6]

Như vậy, các nhóm loài được nghiên cứu trong công nghệ sinh học chủ yếu

là nhóm loài A fumigatus, A flavus, A niger.[6]

1.4 Đặc điểm của Penicillium

1.4.1 Vị trí phân loại của Penicillium trong các hệ thống phân loại nấm

Chi Penicillium do Link mô tả đầu tiên năm 1809 với 3 loài: P camdidum,

P expansum và P glaucum Vị trí phân loại của Penicillium được thay đổi theo

tiến trình lịch sử như sau:

- Theo hệ thống phân loại hình thái của Saccardo, năm 1886 :

Chi (Genus): Penicillium

- Năm 1953 Hughes xếp Penicillium vào tổ chi VI (Section VI), nhóm

Hyphomycetes trong hệ thống phân loại nhóm Hyphomycetes.[6]

- Năm 1972, 1977 Bùi Xuân Đồng xếp Pencillium theo hệ thống sau:

Ngành (Division): Mycota

Ngành phụ (Sub-Division): Deuteromycotina Lớp (Class): Hyphomycetes

Lớp phụ (Sub-Class): Euhyphomycetidae

Tổ chi (Section): Phialoconidiae

Chi (Genus): Penicillim [6]

-Theo hệ thống phân loại của G C Ainsworth, năm 1973:

Ngành (Phylum): Eumycota (Eumycetes)

Ngành phụ (Subdivision): Deuteromycotina Lớp (Class): Hyphomycetes

Bộ (Order): Moniliales

Họ (Family): Moniliaceae

Chi (Genus): Penicillium [46]

- Gần đây nhất, Robert K Noyd (2000) lại xếp Penicillium vào trật tự như sau:

Ngành (Division): Deuteromycota Lớp (Class): Hyphomycetes

Bộ (Order): Moniliales

Họ (Family): Moniliaceae

Chi (Genus) :Penicillium

1.4.2 Hình thái của chi Penicillium

Chi Penicillium được đặc trưng bởi các đặc điểm sau:

Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu sẫm [6][19]

KL màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng Mặt trái KL không màu hoặc có màu sắc khác nhau, MT thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu do có mặt của các sắc tố hoà tan tương ứng KL có hoặc không có vết khứa xuyên tâm hay đồng tâm, có hoặc không có các giọt tiết [6]

Sinh sản vô tính bằng BTT với cấu tạo như sau:

* Bộ máy mang BTT ( còn gọi là chổi – penicillus) hoặc chỉ gồm một giá

BTT với một vòng thể bình ở đỉnh giá (cấu tạo một vòng, monoverticillate – hình 5a), hoặc gồm giá BBT với hai đến nhiều cuống thể bình (metulae) ở phần ngọn

giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đĩ cĩ các thể bình (cấu tạo hai vịng,

biverticillate).[6]

* Trường hợp các giá BTT mang một hoặc nhiều nhánh (branch) ở phần ngọn giá, sau đĩ các nhánh mang các cuống thể bình và các cuống thể bình lại

mang các thể bình cũng được coi là cấu tạo hai vịng (Hình 1.5b)

Khi các cuống thể bình xếp đều đặn và sát nhau trên ngọn giá, cấu tạo hai vịng đĩ được gọi là cấu tạo hai vịng đối xứng, trường hợp các cuống thể bình xếp

khơng đều trên phần ngọn giá hoặc cĩ nhánh, cấu tạo này được gọi là cấu tạo hai vịng khơng đối xứng.[6]

* Trường hợp giá BTT mang nhiều nhánh và các nhánh này cùng với các

cuống thể bình, các thể bình xếp đều đặn và sát nhau, bộ máy mang BTT cĩ cấu tạo nhiều vịng (polyverticillate)

Giá BTT cĩ thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt MT thạch nuơi cấy (các sợi nền), khi đĩ thường cĩ chiều dài đều nhau, và KL cĩ dạng mặt nhung Giá BTT cĩ thể là nhánh của các sợi nấm khí sinh, KL trong trường hợp này cĩ dạng len hoặc xốp bơng (lanate, floccose) Trường hợp các giá BTT là các nhánh của các bĩ sợi hoặc bản thân chúng tụ họp lại với nhau thành các bĩ giá, KL đặc trưng bởi sự cĩ mặt của các bĩ sợi (funiculose) hoặc của các bĩ giá (fasciculase).[6]

Nhánh

Hình 1.5: Chi Penicillium Link ex Pries Các thành phần của chổi [7]

* Tế bào sinh BTT của các loài thuộc chi Penicillium là các thể bình Thể

bình ở nhiều loài của chi nấm này có phần đỉnh ngắn và thon nhỏ dần, phần đỉnh này thường có đường kính vào khoảng một phần ba đường kính của phần thân

Một số loài thuộc nhóm loài Biverticillata-Symmertrica có thể bình hình mũi dáo (thể bình có hình mũi dài và thon nhỏ dần) (Hình 1.6).[6]

* BTT của các loài thuộc chi Penicillium thuộc típ phialoconidi (típ cơ

bản euconidi), không có vách ngăn, hình cầu, gần cầu, hình trứng, elip, đôi khi hình trụ Khi riêng rẽ, các BTT không màu hoặc màu nhạt, khi tụ họp thành đám thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám Các BTT này tạo thành chuỗi dài trên miệng thể bình.[6]

* BTT cũng như giá BTT, các nhánh, các cuống thể bình, các thể bình tuỳ

từng loại có mặt ngoài nhăn, ráp, có gai hoặc sần sùi, gồ ghề.(Hình 5,6)

Một số ít loài tạo thành hạch nấm (sclerotium) Hạch nấm cấu tạo bởi các tế bào có vách dày, có thể rất cứng hoặc mềm, hình cầu, gần cầu, không màu hoặc có màu sắc khác nhau, đơn độc hoặc thành cụm Một số loài có BT túi (ascosporum) Thể quả túi là những thể quả kín (cleisthothecium), có vỏ thể quả cứng hoặc mềm,

có hoặc không có các sợi nấm bao quanh, thể sinh túi cuộn xoắn hoặc thẳng, túi

Hình 1.6: Chi Penicillium Link ex Fries Các kiểu thể bình

a- Thể bình có phần cổ rộng ở P expansum Link và nhiều loài, b- Thể bình có phần cổ hẹp ở P

janthinellum Biourge và các loài lân cận, c- Thể bình hình mác ở P funicolusum Thom và một số loài

thuộc nhóm loài Biverticillata-Symmetrica (Raper và Thom, 1949)

BT (ascus) đơn độc hoặc thành chuỗi, BT túi không ngăn vách, có hoặc không có rãnh và gờ quĩ đạo.[6]

1.4.3 Các chất có hoạt tính sinh học của Penicillium

Nhiều loài thuộc chi Penicillium được dùng trong công nghệ KS Trong

CN sản xuất KS hiện nay, một số chủng đã xử lý đột biến của P chrysogenum có

thể dùng để sản xuất penicillin tự nhiên (penicillin G, penicillin V…) và axit 6- aminopenycillamic (dùng để sản xuất các penicillin bán tổng hợp như ampicillin, oxacillin…).[6]

Ngoài ra một số loài khác thuộc chi Pencillium được dùng trong CN chế biến thực phẩm như CN sản xuất phomat (P roqueforti) Nhiều loài cũng đã được

nghiên cứu khà năng tạo thành các axit hữu cơ, về các hoạt tính enzim và một số sản phẩm trao đổi chất khác.[6]

Trong chi Penicillium cần lưu ý môt số loài có khả năng tạo thành

mycotoxin, đặc biệt các mycotoxin có khả năng gây ung thư gan như các loài

P.islandicum tạo thành độc tố islandotoxin và luteoskyrin, loài P.urticae tạo thành

patulin… [6]

Aspergillus và Penicillium có vai trò to lớn trong thiên nhiên cũng như đối

với đời sống con người Việc nghiên cứu về hai chi này góp phần đánh giá sự đa dạng về về thành phần loài và số lượng loài Đồng thời, góp phần quan trọng trong việc xác định các loài có khả năng sinh các chất sinh học quý như KS, enzim và các chất hoạt tính sinh học khác

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Các mẫu lá vàng, lá mục, cành khô, cành mục, đất, đất sâu từ các xã Lý

Nhơn, An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp, Long Hoà, thuộc Huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh

Các VSVKĐ gồm: Escherichia coli, Bacillus subtilis do viện Pasteur Tp

- Kính hiển vi quang học, máy chụp hình kỷ thuật số Olympus 5.1 (Nhật)

- Máy đo pH Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc)

- Máy GPF – định vị vệ tinh toàn cầu (Nhật)

MT2: MT Czapek – Dox: Nuôi cấy, giữ giống nấm sợi, thử hoạt tính enzym

ngoại bào (amilaza, proteaza, xenlulaza) [10]

MT3: Meat peptone agar (MPA): Dùng để nuôi cấy giữ giống VSVKĐ

[10]

Pepton 5g

Cao thịt 5g Agar 20g Nước cất 1000ml, pH = 7,5

MT4: Malt Extract Agar (MEA): Dùng để phân loại nấm sợi Khi nuôi nấm

sợi để thử hoạt tính KS thì MT này sẽ thay nước biển bởi nước cất với lượng tương đương

2.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Chúng tôi phân lập các chủng nấm sợi từ các mẫu lá vàng trên cành (Ký hiệu là L), lá mục (LM), cành khô (CK), cành mục (CM), đất mặt (Đ), đất sâu 5 –

10cm (ĐS) từ RNM Cần Giờ

Tiến hành thu mẫu 3 đợt vào tháng 9, tháng 12 năm 2008 và tháng 3 năm

2009 tại 4 xã Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh

Cách lấy: Dùng dao kéo vô trùng cắt khoảng 10 g mẫu cho vào túi nilon vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm, ngày tháng lấy mẫu Các mẫu được bảo quản lạnh và phân lập ngay không quá 24 giờ.[6] [37]

2.2.1.2 Phân lập nấm sợi theo phương pháp pha loãng mẫu (theo F

Uyenco (1988))

a Nguyên tắc

Tách rời các BT nấm sợi Nuôi cấy các BT trên MT dinh dưỡng đặc trưng

để cho KL riêng rẽ, cách biệt nhau Cấy chuyền một hoặc vài lần có thể thuần khiết được chủng nấm sợi

b Tiến hành

Cân 10g đất, lá, thân (đã nghiền nhỏ) cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Sau đó đưa vào máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút, thu được dịch lọc có độ pha loãng 10-1

Lắc đều rồi hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển

vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2 Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6

Nhỏ 0,1ml (2giọt) dung dịch ở mỗi nồng độ lên hộp petri có chứa môi trường (MT2) Dùng que trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục sang đĩa MT 2 và 3 Sau đó, ủ các đĩa ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày

Tách các KL riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết Cuối cùng, cấy giống sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của nấm sợi.[32] [43]

c Yêu cầu

Các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết

2.2.1.3 Giữ giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng

a Nguyên tắc: Bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của

giống Tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển

2.2.1.4 Quan sát hình thái nấm sợi

* Quan sát đại thể nấm sợi

Nấm sợi sau khi cấy chuyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau:

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng

- Dùng que cấy lấy một ít BT từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri Làm 2, 3 hộp Lưu ý không để điểm chấm loang trên mặt thạch

- Ủ ấm trong 1 tuần lễ để tạo KL Hàng ngày lấy ra quan sát

Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:

+ Hình dạng, kích thước KL

+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc

+ Màu sắc của MT do sắc tố nấm sợi tạo ra

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT

+ Đặc điểm của mép KL

+ Giọt nước đọng, mùi, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL …[5]

* Quan sát vi thể nấm sợi bằng phương pháp làm phòng ẩm nuôi cấy nấm

của J.T.Dunean

Chuẩn bị MT thích hợp (MEA, YEA), đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri Khi thạch đã đông thì dùng dao vô trùng cắt từng mẫu hình vuông, diện tích 1cm2

Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông (hoặc giấy thấm) nước

vô trùng

Đặt khối thạch lên phiến kính Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh khối thạch Đậy lá kính lại và cho vào hộp petri có sẵn bông (hoặc giấy thấm) được làm

ẩm bằng nước cất vô trùng Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày, ở 270C

Sau 3-4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính

lên trên ta được tiêu bản để quan sát hình thái nấm sợi Quan sát dưới vật kính 40,

100 các đặc điểm:

+ Giá BTT, thể bình và cuống thể bình

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn

+ Màu sắc, hình dạng BT, có gai hay không có gai

Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần.[5] [6]

2.2.1.5 Kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch [5] [32]

a Nguyên tắc

Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm sợi phân huỷ sẽ không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh KL

b Thực hiện

* Phương pháp cấy chấm điểm

Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp

Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp petri) lên MT thử hoạt tính tương ứng (MT2)

Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 280C – 300C, trong 4-5 ngày

c Kiểm tra kết quả

Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng:

+ Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10% HgCl2 lên bề mặt MT nuôi cấy, nếu nấm sợi sinh ra proteaza sẽ có một vòng trong suốt quanh

KL (cấy chấm điểm) do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2 Các phân tử protein chưa bị phân giải có màu trắng đục

+ Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase Cả hai loại enzym này đều dùng

thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch:

* Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt

* Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm

d Đánh giá khả năng tạo enzym

Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d) (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh

(D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu

2.2.1.6 Kiểm tra khả năng ĐK của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch [5]

a Nguyên tắc

Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất ĐK thì chúng sẽ

ức chế và tiêu diệt các VSVKĐ và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch

c Kiểm tra kết quả

Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d) (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh

(D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu

2.2.1.7 Kiểm tra khả năng chịu mặn của nấm sợi [6]

a Nguyên tắc

Mỗi loài nấm sợi thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng

độ muối nó thể hiện các hoạt tính khác nhau

b Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị MT YEA (MT1), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%

Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các MT nghiên cứu

Xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản

- Phương pháp tính giá trị trung bình

 : Giá trị trung bình n lần thí nghiệm

tα tra bảng phân phối student với n –1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng hai phía

Sn+2(X) là phương sai mẫu

Sn+2(X) = 1/(n-1)∑ (Xi - )2

a =  ± tα S + 2n (X)

√n

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Quá trình lấy mẫu được tiến hành ở 4 xã: Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp thuộc Huyện Cần Giờ Các vị trí lấy mẫu được thể hiện trên bản đồ hình 3.1

* Lý Nhơn 10033’34.45’’N

106049’18.13’’E

* Long Hoà 10029’37.11’’N

106052’07.45’’E

Qua 3 đợt lấy mẫu chúng tôi phân lập được 476 chủng nấm sợi Trong đó,

đợt 1 phân lập được 129 chủng (chiếm 27,10%) , đợt 2 được 191 chủng (40,13%), đợt 3 được 156 chủng (32,77%)

Sau đó, chúng tôi tiếp tục phân loại để tuyển chọn các chủng nấm sợi thuộc

hai chi Aspergillus và Penicillium Dựa vào đặc điểm khoá phân loại đến chi của

các tác giả Robert A Samson, Allen S Heekstra, Jens C Frisvad (2004) và Bùi Xuân Đồng (năm 2000) Chúng tôi xếp các chủng vi nấm có đặc điểm như trong

bảng 3.1 vào hai chi Aspergillus và Penicillium

Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại tương ứng để xác định các chủng vi nấm

đến chi Aspergillus và chi Penicillium [6]

Một số đặc điểm chi Aspergillus Một số đặc điểm chi Penicillium

- Khuẩn lạc màu lục xám, xanh

xám, xám, luc, lục vàng, lục nâu,

nâu đen, trắng, vàng

- Sợi nấm có vách ngăn, phân

nhánh, không màu hoặc màu nhạt

- Bộ máy mang BTT không

nhánh

- Giá BTT phát triển từ tế bào

chân, không có hoặc có ít vách

- BTT không có vách, hình cầu, gần cầu, hình trứng, elíp đôi khi hình trụ, không màu hoặc màu nhạt; mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc sần sùi

3.1 Kết quả phân lập các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium

Từ 476 chủng nấm sợi chúng tôi tiến hành phân loại và tuyển chọn được

266 chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium Trong đó có 98 chủng

(chiếm 36,84%) Aspergillus và 168 chủng (chiếm 63,16%) Penicillium Vì số

lượng chủng lớn nên chúng tôi xếp thành nhóm các chủng có chung màu sắc và hình thái KL

3.1.1 Kết quả phân lập đợt 1

Đợt 1 chúng tôi phân lập và tuyển chọn được 77 chủng nấm sợi Trong đó,

có 32/77 chủng (chiếm 41,56%) Aspergillus và 45/77 chủng (chiếm 58,44%) Penicillium Đặc điểm các chủng nấm sợi được thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3

Hình 3.2: Cấu tạo đại thể và vi thể của chủng LM15A

Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Khuẩn ty và cuống sinh bào tử, d- Giá bào tử trần và bào tử trần

Bảng 3.2: Đặc điểm các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus (đợt1)

- Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, màu nhạt Giá BTT có bọng hình chuỳ, BTT hình cầu màu lục

7

LM16A, CK4A,

Đ25A, Đ29A, ĐS3A

- KL màu lục vàng, mép hình tia Hệ sợi mọc thưa thớt Mặt dưới không màu Không tiết sắc

tố

- Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, không màu Bọng đỉnh giá hình cầu, chỉ mang thể bình Các thể bình xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ mặt bọng BTT hình cầu, ráp, màu lục

3

CM2A, CM26A,

CK2A - KL màu trắng, mép xẻ thuỳ, mặt dạng bông xốp, mặt dưới màu trắng Không tiết sắc tố

- Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn Bọng đỉnh giá nhỏ, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu màu rêu nhạt

5

LM2A, LM9A,

CM3A, Đ9A, Đ28A - KL có màu nâu đen, hệ sợi màu trắng, mặt dạng xốp Không tiết sắc tố

- Sợi nấm không màu, phân nhánh, có vách ngăn Giá BTT nhẵn Bọng đỉnh giá hình cầu, thể bình một tầng, BTT hình cầu, gồ ghề, màu nâu

(Ghi chú: Hình cấu tạo đại thể và vi thể của các chủng được trình bày ở phu lục 2)

Bảng 3.3: Đặc điểm các chủng nấm sợi thuộc chi Penicillium (đợt1)

STT Ký hiệu chủng Đặc điểm

3

LM1P, CK6P, CM19P - KL màu trắng ngà, mặt dạng nhung, mặt

dưới không màu Không tiết sắc tố

- Sợi nấm có vách, phân nhánh Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình, BTT hình cầu, màu luc nhạt

- Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, sợi không màu Cuống mang BTT phân nhánh, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu màu lục, xù xì

- Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm màu lục Giá BTT phân nhánh hoặc không phân nhánh, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu, gồ ghề, màu lục nhat

- Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh Giá mang BTT có cuống thể bình và thể bình BTT mọc thành cột song song, hình cầu, gồ ghề, màu lục

2

LM24P, CK8P KL màu lục xám, mép màu trắng xốp bông

ít Mặt dạng nhung, mặt dưới màu trắng xám Không tiết sắc tố Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh Giá BTT có nhánh, thể bình một tầng, BTT hình cầu, màu xanh lục,gồ ghề

4

CM27P, CM30P, CM32P,

ĐS7P - KL màu vàng lục, mép màu trắng Mặt dạng nhung, xốp ít, có các vòng tròn đồng

tâm Không tiết sắc tố

- Hệ sợi có vách, phân nhánh, không màu Giá BTT không phân nhánh, mang thể bình BTT hình cầu, màu lục nhạt

3

CM41P, ĐS9P, L7P - KL màu vàng nhạt ở vùng trung tâm, mép

hinh tia do hệ sợi mảnh Mặt dạng nhung, xốp ít Mặt dưới màu vàng nhạt Không tiết sắc tố

- Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình BTT hình êlíp, màu lục

2

ĐS13P, ĐS11P - KL màu lục xám, vùng trung tâm màu vàng

nhạt, mép màu trắng Mặt dạng xốp bông ít Không tiết sắc tố

- Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình BTT hình cầu, màu lục

(Ghi chú: Hình cấu tạo đại thể và vi thể của các chủng được trình bày ở phu lục 3)

Theo kết quả thu được chúng tôi nhận thấy KL của các chủng thuộc

Aspergillus chủ yếu có màu lục vàng, màu xanh lá mạ, màu nâu đen Penicillium

KL màu lục, lục xám chiếm số lượng nhiều

Sau khi mô tả đặc điểm phân loại các chủng nấm sợi đến chi, chúng tôi tiến hành xác đinh sự phân bố các chủng nấm sợi đã phân lập được Sự phân bố các

chủng thuộc Aspergillus và Penicillium được tóm tắt ở bảng 3.4

Hình 3.3: Cấu tạo đại thể và vi thể của chủng CM5P

Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Khuẩn ty, d- Giá bào tử trần và bào tử trần