Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn cần giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH - Nguyễn Thị Hà TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CAO Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận văn công trình nghiên cứu khoa học - Các kết trình bày luận án trung thực chưa công bố Tác giả luận văn LỜI CÁM ƠN Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy giảng viên khoa sinh học trường Đại học su phạm TP HCM, người định hướng đề tài cho tôi, quan tâm, giúp đỡ thông cảm cho hoàn cảnh Người truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi, nhiệt tình hướng dẫn trình thực đề tài Tôi xin chân thành cám ơn TS Dương Thị Hương Giang giảng viên giảng dạy môn Enzyme học, viện công nghệ sinh học trường Đại học Cần Thơ, người nhiệt tình giúp đỡ trình thực đề tài Tôi xin cám ơn em sinh viên: Phạm Thị Mỹ Ánh, Cao Thị Mỹ Phương, Nguyễn Huỳnh Trang Thu Hương, Nguyễn Trần Khiết lớp Công nghệ sinh học tiên tiến K33, Quang Anh Thư, Trần Kim Thoa, Vương Thị Hồng Thắm lớp Sư phạm Sinh học K34 nhiệt tình hỗ trợ trình thực nghiệm tổng hợp kết Tôi xin cám ơn cha mẹ, chồng người thân tôi, người chăm sóc cho tôi, tạo điều kiện cho trình học thực đề tài Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Nguyễn Thị Hà MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN 15T 15T LỜI CÁM ƠN 15T T MỤC LỤC 15T T DANH MỤC VIẾT TẮT 15T 15T MỞ ĐẦU 15T T Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15T 15T 1.1 NS hệ sinh thái RNM 15T 15T 1.1.1 Giới thiệu RNM T 15T 1.1.2 Đặc điểm sinh học NS RNM T T 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái T 15T 1.1.2.2 Đặc điểm sinh sản T 15T 1.1.2.3 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa T T 1.1.2.4 Đặc điểm phân loại nấm sợi T T 1.1.2.5 Vai trò NS hệ sinh thái RNM T 1.2 T Chitin chitinase 10 15T 15T 1.2.1 Nguồn chitin: 10 T 15T 1.2.2 Chitinase 13 T 15T 1.2.2.1 Nguồn chitinase: 13 T 15T 1.2.2.2 Cơ chế hoạt động: 13 T 15T 1.2.2.3 Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase: 14 T T 1.2.2.4 Tính chất sinh hóa chitinase 14 T T 1.2.2.5 Phân loại chitinase 15 T 15T 1.2.2.6 Ứng dụng chitinase 16 T 15T 1.2.3 NS với khả sinh enzyme chitinase 19 T T 1.2.3.1 Một số chủng NS có HT chitinase cao 19 T T 1.2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp chitinase NS 20 T T 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitinase nước 21 15T T 1.3.1 Ngoài nước 21 T 15T 1.3.2 Trong nước 24 T 15T Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 15T T 2.1 Vật liệu 25 15T T 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 T 15T 2.1.2 Hóa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ 25 T T 2.1.3 Môi trường 26 T 15T 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 15T 15T 2.2.1 Phương pháp kích hoạt giống 27 T T 2.2.2 Phương pháp bảo quản nấm sợi 27 T T 2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại NS 28 T T 2.2.4 Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5] 28 T T 2.2.5 Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng KL 29 T T 2.2.6 Phương pháp nuôi cấy NS MT bán rắn thu enzyme chitinase 29 T T 2.2.7 Phương pháp tách chiết enzym thô từ canh trường nuôi cấy 29 T T 2.2.8 Phương pháp xác định sơ khả tổng hợp enzyme chitinase cách đo đường T kính vòng phân giải 30 15T 2.2.9 Phương pháp xác định HT enzyme chitinase phương pháp so màu 30 T T 2.2.10 Phương pháp định lượng protein [8] 33 T T 2.2.11 Khảo sát MT điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase chủng T NS [4], [10], [23], [32], [33] 35 15T 2.2.11.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon MT nuôi cấy 35 T T 2.2.11.2.Khảo sát thời gian nuôi cấy 35 T T 2.2.11.3 Khảo sát pH MT 35 T 15T 2.2.11.4 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy 36 T T 2.2.11.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl 36 T T 2.2.11.6 Khảo sát hàm lượng chất chitin 36 T T 2.2.12 Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm P citrinum qui hoạch thực nghiệm [10], [17] 36 T T 2.2.13 Nghiên cứu đặc điểm CP chitinase thô từ chủng P citrinum [4], [43], [44] 39 T T 2.2.13.1 Thu nhận tủa protein 39 T 15T 2.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên HT CPE chitinase thô [9] 39 T T 2.2.13.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên HT chitinase 39 T T 2.2.14 Phương pháp khảo sát khả kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani T chế phẩm enzyme chitinase [4], [20] 40 T 2.2.15 Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm T [4], [46] 41 T Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 15T T 3.1 Khảo sát khả sinh enzyme chitinase số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ 15T 42 3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái phân loại chủng thu 43 15T T 3.2.1 Chủng nấm số 16 43 T 15T 3.2.2 Chủng nấm số 10 45 T 15T 3.3 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chitinase 15T chủng NS P citrinum A protuberus 47 T 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn C MT nuôi cấy 47 T T 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 48 T T 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ MT nuôi cấy 51 T T 3.3.6 Ảnh hưởng HL chitin MT nuôi cấy 53 T T T 3.3.7 Kết qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả T sinh tổng hợp chitinase chủng P citrinum 55 T 3.4 Nghiên cứu đặc điểm CP chitinase thô từ chủng P citrinum 58 15T T 3.4.1 Thu nhận CP chitinase thô muối (NH ) SO 58 T R R R R R R1 T 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên HT CP chitinase 58 T T 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên HT CPE chitinase thô 60 T T 3.5 Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thô để phòng trừ nấm hại trồng 62 15T T 3.5.1 Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm Rhizoctonia solani 62 T T 3.5.2 Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm 64 T T Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 15T T 4.1 Kết luận 66 15T T 4.2 Kiến nghị 67 15T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 15T 15T PHỤ LỤC 74 15T T PHỤ LỤC - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE 74 15T T PHỤ LỤC – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD 75 15T T PHỤ LỤC CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM 76 15T T PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH 77 15T 15T PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG NS NGHIÊN CỨU 79 15T T DANH MỤC VIẾT TẮT BT: bào tử BSA: Bovine serum albumin CPE: chế phẩm enzyme DNS: 3,5 – dinitrosalicylic axit HT: hoạt tính HTC: hoạt tính chung HTR: hoạt tính riêng HL: hàm lượng KL: khuẩn lạc MT: môi trường NC: nuôi cấy OD: mật độ quang ∆OD: hiệu số mật độ quang mẫu đối chứng mẫu thật PTHQ: phương trình hồi qui RNM: rừng ngập mặn U: đơn vị hoạt độ enzyme TTN: thuốc trừ nấm MỞ ĐẦU RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, điều kiện khí hậu khắc nghiệt làm cho sinh vật, NS có tính thích nghi cao tạo sản phẩm trao đổi chất đặc biệt so với điều kiện khác Hệ vi sinh vật đa dạng, phong phú, sinh tổng hợp nhiều chất có HT sinh học loại enzyme xenlulase, protease, chitinase, lipase… chất kháng sinh để phân hủy chất có hệ sinh thái RNM thường xuyên bị ô nhiễm Một nguồn rác thải dồi RNM loại vỏ động vật chân khớp biển như: tôm, cua, ghẹ…có thành phần chủ yếu chitin Chitin chất khó phân hủy Có thể sử dụng nhiều biện pháp hóa lý khác để phân hủy chitin chi phí cao Hiện người ta nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từ nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm… có enzyme chitinase vi sinh vật tổng hợp đặc biệt nấm tổng hợp có HT cao, ổn định với nhiệt độ pH Ngoài enzyme chitinase có nhiều ứng dụng nông nghiệp, công nghiệp y học Khả khử chitin làm cho chitinase có giá trị phòng trừ dịch bệnh, giảm ô nhiễm MT Chitinase khai thác sử dụng tác nhân phòng trừ sinh học Chúng có vai trò quan trọng hình thành thể nguyên sinh nấm, phòng trừ muỗi, sản xuất chitooligosaccharid hoạt hóa Trong vitro thí nghiệm thử HT kháng nấm cách sử dụng Trichderma harzianum làm phân hủy thành tế bào nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides Vì lý thực đề tài: “Tuyển chọn số chủng NS từ RNM Cần Giờ có khả sinh tổng hợp enzyme chitinase cao” Mục tiêu đề tài: Góp phần tìm hiểu đặc điểm vai trò enzyme chitinase từ chủng NS có nguồn gốc từ RNM Cần Giờ làm sở cho việc ứng dụng thực tiễn Nhiệm vụ đề tài Khảo sát khả sinh enzyme chitinase chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư phạm TPHCM Chọn chủng có khả sinh enzyme chitinase cao Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại đến loài chủng thu Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chitinase chủng NS chọn Chọn chủng NS có HT enzyme chitinase cao để tối ưu hóa phương pháp qui hoạch thực nghiệm Thu nhận nghiên cứu số đặc điểm CPE chitinase thô Bước đầu thử nghiệm tác dụng chế phẩm chitinase thô phòng trừ nấm bệnh hại trồng Địa điểm thời gian nghiên cứu Nghiên cứu nội dung PTN Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM Nghiên cứu nội dung Phòng Xét Nghiệm NK – Biotek, quận 7, Tp HCM Nghiên cứu nội dung 3,4,5 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ Đề tài tiến hành thời gian từ tháng năm 2011 đến tháng năm 2011 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NS hệ sinh thái RNM 1.1.1 Giới thiệu RNM * Giới thiệu chung RNM Diện tích RNM giới khoảng 15.429.000 Khu vực châu Á có diện tích RNM lớn Ấn Độ-Thái Bình Dương với diện tích khoảng 6.9 triệu Nước có diện tích RNM lớn châu Á Bangladet với 600.000 Việt Nam có 252.500 RNM phân bố miền: bắc, trung, nam RNM hình thành nhờ phù sa sông với trầm tích biển thủy triều mang vào tạo thành bãi lầy RNM chịu tác động biển lẫn lục địa nên tài nguyên sinh vật đa dạng phong phú tác động làm cho sinh vật có chế tồn đặc biệt RNM có vai trò quan trọng: Hạn chế tác hại song thần bão lớn, bảo vệ đê biển, làm chậm dòng chảy phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao sóng triều cường, bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối MT, hạn chế xâm nhập mặn bảo vệ nước ngầm, làm MT nước có lũ quét, sạt lở đất, cung cấp nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu lợi ích người * Giới thiệu RNM Cần Giờ - Tp HCM RNM Cần Giờ hình thành hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn, nằm cửa ngõ đông nam thành phố Hồ Chí Minh Thuộc xã Long Hòa, huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh RNM có khí hậu nóng ẩm, lượng mưa thấp Nhiệt độ trung bình 25,80C, biên độ dao động nhiệt P P ngày 5-70C, thời điểm có nhiệt độ cao nhất: tháng 12, tháng Độ mặn trung bình: 1,5 – 2,5 %, P P tùy theo khu vực lên đến 18%, độ mặn phụ thuộc vào thủy triều biển đông lưu lượng nước sông Đồng Nai, sông Sài Gòn Độ mặn lớn triều cường, nhỏ triều Hệ sinh vật: thực vật 150 loài, động vật thủy sinh không xương sống 700 loài, cá 137 loài, động vật có xương sống cạn có loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, loài động vật có vú, chim có khoảng 130 loài Vi sinh vật gồm nấm men, NS, vi khuẩn, xạ khuẩn… vi sinh vật có vai trò quan trọng hệ sinh thái RNM Vi sinh vật phân bố rộng rãi có mặt chất RNM Nhiều vi sinh vật có đặc tính sinh học đáng quí cần khai thác nhằm phục vụ nhu cầu lợi ích người Tuy nhiên nghiên cứu vi sinh vật RNM ít, chưa tương xứng với qui mô tiềm hệ vi sinh vật RNM 1.1.2 Đặc điểm sinh học NS RNM 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái NS nhóm có cấu tạo tế bào nhân chuẩn, cấu trúc tế bào tính từ vào gồm: thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh nhân phân hóa Tế bào nấm diệp lục tố, vài loài nấm có rải rác tế bào loại sắc tố đặc trưng gọi neocercosporin Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti chất khuẩn ti khí sinh Trên khuẩn ti khí sinh hình thành nên quan sinh sản, cuống sinh BT Từ cuống sinh BT hình thành BT tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu Mỗi loài nấm có hình dạng BT màu sắc BT có khác Chính màu sắc BT tạo nên màu sắc KL màu sắc đặc trưng chi loài nấm Sợi nấm có đường kính trung bình 5-10µm, lớn tới 25µm có nhỏ 1-2µm Chiều dài sợi nấm đạt vài chục centimet Sợi nấm có vách ngăn tạo thành dạng đa bào, nhiên khả di chuyển nhân mà tế bào có một, hai nhiều nhân hay chẳng có nhân Sợi nấm vách ngăn, bên sợi nấm chứa nhiều nhân gọi tế bào đa nhân, gặp lớp Trichomycetes, Oomycetes Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti chất khuẩn ti khí sinh Trên khuẩn ti khí sinh hình thành nên quan sinh sản cuống sinh BT Từ cuống sinh BT hình thành nên BT BT tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu Khi BT phân tán từ thể mẹ đến nguồn chất thích hợp nảy mầm, phát triển theo chiều tạo thành hệ sợi nấm Sau vài ngày, số lượng sợi nấm tăng lên nhiều tạo thành đám, ta quan sát mắt thường Hệ sợi nấm phát triển đến giai gọi KL Tùy theo loài mà KL có hình dạng khác thường có hình cầu Sau thời gian, sợi nấm khí sinh hình thành BT có hình dạng màu sắc khác đặc trưng cho loài 1.1.2.2 Đặc điểm sinh sản NS có nhiều hình thức sinh sản, chủ yếu hình thức sinh sản BT Sau số hình thức sinh sản NS: Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính theo kiểu đứt đoạn, sinh sản vô tính BT áo, sinh sản vô tính BT kín, sinh sản vô tính BT đính Sinh sản hữu tính: sinh sản hữu tính BT túi (Ascospore), sinh sản hữu tính BT đảm (Basidiospore), sinh sản hữu tính BT noãn (Oospore), sinh sản hữu tính BT tiếp hợp (Zigospore) 1.1.2.3 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa - Sinh lí: Các loài sinh vật nói chung NS nói riêng có sinh trưởng, phát triển đặc điểm phân bố phụ thuộc lớn vào yếu tố MT RNM hệ sinh thái chịu nhiều tác động gió bão, chịu ảnh hưởng chất thải từ đất liền (chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp) lẫn chất thải từ MT biển…Vấn đề ô nhiễm điều tránh khỏi ô nhiễm VSV gây bệnh Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả thích nghi NS RNM Nhiệt độ: NS thuộc nhóm VSV ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 200C – 500C, cá P P P P biệt có số loài sống sót 00C 600C P P P P pH: yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống NS, NS phát triển tốt MT axit (pH = – 6) Tuy nhiên có số loài phát triển pH < hay pH < (Ingold, 1967) pH làm thay đổi tính chất màng tế bào làm ảnh hưởng đến phân ly cấu tử thức ăn MT Do đó, hấp thu loại thức ăn vào tế bào bị thay đổi MT có pH cao hay thấp làm cho sinh trưởng NS yếu Ánh sáng: ánh sáng không cần cho trình sinh trưởng hầu hết loài NS, ánh sáng lại ảnh hưởng đến hình thành BT số loài nấm Khí oxi: nồng độ oxi cần cho hoạt động sống NS chúng nhóm hiếu khí bắt buộc Nguồn C: thể nấm diệp lục nên khả tự dưỡng phải sống kí sinh, hoại sinh hay cộng sinh Chúng VSV dị dưỡng hóa hữu NS có khả đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau, đường đơn dễ hấp thụ glucose chúng sử dụng trực tiếp đường mantose, saccarose… Nguồn N: N đóng vai trò quan trọng việc tham gia thành phần cấu tạo protein đặc biệt enzyme NS có khả đồng hóa nguồn N hữu lẫn vô cơ, chủng NS khác có nhu cầu khác nguồn thức ăn N Độ mặn: Đa số NS RNM có khả chịu mặn cao Chúng sinh trưởng nồng độ muối từ 2% - 20% Thậm chí số NS RNM sinh trưởng nồng độ muối 30% Đây đặc điểm có ý nghĩa sinh thái RNM - Sinh hóa [1] Trong trình sinh trưởng phát triển NS tiết MT nhiều sản phẩm sắc tố, chất hữu kết tinh bề mặt sợi nấm, nhiều chất có HT sinh học có ý nghĩa quan trọng người hệ sinh thái các enzyme, kích thích tố tăng trưởng, vitamin, kháng sinh… MT sống khắc nghiệt RNM làm cho kiểu trao đổi chất chúng khác biệt so với nấm đất liền Do đó, sản phẩm trao đổi chất chúng, đặc biệt hệ enzyme mang tính chất khác lạ HT enzyme thủy phân ngoại bào NS nhóm VSV có tiềm lớn sinh enzyme thủy phân ngoại bào Đa phần enzyme dùng công nghiệp có nguồn gốc từ NS Cellulase: enzyme ngoại bào có khả cắt đứt liên kết 1–4 β - glucosid phân tử cellulose để tạo thành đơn phân glucose Cellulose thành phần chủ yếu xác thực vật enzyme có vai trò quan trọng việc phân giải hợp chất hữu tồn đọng MT Enzyme ứng dụng nhiều lĩnh vực thức ăn gia súc, công nghiệp thực phẩm nhờ khả phân giải cellulose Những NS có khả phân giải cellulose nấm thuộc chi Aspergillus (Asp.niger, Asp.flavus, Asp.oryzae…), Fusarium (F.oxysporum, F.solani), Penicillium, Trichoderma… Amylase: enzyme thủy phân tinh bột chất có cấu trúc tương tự Vì tinh bột sản phẩm chủ yếu thực vật nên vai trò amylase giữ vị trí quan trọng việc phân giải sản phẩm với thành phần chủ yếu tinh bột góp phần việc làm MT Những NS có khả phân giải mạnh tinh bột Asp.candidus, Asp.awamori….Cũng cellulose, dựa vào đặc tính phân giả mạnh tinh bột mà amylase ứng dụng nhiều lĩnh vực sản xuất rượu, bia, bánh mì… Protease: enzyme thủy phân liên kết peptid polypeptide tạo thành chuỗi polypeptide ngắn hơn, đipeptide hay axit amin Trong tự nhiên enzyme có tác dụng khoáng hóa: phân giải hợp chất hữu có chất protein xác động thực vật sinh vật nói chung thành hợp chất đơn giản cuối thành phân tử vô Con người ứng dụng enzyme lĩnh vực đời sống công nghiệp thịt, da, tơ tằm … nhằm tận dụng khả phân giải protein chúng tận dụng sản phẩm từ trình phân giải Những NS có khả sinh protease mạnh nhóm mốc vàng (Asp.flavus, Asp.oryzae, Asp.funginatus…) nhóm mốc đen (Asp.niger, Asp.awmori, Asp.usamii…) Pectinase: enzyme xúc tác trình phân giải pectin thành hợp chất đơn giản galacturonic, galactose, methanol….được ứng dụng sản xuất nước quả, rượu vang, sản xuất cà phê hòa tan, chế biến đay gai…Những NS có khả sinh pectinase cao ý P.glaucum, Asp.awamori, P.citrinum… Chitinase: Chitinase biopolymer chứa gốc N-acetyl-glucoszamine liên kết với mối liên kết β - 1,4 – glucosid Hàng năm tự nhiên tạo 1010 – 1014 chitin P P P P Chitinase bị VSV (chủ yếu NS) phân giải liên kết β - 1, – glucosid tạo N-acetylglucoszamine Hệ chitinase mạnh giúp NS (Trichoderma spp., Glyocladium spp., Chaetomium spp.) tăng cường hiệu tiêu diệt loài nấm gây bệnh (Fusarium oxysporium, Botritiscinerea, Pyricularia oryzae… có thành tế bào chitin) loài nấm B bassiana, M anisopliae, P fumosoroseus… chống loài côn trùng có vỏ chitin Các NS sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học chống VSV gây bệnh côn trùng nông – lâm nghiệp VSV nói chung NS nói riêng thường khả tạo tỉ lệ cân đối enzyme, có loài tạo nhiều enzyme này, loài khác lại tạo nhiều enzyme khác Các loài nấm thường có HT amylase chitinase mạnh [6][7] HT sinh chất kháng sinh: Chất kháng sinh số sản phẩm trao đổi chất bậc hai NS sản xuất Hiện có nhiều công trình nghiên cứu vai trò chất kháng sinh đời sống Tuy nhiên, có hai giả thiết vai trò chất kháng sinh nhiều nhà khoa học ủng hộ Giả thuyết thứ cho việc tổng hợp chất kháng sinh đặc tính cần thiết đảm bảo khả sống sót cao cho chủng sinh chất kháng sinh tự nhiên, với loài có BT Người ta xác định số chất kháng sinh có tác dụng ức chế nảy mầm BT chủng sinh chất kháng sinh Có thể chất kháng sinh có vai trò kìm hãm nảy mầm BT điều kiện MT hoàn toàn thích hợp cho phát triển chúng Giả thiết thứ hai cho việc tổng hợp chất kháng sinh nhằm tạo ưu phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ chúng tiêu diệt hay kìm hãm phát triển loài khác tồn phát triển hệ sinh thái cục Gần người ta phát NS RNM nguồn VSV có tiềm sinh chất kháng khuẩn enzyme đặc biệt chitinase có ý nghĩa lớn cho tồn thực vật chịu mặn Độc tố nấm: Một sản phẩm trao đổi chất bậc hai nấm đáng quan tâm độc tố nấm (mycotoxin) Đây số mối nguy hại lớn cho sức khỏe người động vật sử dụng thức ăn có chứa HL độc tố định ăn phải nấm có khả sinh độc tố Hiện có 300 loại độc tố nấm người phát Trong số đó, nguy hiểm aflatoxin, đặc biệt aflatoxin B1 Phần lớn NS RNM có khả sản sinh sản phẩm giúp khống chế VSV có hại chất kháng sinh, độc tố giúp làm tăng khả đối kháng trình cạnh tranh đời sống Một số NS có HT diệt côn trùng mạnh, sử dụng để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng cách an toàn Đây nguồn gen quý, có giá trị sinh học y học Kết luận: Với đặc điểm đáng ý trên, NS trở thành đối tượng quan tâm nghiên cứu nhằm khai thác triệt để đặc tính sinh học quý phục vụ cho đời sống người 1.1.2.4 Đặc điểm phân loại nấm sợi Hiện có hai phương pháp sử dụng phổ biến phương pháp phân loại truyền thống phương pháp phân loại đại sinh học phân tử *Phương pháp truyền thống: Chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái Dayal (1975) dựa vào đặc tính để phân loại nấm sợi: đặc điểm hình thái, ký chủ đặc thù, đặc điểm sinh lý, đặc điểm tế bào học, đặc điểm di truyền học, đặc điểm kháng huyết thanh, đặc tính sinh hóa phân loại số học Có nhiều khóa phân loại sử dụng như: Saccardo P.A (1880 – 1886), Baron G.L (1968), Hughes S.T (1953), Ellis M.B (1971), Ainsworth G.C (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1986), Barnett H.L cộng (1972), Nguyễn Lân Dũng (2000), Samson (2004) * Phương pháp phân loại sinh học phân tử Đây phương pháp kỹ thuật đại tương đối mẻ Các thao tác sử dụng kĩ thuật thu nhận DNA, chạy PCR giải trình tự axit nucleic Thu nhận DNA Yêu cầu kỹ thuật phải thu phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy tác nhân hóa học học Ba bước kĩ thuật DNA : Phá màng tế bào màng nhân protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng DNA, đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol chloroform (hỗn hợp có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA Thu nhận axit nucleic Làm kết tủa axit nucleic ethanol isopropanol, nhằm thu nhận axit nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản Chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) Nguyên tắc Khuếch đại trình tự DNA lên nhiều lần cặp mồi chuyên biệt Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm bước: Bước (biến tính) Trong dung dịch đầy đủ thành phần cho chép, DNA biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử, thường 940C – 950C vòng 30 giây – phút P P P P Bước (lai) Nhiệt độ hạ thấp để mồi bắt cặp với khuôn Nhiệt độ dao động khoảng từ 400C – 700C kéo dài vòng 30 giây – phút P P P P Bước (tổng hợp) Nhiệt độ tăng lên đến 720C nhiệt độ mà DNA polymerase hoạt động tốt Thời gian P P giai đoạn phụ thuộc vào độ dài trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Giải trình tự axit nucleic Các phương pháp xác định trình tự axit nucleic dựa nguyên tắc: Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam Gilbert) Dựa vào phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước nucleotid Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger) Quá trình tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ enzyme DNA polymerase bên cạnh nguồn nguyên liệu đơn phân nucleotic bổ sung thêm đơn phân dideoxinucleotid Kết trình kéo dài chuỗi polynucleotide dừng lại có dideoxinucleotid tham gia vào chuỗi Từ dẫn đến việc tổng hợp nhóm gồm nhiều đoạn DNA có kích thước nucleotide Sau đó, phân đoạn DNA điện di gel polyacrylamid Dựa kết điện di người ta xác định trình tự đoạn DNA cần thiết So sánh đối chiếu với trình tự gen ngân hàng gen để xác định loài 1.1.2.5 Vai trò NS hệ sinh thái RNM Với đặc điểm riêng NS RNM, chúng mang lại nhiều vai trò mang tính định hệ sinh thái RNM Trong điều kiện RNM – nơi mà nguồn dinh dưỡng chủ yếu biopolymer sinh khối thực vật RNM động vật biển NS tác nhân tham gia tích cực vào trình phân giải hợp chất hữu phức tạp này, mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn tham gia khép kín chu trình sinh địa hóa RNM Cụ thể hơn, nhờ hệ thống enzyme ngoại bào mạnh amylase, cellulase, protease,…chúng phân giải chuyển hóa hợp chất hữu cơ, vô khó tan, cung cấp chất dinh dưỡng lượng cho hệ sinh thái Các chức kể đến việc NS RNM phân hủy mùn bã hữu thành nguồn thức ăn khoáng để nuôi dưỡng ngập mặn tảo phù du, phân hủy phần rơi rụng ngập mặn thành mùn bã hữu tạo nguồn thức ăn cho động vật tiêu thụ cấp Bản thân NS RNM trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài động vật nhỏ ấu trùng số loài (Odum, 1980; Alogi, 1989) NS RNM nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho VSV hóa dị dưỡng khác, từ làm giàu quần thể VSV [6] NS RNM có vai trò lớn việc làm MT sống với việc phân giải chất độc hại MT dầu mỏ, chất hóa học có cấu trúc mạch vòng Bên cạnh vai trò làm MT sống nói chung, NS RNM có vai trò làm MT sinh vật với chức tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu việc giữ cân sinh thái NS RNM có mặt phân hủy tiếp xúc trực tiếp với oxi tự Vì vậy, vai trò nấm trình phân hủy sản phẩm rơi rụng RNM tồn sản phẩm trôi mặt nước gần với lớp bùn đất bề mặt RNM [6], [7] NS có khả biến đổi chất, điều chỉnh MT cho thể khác sử dụng [6] Tuy nhiên, hoạt động sống NS RNM lại làm giảm lượng oxi đất, bùn RNM trình hô hấp, gây bệnh cho động thực vật thải vào MT số chất độc như: ammoniac, sunfuahidro… [6], [7] Kết luận: NS RNM có vai trò vô quan trọng chu trình tuần hoàn vật chất hệ sinh thái RNM, có vai trò bảo vệ MT sinh thái nói chung MT sinh thái RNM nói riêng, có vai trò to lớn mối quan hệ sinh học loài sinh vật từ đóng góp vào việc giữ cân cho hệ sinh thái đặc biệt 1.2 Chitin chitinase 1.2.1 Nguồn chitin: Chitin polysacharide tồn tự nhiên với sản lượng lớn (đứng thứ hai sau cellulose) Trong tự nhiên, chitin có động vật thực vật Trong động vật, chitin thành phần cấu trúc quan trọng vỏ số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác giun tròn Trong động vật bậc cao, đơn phân chitin thành phần chủ yếu mô da, giúp cho tái tạo làm liền vết thương da Trong thực vật, chitin có vách tế bào nấm họ zygomycetes, sinh khối nấm mốc số loại tảo Trong loài thủy sản đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ, HL chitin - chitosan chiếm cao từ 14 - 35% so với trọng lượng khô.Vì vỏ tôm, cua, ghẹ nguồn nguyên liệu để sản xuất chitin - chitosan Về mặt lịch sử, chitin Braconnot phát vào năm 1821, cặn dịch chiết từ loại nấm Ông đặt tên cho chất “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc Năm 1823 Odier phân lập chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa vỏ giáp, ông không phát có mặt nitơ Cuối Odier Braconnot đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose Cấu trúc hoá học chitin: Chitin (C H 13 O N)n polymer mạch dài N-acetylglucosamine, dẫn xuất glucose, R R R R R R nhóm (-OH) nguyên tử C(2) thay nhóm acetyl amin (-NHCOCH ) (cấu trúc R R I) Như chitin poly (N-acetyl-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với liên kết β-(1-4) glycoside Trong đơn phân chitin đánh số glucose Cấu trúc chitin tập hợp monosacharide (N-acetyl-β-D-glucosamine) Hơn chitin tồn trạng thái tự luôn liên kết cộng hóa trị (covalent bond) với protein, CaCO hợp chất hữu khác R R Hình 1.1: Cấu trúc phân tử chitin Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X Người ta chứng minh chitin tồn ba dạng cấu hình: α, β, γ – chitin Các dạng chitin xếp khác hướng đơn phân (N-acetyl-D-glucosamin) mạch Có thể biểu diễn đơn phân mũi tên cho phần đầu mũi tên nhóm –CH OH, phần đuôi nhóm –NHCOCH , cấu trúc α, β, γ- chitin R R R R mô tả sau: Hình 1.2: Các cấu hình chitin α - chitin có cấu trúc mạch xếp ngược chiều đặn, nên liên kết hydro lớp mạch, có liên kết hydro lớp kề mạch nên bền vững Do mắt xích xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi mặt không gian lượng Đây dạng phổ biến tự nhiên β, γ - chitin mắt xích ghép với theo kiểu song song (β - chitin) hai song song ngược chiều (γ - chitin), lớp liên kết hydro Dạng β - chitin chuyển sang dạng α - chitin nhờ trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững Qua nghiên cứu thủy phân chitin enzyme hay acid HCl đậm đặc người ta thấy chitin có cấu trúc polymer tạo thành từ đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với liên kết β-(1-4) glucoside (H.F Mark et al., 1965) T Ứng dụng chitin: Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo nguyên liệu trung gian cho chất quan trọng chitosan, glucosamin chất có giá trị khác Chitosan dạng chitin bị khử acetyl, không giống chitin, lại tan dung dịch acid Chitosan có nhiều ứng dụng ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược bảo vệ MT như: sản xuất glucosamin, khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, làm thuốc chữa bỏng, giảm đau, thuốc hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dày, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp, màng bao hoa quả, bảo vệ MT…Với khả ứng dụng rộng rãi chitin – chitosan mà nhiều nước giới Việt Nam nghiên cứu sản xuất sản phẩm Glucosamin hoạt chất quý sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian chitin chitosan Glucosamine thể dùng để sản xuất proteoglycan Glucosamin chủ yếu sử dụng y học chữa bệnh thoái hoá khớp