Nghiên cứu phân lập tuyển, chọn chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc luận văn này, ngồi cố gắng nỗ lực thân, tơi nhận đƣợc ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Nhƣ Ngọc, mơn cơng nghệ vi sinh- hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam tận tình bảo, hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy giáo mơn vi sinh- hóa sinh thầy cô giáo khác thuộc Viện Công nghệ sinh học – Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Nhàn i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan chitin 1.1.1 Cấu trúc phân tử tính chất chitin 1.1.2 Các dẫn xuất chitin 1.1.3 Ứng dụng chitin 1.1.4 Phƣơng pháp thu nhận chitin 1.2 Tổng quan enzyme chitinase 1.2.1.Cấu trúc 1.2.2 Phân loại 10 1.2.3 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase 12 1.2.4.Các đặc tính hệ enzyme chitinase 14 1.2.5 Ứng dụng enzyme Chitinase 15 1.2.6 Nguồn tổng hợp chitinase 18 1.3 Tổng quan nấm sợi 21 1.3.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy nấm sợi sinh chitinase 21 1.3.2 Yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả sinh enzyme chitinase nấm sợi 22 1.4 Tình hình nghiên cứu chitinase 23 1.4.1 Trên giới 23 1.4.2 Trong nƣớc 24 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Mục tiêu 26 ii 2.2 Nội dung 26 2.3 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ 26 2.3.1 Nguyên liệu 26 2.3.2 Hóa chất 26 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ 26 2.4 Môi trƣờng 27 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.5.1 Phƣơng pháp thu nhận chitin 27 2.5.2 Nghiên cứu phân lập nấm 28 2.5.3 Phƣơng pháp xác định số đặc tính sinh hóa chủng nấm tuyển chọn 29 2.5.4 Phƣơng pháp tuyển chọn chủng nấm có khả sinh tổng hợp enzyme chitinase 30 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết thu nhận chitin 34 3.2 Kết phân lập xác định số đặc tính sinh hóa chủng nấm phân lập 35 3.3 Kết tuyển chọn chủng nấm tổng sinh hợp enzyme chitinase 3.3.1.Kết xác định sơ khả tổng hợp enzyme chitinase cách đo đƣờng kính vịng phân giải 42 3.3.2 Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase theo phƣơng pháp so màu với thuốc thử DNS 44 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 KẾT LUẬN 47 4.2 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC VIẾT TẮT CPE Chế phẩm enzyme CT Canh trƣờng DNS 3,5-dinitrosalicylic axit MT Môi trƣờng OD Mật độ quang ∆OD Hiệu số mật độ quang mẫu TN ĐC UI Đơn vị hoạt độ enzyme (tính theo đơn vị quốc tế) TB Giá trị trung bình TN Thí nghiệm OD Đối chứng pHopt pH tối ƣu topt Nhiệt độ tối ƣu KHV Kính hiển vi Dd Dung dịch KHC Kí hiệu chủng CTPT Cơng thức phân tử GlcNAc N-acetyl-D-glucosamin VSV Vi sinh vật iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lƣợng chitin vỏ số loại giáp xác Việt Nam Bảng 1.2 Hàm lƣợng chitin có lồi Bảng 2.1 Các thiết bị dùng thí nghiệm 26 Bảng 2.2 Dụng cụ dùng thí nghiệm 27 Bảng 3.1 Bảng mơ tả đặc điểm hình thái, bào tử hệ sợi 12 chủng nấm 36 Bảng 3.2 Bảng kết đo đƣờng kính vịng phân giải phân giải chitin chủng nấm nuôi môi trƣờng lỏng 42 Bảng 3.3 Kết tính hoạt độ enzyme chủng nấm sợi 44 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Thành phần hóa học vỏ tôm Hình 1.2 Hình cấu trúc chitin Hình 1.3 Hình ảnh cấu trúc α–chitin Hình 1.4 Hình ảnh cấu trúc khơng gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 11 Hình 1.5 Hình ảnh cấu trúc khơng gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 11 Hình 1.6 Vị trí phân cắt enzyme chitinase 13 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình tách chitin từ mai cua 28 Hình 3.1 Hình ảnh chitin 34 thô vỏ cua 34 Hình 3.2 hình ảnh dung dịch Chitin ngâm đệm 34 Hình 3.3 Hình ảnh vịng phân giải chitin enzyme chitinase chủng tổng hợp 43 Hình 3.4 Đƣờng chuẩn biểu diễn mối tƣơng quan OD hàm lƣợng glucose 44 Hình 3.5 Phản ứng màu N-acetyl-β-D-glucosamine sinh từ môi trƣờng nuôi lỏng với thuốc thử DNS (dịch enzyme làm đối chứng) 45 Hình 3.6 Phản ứng màu N-acetyl-β-D-glucosamine sinh từ môi trƣờng nuôi với thuốc thử DNS (dịch enzyme làm thí nghiệm) 45 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Nƣớc ta số nƣớc Đơng Nam Á có điều kiện địa lý thuận lợi cho ngành công nghiệp thủy hải sản phát triển, bao gồm nuôi trồng đánh bắt biển, với sản lƣợng đông lạnh lớn Nhƣ lƣợng phế thải khơng nhỏ bị vứt bỏ, để thối rữa gây ô nhiễm môi trƣờng Theo ƣớc tính lƣợng phế thải tôm, cua… hàng năm 1,44 triệu (trọng lƣợng khơ) Tuy lƣợng phế thải vỏ tơm, cua, mực… lại nguồn tiềm to lớn protein, chất màu chitin – polysaccarit Lƣợng phế thải đƣợc ứng dụng tiếp vào để tách, thu nhận chất Trong phải nói đến chitin chiếm hàm lƣợng cao thành phần cấu trúc nên lớp vỏ giáp xác Chitin poly-β-1,4-N-Acetylglucosamine phân bố rộng rãi tự nhiên [15], polysaccharide phổ biến thứ hai sau cellulose Nó chuỗi polymer chứa đơn phân N-acetylglucosamine đƣợc liên kết liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng phân tử cao, khơng hịa tan nƣớc dung mơi hữu khác Chitin thành phần cấu trúc vỏ lớp biểu bì động vật chân đốt, giáp xác, lồi trùng thành tế bào nấm Đặc biệt hàm lƣợng cao vỏ giáp xác Chitin đƣợc ứng dụng rộng rãi đời sống Là chất tổng hợp nên enzyme chitinase Ngƣời ta ƣớc tính tỷ lệ hình thành, số lƣợng chitin hàng năm ổn định khoảng 1010 đến 1011 [15] Những năm gần nhà khoa học nhận rằng, sử dụng lƣợng chitin làm thức ăn gia súc hàng năm bỏ khối lƣợng lớn nguồn ngun liệu có giá trị kinh tế cao Vì mà việc tận dụng phế liệu vào sản xuất hoạt chất, sản phẩm ứng dụng ngành, lĩnh vực nhƣ y tế, dƣợc mỹ phẩm, thức ăn chăn ni,… Đã góp phần giảm thiểu đƣợc lƣợng phế thải gây ô nhiễm môi trƣờng, lại giảm đáng kể kinh phí nguyên liệu sản xuất chất, chế phẩm phục vụ nhu cầu thị trƣờng Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành sản phẩm khác nhƣ N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose Chitinase có nhiều loại thể sống khác bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật khơng xƣơng sống, thực vật động vật có xƣơng sống Chitinase đƣợc ứng dụng nhiều ngành nơng nghiệp nhƣ tác nhân nhằm kiểm sốt nấm gây bệnh thực vật, kiểm sốt trùng Trong y dƣợc, chitinase có giá trị phịng trừ dịch bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, ngƣời ta nghiên cứu tách chiết chitinase phân giải chitin từ nguồn khác nhƣ vi khuẩn, nấm, động vật, thực vật… nhƣng có chitinase vi sinh vật tổng hợp, đặc biệt từ nấm sợi có hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ pH Vì ứng dụng rộng rãi chitinase phổ biến dễ tìm, kinh phí rẻ chitin nhƣ nên thực đề tài: “ Nghiên cứu, phân lập tuyển chọn chủng nấm có khả sinh tổng hợp chitinase” CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan chitin Chitin chất chủ yếu enzyme chitinase Chitin polysaccharide phổ biến tự nhiên Ở lớp vỏ côn trùng giáp xác, chitin đƣợc gắn kết với protein Trong vài trƣờng hợp lớp biểu bì đƣợc làm cứng liên kết chéo với polysaccharide khác (cellulose, mannan, glucan…) Ngồi ra, chitin có cấu trúc liên hệ với murein, cấu trúc polymer diện tế bào vi khuẩn [1, 7] Chitin tự nhiên thƣờng không tồn dạng tự mà kết hợp với chất khác nhƣ: protein, khoáng chất, lipit, màu Do đó, cần phải dùng tác nhân mạnh để tách chất khỏi chitin Những phƣơng pháp gây phân hủy phần chitin, khó mà thu đƣợc sản phẩm ngun vẹn, khơng bị phân huỷ Bảng 1.1 Hàm lƣợng chitin vỏ số loại giáp xác Việt Nam [7] Nguyên liệu Khối lƣợng (g) Chitin (g) Hàm lƣợng(%) Vỏ hến 80 0,39 ± 0,01 0,48 Vỏ ốc 80 0,99 ± 0,02 1,24 Vỏ cua đồng 80 18,65 ± 0,27 18,2 Vỏ tôm đồng 80 24,05 ± 0,15 30,0 Vỏ tôm biển 80 26.52 ± 0,24 33,1 Theo số liệu bảng vỏ tơm hàm lƣợng chitin chiếm lƣợng cao nhất, tôm đƣợc sử dụng nhiều để thu nhận chitin vỏ tơm dễ kiếm, phế thải bỏ 3.64 27.2 Chitin Protein 45.16 Khống 23 Nước chất khác Hình 1.1 Thành phần hóa học vỏ tơm [7] Là polyme sinh học đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn từ sinh vật Lƣợng chitin đƣợc sản xuất hàng năm giới đứng sau cellulose, chúng đƣợc tạo trung bình 20g năm/1m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên chitin tồn động vật thực vật Trong giới động vật, chitin thành phần cấu trúc quan trọng lớp vỏ số động vật không xƣơng sống nhƣ côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác giun tròn Trong giới thực vật, chitin có thành tế bào nấm số tảo chlorophiceae Chitin tồn tự nhiên dạng tinh thể, cấu trúc gồm nhiều phân tử đƣợc nối với liên kết hydro tạo thành hệ thống sợi Trong tự nhiên, chitin tồn trạng thái tự mà gần nhƣ luôn liên kết dƣới dạng phức hợp chitin- protein Điều dẫn đến đề kháng với hóa chất enzyme thủy phân, gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng Tùy vào đặc tính thể thay đổi giai đoạn sinh lý mà lồi thấy thay đổi lƣợng chất chitin Trong động vật thủy sản, đặc biệt vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lƣợng chitin chiếm cao từ 14-35% so với trọng lƣợng khơ Vì vỏ tơm, cua ghẹ, mai mực nguồn nguyên liệu để sản xuất chitin sản phẩm từ chúng Chitin đƣợc tìm thấy từ nhiều nguồn khác với hàm lƣợng khác [26, 27] Hình 3.3 Hình ảnh vịng phân giải chitin enzyme chitinase chủng tổng hợp 43 3.3.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS OD535nm ĐỒ THỊ PHƢƠNG TRÌNH ĐƢỜNG CHUẨN GLUCOSE y = 1.3107x - 0.0086 R² = 0.9878 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Hàm lƣợng Glucose (mg/ml) Hình 3.4 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan OD535nm hàm lượng glucose (mg/ml) Bảng 3.3 Kết tính hoạt độ enzyme chủng nấm sợi KHC Hoạt độ enzyme chitinase (UI/ml) KHC Hoạt độ enzyme chitinase (UI/ml) N1 4,123 N13 7,017 N3 5,698 N14 14,268 N4 2,076 N17 12,217 N9 10,761 N18 1,926 N10 14,597 N21 9,921 N28 9,507 44 Hình 3.5 Phản ứng màu N-acetyl-β-D-glucosamine sinh từ môi trường nuôi lỏng với thuốc thử DNS (dịch enzyme làm đối chứng) Hình 3.6 Phản ứng màu N-acetyl-β-D-glucosamine sinh từ môi trường nuôi với thuốc thử DNS (dịch enzyme làm thí nghiệm) Cả 11 chủng phân lập đƣợc có hoạt tính sinh tổng hợp chitinase, sau tiến hành tuyển chọn thông qua phƣơng pháp đo đƣờng kính vịng phân giải, đo hoạt độ enzyme thuốc thử DNS, kết luận đƣợc chủng N10 có hoạt tính chitinase tốt với đƣờng kính vòng phân giải chitin 22 mm hoạt độ 15,293 UI/ml Hoạt độ enzyme chủng nấm sợi khác khác nhiên phân lập làm điều kiện cụ thể nuôi điều kiện nhiệt độ 35oC ngày nên chƣa thể kết luận đƣợc chủng mạnh khỏe sinh tổng hợp enzyme chitinase tốt đƣợc, kết luận đƣợc độ mạnh nhất, hoạt tính hoạt độ chủng nấm chủng mạnh nhƣ với điều kiện nuôi cấy 35OC ngày pH môi trƣờng 5,5 Đó điều kiện đồng nhất mà sử dụng để 45 phân lập, ni cấy tất chủng nấm sợi sinh tổng hợp enzyme chitinase  Có thể kết luận chủng nấm sợi Rhizopus echinulatus sinh tổng hợp enzyme chitinase tốt tất chủng nấm sợi mà phân lập đƣợc dùng để nghiên cứu Các chủng khác có hoạt tính hoạt độ Chitinase tốt, mạnh điều kiện Ni chủng N17 điều kiện 35oC, pH 5,5, 72h sinh tổng hợp enzyme hoạt độ chitinase tơi thu nhận đƣợc có hoạt độ 12,712 UI/ml chủng nấm thuộc chi Aspergillus N1, N4, N13, N18, N21, N28 có hoạt độ nằm khoảng từ 2,076 – 9,921 UI/ml chủng thuộc chi Trichoderma N9, N14, N17 hoạt độ nằm khoảng 10,761 – 12,217 UI/ml Hoạt độ enzyme chitnase thu nhận đƣợc từ chủng nấm phân lập cao so với hoạt độ enzyme chitinase chủng đƣợc số tác giả nghiên cứu nhƣ tác giả Lê Thị Huệ nghiên cứu đƣợc 0,83 UI/ml Và số chủng nấm thuộc chi Aspergillus Trichoderma có hoạt độ đến 1,14 cao nhất.[7] Hoạt tính enzyme chitinase chủng nấm phân lập đƣợc chƣa cao nhƣng hoạt tính chủng thu nhận đƣợc cao hoạt tính chủng chi, loài mà số tác giả khác nghiên cứu Một nghiên cứu tác giả Đặng trung thành ( tạp chí khoa học, 2008) nghiên cứu thu nhận chitinase đối tƣợng khoai lang thu đƣợc chitin có hoạt độ cao 192 UI/ml, cao nhiều so với hoạt độ chitin mà cac chủng nấm nghiên cứu thu đƣợc Tuy nhiên Enzyme chitinase đối tƣợng khác khác hoạt độ khác Hoạt độ enzyme chitinase chủng nấm phân lập đƣợc chƣa cao, nhƣng xác định đƣợc chủng nấm có hoạt tính chitinase ổn định, tùy môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy khác mà hoạt độ, hoạt tình biểu chủng khác 46 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Đã phân lập tuyển chọn đƣợc chủng nấm có khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm sợi Rhizopus Oryzae sinh tổng hợp enzyme chitinase tốt điều kiện nuôi cấy 35oC, pH môi trƣờng 5,5, lƣợng chitin dịch 1% Thời gian ni cấy 72h chủng tốt điều kiện , tất chủng nấm sợi phân lập đƣợc dùng để nghiên cứu thí nghiệm Các chủng khác có hoạt tính hoạt độ Chitinase tốt, mạnh điều kiện 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục khảo sát điều kiện, khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm mốc - Tiếp tục nghiên cứu khả ứng dụng rộng rãi enzyme lĩnh vực ngày - Do điều kiện, khả năng, số sai xót, khó khăn khác q trình làm thí nghiệm mà kết cịn sai lệch nhiều, kính mong thầy xem xét, góp ý, sửa chữa rút kinh nghiệm giúp cho thân tơi để thí nghiệm sau đƣợc trọn vẹn 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Khƣu Phƣơng Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học NXB Giáo dục [3] Nguyễn Lân Dũng tác giả khác (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 2, tập 3) NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [4] Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase Trichoderma vai trò kiểm soát sinh học Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh [5] Đinh Minh Hiệp (2004), Nghiên cứu quy trình tách chiết ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm mật (coprinus fimentarius) Báo cáo tổng kết nghiệm thu, Sở khoa học công nghệ TP HCM, tr153-160 [6] Trƣơng Phƣớc Thiên Hồng (2007), Khảo sát hoạt tính số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ loại đất khác thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh thạc sĩ sinh học, trƣờng đại học bách khoa hà nội [7] Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống aspergillus, trichoderma ứng dụng Luận văn thạc sĩ sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh [8] Nguyễn Bảo Hƣng (2010), Tách dòng biểu gen chitinase từ chủng nấm trichoderma Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Huế [9] Nguyễn Ngọc Tâm Huyên, Phạm Thị Ngọc Lan, Tìm hiểu hoạt tính chitinase số chủng xạ khuẩn Hội nghị khoa học toàn quốc viện sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ [10] Tô Duy Khƣơng (2004), Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [11] Nguyễn Đức Lƣợng (2004), Công nghệ vi sinh (tập 2) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [12] Nguyễn Đức Lƣợng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [13] Đặng Vũ Hồng Miên, Hệ nấm mốc việt nam NXB Khoa học Kỹ thuật [14] Nguyễn Nhu Nhƣờng (2008), nghiên cứu thu nhaanh enzyme chitinase vi khuẩn phân lập từ đất thuộc tỉnh khánh hòa Đồ án tốt nghiệp, đại học Nha Trang [15] Hoàng Nữ Lệ Quyên (2015), nghiên cứu thu nhận N-acetyl-DGlucosamine từ dịch thủy phân chitin enzyme chitinase Luận văn [16] Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB Giáo dục [17] Lê Ngọc Tú tác giả khác (1982), Enzym vi sinh vật (tập 1, tập 2) NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng anh [18] A Kapat, T Panda, S.K Rakshit (1996), Parameters optimization of chitin hydrolysis by Trichoderma harzianum chitinase under assay conditions Bioprocess Engineering 14, p.275-279 [19] Crispinus A Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride The Journal of Genaral anh Applied Microbiology Vol 47 No 2, p.53-61 [20] A A Shubakov and P S Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Fila mentous Fungi Applied Biochemistry and Microbiology Vol 40 No 5, p.445-447 [21] Daizo Koga (2005), Application of Chitinase in Agriculture Journal of Metals, Materials anh Minerals Vol 15 No 1, p.33-36 [22] Maria Swiontek-Brzezinska, Elzbieta Lalke-Porczyk, Wojciech Donderski (2007), Chitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons International Journal of Oceanography and Hydr obiology Vol XXXVI, No.3, p.101-111 [23] Nopakarn Rattanakit, Abhinya Plikomol, Shigekazu Yano, Mamoru Wakayama, and TakashiTachiki (2002), Ultilization of Shrimp Shellfish Waste as a Substrate for Solid-State Cultivation of Aspergillus sp S1-13: Evaluation of a Culture Based on Chitinase Formation Which is Necessary for Chitin-Assimilation Journal of Bioscience and Bioengineering Vol 93, No 6, p 550-556 [24] Neetu Dahiya, Rupinder Tewari, Gurinder Singh Hoodal (2006), Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review Applied Microbiology Biotechnology, p.773-782 Tài liệu mạng [25] http://www.moi.gov.vn [26] http://www.Roorthing-biochem.com/default.htlm [27].http://www.moit.gov.vn/vsi_portlets/UserFiles/File/Danhsachtuyenc hon.doc [28] http://www.webtretho.com/forum/register.php [29] http://hoahocvietnam.com.vn [30] http://www.ecfg10.info/images/Asperfest7Program.pdf [31] http://www.spices.res.in/spicebioinfo/project/chitinase/result.php [32] http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzymeexplorer/learningcenter/carbo hydrate-analysis/carbohydrate-analysisii.html [33] http://www.oligophar.ru [34] http://www.ecfg10.info/images/Asperfest7Program.pdf [35].http://www.igb.fraunhofer.de/www/gf/molbiotech/weissebiotech/en/ Chitin.en.html [36] http://www.ozemail.com.au/zadco/trichoderma.htm [37] http://www.tai-lieu.com/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-chitin-chitosan5628/ PHỤ LỤC Phụ Lục 1: Pha hóa chất 1.1 Pha dung dịch đệm phosphate Dung dịch đệm phosphate có ký hiệu hóa học NaH2PO4 - Để pha dung dịch NaH2PO4 0,2M: Hòa tan 27,8g NaH2PO4 500ml nƣớc cất (dung dịch a) - Dung dịch Na2HPO4 0,2M: Hòa tan 71,7g Na2HPO4 12H2O 500mlnƣớc cất (dung dịch b) Cũng nhƣ dung dịch Na2HPO4, dung dịch đệm phosphat có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch a số ml dung dịch b với tổng thể tích 200ml Bảng 1a Tỷ lệ số ml cần bổ sung để dung dịch đệm theo pH cần dùng A b Ph A b pH a b pH a b pH 93,5 6,5 5,6 77,5 22,5 6,3 45,0 55,0 6,9 16,0 84,0 7,5 92,0 8,0 5,8 73,5 26,5 6,4 39,0 61,0 7,0 13,0 87,0 7,6 90,0 10,0 5,9 68,5 31,5 6,5 33,0 67,0 7,1 10,5 89,5 7,7 87,7 12,3 6,0 62,5 37,5 6,6 28,0 72,0 7,2 8,5 91,5 7,8 85,0 15,0 6,1 56,5 43,5 6,7 23,0 77,0 7,3 7,0 93,0 7,9 81,5 18,5 6,2 51,0 49,0 6,8 19,0 81,0 7,4 5,3 94,7 8,0  Pha dd đệm phosphate pH ta hút 5,3 ml dd a (NaH2PO4) sau bổ sung thêm 94,7 ml dd b (Na2HPO4) Rồi đong nƣớc lên đến 200 ml khuấy ta đƣợc đệm phosphate pH 1.2 Pha thuốc thử DNS + Dung dịch A: hòa tan 300g muối Na-K tartrat kép vào 500ml nƣớc cất + Dung dịch B: hòa tan 10g 3,5-dinitrosalicylic acid vào 200ml dung dịch NaOH 2N Thuốc thử DNS dùng phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nƣớc cất cho đủ lít Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trƣớc sử dụng, bảo quản chai nâu tránh khơng khí  Pha cụ thể nhƣ sau: 5,3g DNS + 9,9g NaOH + 153g K- Na- tartrat + 4,15g Na2S2O5 + 1L H2O 1.3 Pha dung dịch Lugol Iod: 2,5g , KI: 5g , Nƣớc: 1000ml Phụ Lục 2: Một số môi trƣờng nuôi cấy chủng nấm sợi cụ thể dùng để phân lập 2.1 Môi trường nuôi cấy giữ giống nấm mốc MT (MT Nuôi cấy nấm): Thạch khoai tây Dextrose (PDA) [3, 6,12] Nƣớc chiết khoai tây: 200ml Agar: 7,5g Sucrose: 20g Nƣớc: 1000ml pH = 5,5 – 6,0 Khử trùng 1atm/30 phút 2.1.2 MT (MT giữ giống nấm): Agar Spezieller Nahrstoffarmer (SNA) KH2PO4: 1g Glucose: 0,2 g KNO3: 1g Sucrose: 0,2 g MgSO4.7H2O: 0,5g H2O: 1000 ml KCl: 0,5g pH = 5,5- Khử trùng 1atm/30 phút 2.2 Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase [5, 10,12] 2.2.1 MT 3: MT Czapek cải tiến NaNO3 : 3,5g FeSO4.7H2O: 0,01g K2HPO4 : 1,5g Dịch chitin 1%: 30 ml MgSO4.7H2O: 0,5g Nƣớc: 1000ml KCl: 0,5g pH = 5,5 Khử trùng 1atm/30phút Sucrose: 20g 2.3 MT4: Mơi trường thử hoạt tính Nƣớc: 1L; Agar: 20g; DD chitin: 30-40 ml pH =5,5 Phụ lục 3: Các hình ảnh q trình tiến hành thí nghiệm 3.1 Q trình thu chất chitin Hình 3a Mai cua ngâm HCl Hình 3b mai cua ngâm NaOH Hình 3c Chitin thô sau sấy xong 3.2 Sinh khối dịch enzyme ngoại bào môi trường nuôi lỏng sau ngày Hình 3.d Dịch enzyme ngoại bào sinh từ chủng nấm khác sau ngày nuôi cấy 3.4 Kết ly tâm dịch enzyme ngoại bào để thử hoạt tính 3.4.1 Dịch ni lỏng sau ly tâm Các chủng đƣợc kí hiệu theo số thứ tự kí hiệu ống giữ giống Hình 3.e Dịch enzyme ngoại bào từ môi trường nuôi lỏng sau ly tâm