Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng bacillus sinh tổng hợp poly gamna glutamic acid

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, trƣớc hết xin gửi đến cô -TS Nguyễn Nhƣ Ngọc, ngƣời giúp đỡ, tận tình hƣớng dẫn theo dõi sát lời cảm ơn sâu sắc Tôi xin gửi đến nhà trƣờng, quý thầy, cô giáo viện Công nghệ sinh học nói chung, phịng Vi sinh - Hóa sinh nói riêng lời cảm ơn chân thành tạo cho tơi có hội đƣợc th c đề tài, thể s sáng tạo nơi mà tơi u thích, để tơi có hội áp dụng kiến thức mà thầy cô giáo truyền đạt Thơng qua q trình th c đề ta, tơi học hỏi đƣợc nhiều điều rút cho nhiều kinh nghiệm q báu để giúp ích cho cơng việc sau thân Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình th c hiện, hồn thiện đề tài khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp từ thầy, Sinh viên thực hiện! Nguyễn Thị Hảo i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii N MỤ UV V T T T iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ ƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Poly-γ- glutamic acid (γ-PGA) 1.1.1 Giới thiệu poly gamma glutamic acid 1.1.2 Tính chất γ-PGA 1.1.3.Phân oại 1.1.4 chế sinh tổng hợp γ-PGA 1.2 Ứng dụng γ-PGA 1.2.1 Trong ĩnh v c y học: 1.2.2 Trong dƣợc phẩm 10 1.2.3 Trong m phẩm 10 1.2.4 Trong xử ý môi trƣờng 11 1.2.5 Trong nông nghiệp ch n nuôi 12 1.2.6 Trong công nghiệp th c phẩm 12 1.3 Vi sinh vật có khả n ng tổng hợp γ-PGA 14 1.3.1 Bacillus subtilis 14 1.3.2 Bacillus licheniformis 15 1.3.3 ác vi khuẩn khác 15 1.4 Tình hình nghiên cứu γ-PGA 16 1.4.1 Trên giới 16 1.4.2 Ở Việt Nam 18 ƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘ UNG, P ƢƠNG P P NG ÊN ỨU 21 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 ii 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3 Vật liệu nghiên cứu 21 2.3.1 Nguồn mẫu 21 2.3.2 Hóa chất 21 2.3.3 Dụng cụ-thiết bị 21 2.3.4 Môi trƣờng nuôi cấy 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phƣơng pháp phân ập vi sinh vật 23 2.4.2 Tuyển chọn chủng có khả n ng γ-PGA 24 2.4.3 Phƣơng pháp nhuộm Gram 26 2.4.4 Phƣơng pháp xác định số đặc điểm hóa sinh vi sinh vật 26 ƢƠNG 3: T QUẢ V T ẢO U N 32 3.1 Kết phân lập vi sinh vật có hoạt tính γ-PGA 32 3.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn ạc 32 3.1.2 Kết nhuộm Gram 34 3.2 Kết xác định hoạt tính γ-PGA 39 3.2.1 Kết khả n ng tạo màng chủng vi sinh vật 39 3.2.2 Kết khả n ng tạo độ nhớt chủng vi sinh vật: 41 3.2.3 Kết chạy sắc ký: 42 3.3 Xác định đặc tính sinh hóa 43 3.3.1 n ng ên men oại đƣờng 43 3.3.2 Kết phản ứng MR phản ứng VP 43 3.3.3 Kết khả n ng sinh tổng hợp enzyme khác: protease, catalase, amylase, cellulase, nitratase 44 ƢƠNG 4: T LU N VÀ KI N NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LI U THAM KHẢO iii N MỤ γ-PGA Gamma poly glutamic acid PGA Poly glutamic acid γ-GTP γ-glutamyltranspeptidase TCA Tricarboxylic acid CMC Carboxyl Methyl Cellulose ATP Adenosine triphotphate D-PGA D-po y γ-glutamic acid L-PGA L-po y γ-glutamic acid D,L-PGA D,L-po y γ-glutamic acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid v/p Vịng phút g/l Gam LB Mơi trƣờng ysogeny roth iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn 32 Bảng 3.2: Kết nhuộm Gram chủng vi sinh vật 34 Bảng 3.3: Khả n ng tạo màng chủng vi sinh vật 39 Bảng 3.4: Kết đo độ nhớt ( đơn vị: cst) 41 v DANH MỤC HÌNH ình 1.1: ấu trúc γ-PGA ình 1.2: Sơ đồ hình thành γ-PGA ình 1.3: Phản ứng po ymer hóa γ-PG nhờ TP ình 2.1- ấu tạo nhớt kế mao quản 24 ình 3.1: Ảnh chụp khuẩn ạc số chủng vi khuẩn 34 Hình 3.3: Ảnh chụp tạo màng số chủng vi sinh vật môi trƣờng đặc hiệu 40 Hình 3.4: Kết chạy sắc ký mỏng dịch thủy phân 42 Hình 3.5: Khả n ng phân giải đƣờng chủng TB 43 Hình 3.6 : Kết phản ứng MR 44 Hình 3.7 : Kết phản ứng VP 44 Hình 3.8: Kết định tính khả n ng sinh số enzyme khác chủng TB1 46 vi ĐẶT VẤN ĐỀ iện nay, khoa học công nghệ ngày phát triển ứng dụng chúng đời sống ngày quan trọng ác hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần thay hợp chất có nguồn gốc hóa học S phát triển cơng nghệ sinh học giúp xã hội phát triển theo hƣớng an tồn với t nhiên q trình tổng hợp hợp chất t nhiên từ vi sinh vật mục tiêu hƣớng đến nhà nghiên cứu ác hợp chất có nguồn gốc t nhiên đƣợc thu nhận từ vi sinh vật nhờ việc tổng hợp từ trình sống phát triển chúng So với hợp chất đƣợc tổng hợp đƣờng hóa học, chất đƣợc tổng hợp phƣơng pháp sinh học có ƣu điểm vƣợt trội nhƣ: thân thiện với mơi trƣờng, an tồn cho ngƣời động vật, mang tính bền vững xit po y γ-g utamic (γ-PGA) số hợp chất nhƣ Nó po yme đƣợc tạo cách sử dụng axit g utamic thông qua phƣơng thức tổng hợp hóa học sử dụng vi sinh vật có khả n ng tổng hợp po yme Với chất po yme có khả n ng phân hủy, không độc với ngƣời, t nhiên nên γ-PG đƣợc nghiên cứu ứng dụng nhiều ĩnh v c đời sống Tuy nhiên, việc nghiên cứu phát triển γ-PG nƣớc ta chƣa đƣợc quan tâm nhiều Theo số tài iệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả n ng sinh tổng hợp γ-PGA phân ập đƣợc từ sản phẩm th c phẩm truyền thống Việt Nam nhƣ Tƣơng ần, Nƣớc Mắm, hao… Xuất phát từ nhu cầu sử dụng th c tế nhƣ ợi ích âu dài sau này, cần có nghiên cứu rộng tính chất ƣu việt vi khuẩn Bacillus nhƣ sản phẩm vi khuẩn tạo ơn nữa, việc tạo sản phẩm có nguồn gốc từ q trình ên men xu hƣớng phát triển tính an tồn, khả n ng ứng dụng cao, chi phí sản xuất thấp than thiện với môi trƣờng Để đáp ứng nhu cầu đề tài “ ci inh t n h hiên c y t h n t yển chọn ch n ic ci ” đời nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có khả n ng sinh γ-PG từ nguồn sản phẩm truyền thống Việt Nam ƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Poly-γ- glutamic acid (γ-PGA) 1.1.1 Giới thiệu poly gamma glutamic acid Axit polyglutamic (PGA) polymer axit glutamic Nó dạng liên kết peptide nằm nhóm amino glutamic acid nhóm carboxyl cuối chuỗi γ-PGA đƣợc hình thành từ 10.000 phân tử axit g utamic Đây biopolymer t nhiên đƣợc tạo thành nhờ s po ymer hóa axit L-glutamic, axit D-glutamic hai S khác biệt có đƣợc vi khuẩn tổng hợp nên γ-PGA có khả n ng chuyển hóa tr c tiếp hay gián tiếp axit L-glutamic thành axit D-glutamic hai dạng đồng trùng hợp tạo D,L-γ-PGA gọi chung γ-PGA [43] γ-PGA Hình 1.1: γ-PGA sản phẩm sinh học tổng hợp t nhiên đƣợc phát vonovics ruckner Nó đƣợc chiết xuất từ loại th c phẩm truyền thống Nhật tên Natto, đời cách 800 n m Natto đƣợc sản xuất từ đậu nành lên men khuẩn que Bacillus Natto Natto chứa với hàm ƣợng cao vitamin 2, 6, 12, E, 2, γ-PGA nhiều loại men tiêu hóa khác Phần chất keo Natto γ-PGA, mà trƣớc ngƣời ta biết đến chất có tác dụng tốt việc ng n chặn tình trạng tắc nghẽn mạch máu… Từ chất keo Natto này, nhà khoa học Nhật nghiên cứu chiết chất γ-PGA, từ đƣợc Giải thƣởng Vàng cơng nghệ sinh học Nhật Bản 2003 [2] γ-PG đƣợc sản xuất chủ yếu vi khuẩn Gram dƣơng, bao gồm chi Bacillus Nó đƣợc báo cáo loại vi khuẩn Gram âm (Fusobacterium nucleatum), số vi khuẩn cổ sinh vật nhân chuẩn có khả n ng sản xuất γ-PGA Khả n ng tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2 nhóm αOO γ-COOH theo thứ t giảm dần theo mạch hi iên kết α-NH2 với α- COOH tạo nên liên kết α-peptid tạo sản phẩm α-PGA thông qua phản ứng hóa học cách trùng hợp nucleophile (chất cho e ectron) Nhƣng có đƣợc hệ xúc tác thích hợp, nhóm α-NH2 liên kết với nhóm γ- OO để tạo nên liên kết γ-peptid tạo sản phẩm γ-PGA G utamate đƣợc polymer hóa bên tế bào thông qua mối liên kết γ-amide, tổng hợp cách độc lập với ribosome nên s hình thành γ-PGA khác với s hình thành protein Do vậy, chất ức chế protein ví dụ nhƣ chloramphenicol khơng ảnh hƣởng đến việc tổng hợp γ-PGA [3] Do có tính chất phân huỷ sinh học, khơng độc hại không gây miễn dịch, γ-PGA đƣợc sử dụng ngành công nghiệp th c phẩm, y tế nƣớc thải Trong số ứng dụng khác, có tiềm n ng đƣợc sử dụng để kết tinh protein, nhƣ chất kết dính mơ mềm vec-tơ khơng virut để cung cấp gen an tồn ác ứng dụng γ-PGA sử dụng đặc tính cụ thể hình thức khác γ-PGA iện nay, cần phải nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn để sản xuất γPG có n ng suất cao với tính chất khác Nhiều ứng dụng y tế (đặc biệt phân phối thuốc) khai thác α-PGA Vì γ-PGA th c chất khác với αPG (nó khơng iên quan đến bƣớc điều chỉnh hóa học khơng nhạy cảm với proteases) nên đƣợc sử dụng tốt ứng dụng y học nhƣ Phân tích sản xuất γ-PGA kiến thức enzyme gen iên quan đến sản xuất γ-PGA không giúp t ng n ng suất, giảm chi phí sản xuất mà giúp hiểu đƣợc chế hoạt động γ-PGA để ứng dụng rộng rãi γ-PGA 1.1.2 γ-PGA có tên gọi khác nhƣ gamma po yg utamic axit (γ-PGA), axit Gamma polyglutamic, Gamma polyglutamate, poly imino [1-carboxy-4oxo-1, 4-butanediyl] Khối ƣợng trung bình chúng từ vài k a đến hàng triệu k a ích thƣớc khối ƣợng γ-PGA đa dạng phụ thuộc vào cấu trúc nhƣ dạng liên kết với chất khác canh trƣờng vi sinh vật Nhìn chung phân tử D,L- γ-PG thƣờng có khối ƣợng lớn nhiều so với D-γ-PGA -γ-PG , dạng neo giữ thƣờng có kích thƣớc nhỏ so với dạng t T y vào điều kiện mơi trƣờng hình thành khác mà γ-PGA có dạng hình thể cấu trúc xoắn α, th ng β, xoắn cuộn liên tục ngẫu nhiên, cuộn ngẫu nhiên, bao phủ thành khối [1] γ-PGA polyme t nhiên, dạng tinh thể màu trắng, không màu, khơng mùi, khơng vị, bị phân hủy sinh học, không độc với môi trƣờng, sinh vật ngƣời, có khả n ng hịa tan nƣớc khả n ng dẫn điện γPG hòa tan nƣớc tạo nên liên kết bền vững với nƣớc đồng thời đƣợc phân cách với thành phần trung tính khác nhờ sắc ký giấy Các liên kết α-peptide γ-PGA bị phân cắt sinh học enzym γ -GTP (γ-glutamyltranspeptidase) mà không bị phân cách protease γ-PGA khác với protein cấu trúc tính chất γ-PG có độ nhớt cao nồng độ thấp ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp đo độ nhớt để xác định γ-PGA [31,43] γ-PGA không phản ứng với Coomasie Blue, có phản ứng với số ion kim loại để tạo muối dạng phức với ion Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+ Tính chất đƣợc ứng dụng rộng rãi ngành môi trƣờng, y tế, dƣợc phẩm, m phẩm γ-PG đƣợc cấu trúc hoàn toàn đơn phân -γ-PGA L-γ- PGA riêng rẽ có khả n ng tan ethano Nhƣng chúng hỗn hợp đ ng mol bị kết tủa ethanol [28,43] Từ bảng 3.3 hình 3.3 cho thấy 17 chủng vi khuẩn gram dƣơng có chủng có khả n ng phát triển mạnh, lớp màng nhầy nhiều môi trƣờng đặc hiệu chủng: T 1,T 3, N 6, N 1, N 5, T 9, chủng T 1, N 1, N khả n ng tạo màng nhầy ớn xảy 96 độ nhớt c a ch ng vi sinh vật: 3.2.2 K t qu kh B ng 3.4: Kết qu STT o ộ nh ( ị: cst) Ch ng 24h 48h 72h 96h 120h Đ i ch ng 1,004 1,004 1,004 1,004 1,004 TB 1,7011 2,1322 2,2836 2,6798 2,0623 TB 1,3049 1,3981 1,4214 1,4564 1,3865 TB 1,3049 1,4680 1,5147 1,7943 1,5263 TB 1,2234 1,3515 1,3748 1,4797 1,3049 TB 1,3981 1,5030 1,6079 1,6661 1,4447 TB 1,5729 1,6894 1,7593 1,9108 1,6778 TB 1,2350 1,4214 1,6195 1,6545 1,4564 TB 10 1,2700 1,3166 1,3748 1,5263 1,3748 ND 1,1302 1,5263 1,6312 1,9108 1,3748 10 ND 1,1651 1,9224 1,2467 1,2700 1,1884 11 ND 1,2583 1,4447 1,4797 1,6312 1,3748 12 ND 1,2583 1,3049 1,3865 1,4098 1,3515 13 ND 1,3399 1,4913 1,5147 1,6428 1,3748 14 ND 1,2234 1,2933 1,3748 1,5380 1,2467 15 ND 1,7477 2,1322 1,5846 1,8409 1,4564 16 ND 1,3515 1,2234 1,2700 1,3865 1,1302 17 ND 1,1651 1,2234 1,2933 1,3748 1,2001 41 Kết từ bảng 3.4 cho thấy: Trong số 17 chủng đƣợc nuôi môi trƣờng đặc hiệu E, độ nhớt canh trƣờng nuôi cấy t ng mạnh khoảng 72-96 giờ, đạt c c đại thời điểm 96 Chủng TB tạo đột nhớt lớn nhất, chủng ND tạo độ nhớt thấp Phƣơng pháp sử dụng độ nhớt để đánh giá khả n ng sinh tổng hợp γ-PGA mang tính chất định tính, đƣợc nhiều nghiên cứu sử dụng nhƣ “thƣớc đo” γPGA [23] Tuy nhiên, chƣa thể kết luận đƣợc có γ-PGA dịch nhớt canh trƣờng hay không Cần tiến hành kết tủa phần dịch nhớt, thủy phân HCl 6N, dịch thủy phân đƣợc tiến hành chạy sắc ký mỏng với chất chuẩn glutamic acid, chất hiển thị màu ninhydrin để xác định s có mặt γ-PGA [50] 3.2.3 K t qu ch y sắc ký: M Hình 3.4: K t qu ch y sắc ký b n mỏng dịch th y phân h th ch M: chất chuẩn 1, 2: vị trí tra mẫu dịch thủy phân Hình 3.4 cho thấy b ng chạy dịch nhớt sau thủy phân từ chủng TB xuất vết tƣơng đƣơng với vị trí chất chuẩn acid glutamic Vì xác định dịch nhớt canh trƣờng lên men có chứa γ-PGA 42 3.3 ị ặc tính sinh hóa đư ng 3.3.1 Chủng TB đƣợc kiểm tra khả n ng ên men oại đƣờng glucose, lactose, saccarose, D-Fructose cách quan sát s thay đổi màu môi trƣờng: Hình 3.5: Kh h n â ường c a ch ng TB t: Quan sát màu sắc thấy, ống nghiệm đối chứng không đƣợc bổ sung vi sinh vật nên có màu đỏ Các ống nghiệm chứa đƣờng glucose, lactose, saccarose, D-Fructose có màu vàng, tức phản ứng dƣơng tính Từ kết hình 3.4 cho thấy chủng TB có khả n ng đồng hóa loại đƣờng 3.3.2 Kết qu ph n ng MR ph n ng VP Chủng TB đƣợc ni lắc mơi trƣờng sau đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MR-VP Broth Thử phản ứng MR VP, ta thu đƣợc kết dƣới đây: 43 Hình 3.6 : K t qu ph n ng MR Hình 3.7 : K t qu ph n ng VP Qua hình 3.6 3.7 cho thấy kết thí nghiệm dƣơng tính, mơi trƣờng chuyển sang màu đỏ Ống đối chứng không bổ sung vi sinh vật nên có phản ứng âm tính Vì vậy, kết luận chủng TB1 có xảy phản ứng MR VP 3.3.3 K t qu kh ng h p enzyme khác: protease, catalase, amylase, cellulase, nitratase Các chủng vi sinh vật thƣờng có hoạt tính đa dạng nên TB đƣợc thử nghiệm phản ứng kiểm tra khả n ng sinh tổng hợp enzyme khác để hồn thiện theo khóa phân loại ergey’s Đồng thời có kết luận sơ khả n ng sinh enzyme khác chủng 44 Amylase Protease Catalase Cellulase 45 Đ C TB Đ Urease TB Nitratase H ìn h :K ế tq u đ ả ịn h tíkả n ă g sin h m tố ộ se nzym e ch ủ n g B T Theo kết hình 3.8, chủng TB ngồi hoạt tính khả n ng sinh tổng hợp γ-PGA cịn có khả n ng sinh enzyme: protease, catalase, cellulase, amylase, urease, nitrase  Ta có bảng tổng kết đặc tính sinh hóa chủng TB 1: STT 10 11 12 Phản ứng sinh hóa Catalase MR (Methyl Red) VP (Voges-Proskauer) Khử nitrate Amylase Saccarose Glucose Lactose D-Fructose Cellulase Protease Urease 46 Kết + + + + + + + + + + + + ƣới bảng số phản ứng sinh hóa Bacilus subtilis:  Chủng TB có nhiều đặc điểm phù hợp với Bacillus subtilis chủng có khả n ng sinh đa enzyme nên có tiềm n ng ứng dụng đa dạng Để định danh xác lồi vi khuẩn TB cần có nghiên cứu bổ sung đặc tính sinh hóa khác theo hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey xác định phƣơng pháp sinh học phân tử thơng qua phân tích trình t rDNA 16S 47 ƯƠNG 4: T LU N VÀ KI N NGHỊ 4.1 Kết lu n Qua trình th c đề tài, rút thu đƣợc kết nhƣ sau: - Đã phân ập đƣợc 19 chủng vi sinh vật từ nguồn tƣơng bần nƣớc đậu tƣơng ên men - Trong đó, tuyển chọn đƣợc chủng TB có khả n ng sinh γ-PGA cao chủng - Bằng phƣơng pháp xác định đặc điểm hình thái thơng qua số phản ứng sinh hóa định danh sơ đƣợc chủng TB thuộc chi Bacillus 4.2 Kiến nghị Vì hạn chế mặt thời gian, nên đề tài chƣa triển khai thêm đƣợc nhiều nội dung Để t ng hiệu ứng dụng đề tài này, đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm số nội dung nhƣ sau: - Định danh xác chủng vi khuẩn phƣơng pháp sinh học phân tử - Nghiên cứu ảnh hƣởng số điều kiện nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp axit poly  - glutamic chủng TB - Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy theo quy hoạch th c nghiệm phƣơng pháp toán học - Nghiên cứu thu nhận, tinh axit poly  - glutamic từ chủng TB - Ứng dụng chế phẩm γ-PGA ngành công nghiệp nhƣ đời sống 48 TÀI LI U THAM KHẢO ệ ệ Nguyễn hí ũng, Trần iên à, Đặng Thị Thu (2016) “Nghiên cứu sinh tổng hợp thu nhận axit po y gamma g utamic hƣớng ứng dụng th c phẩm” Nguyễn hí ũng, Đặng Thị Thu, Trần V n nh, Trần iên (2015) “Ứng dụng chế phẩm axit po y gamma g utamic để cải thiện chất ƣợng cảm quan nƣớc cam” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 26, 50-53 Nguyễn Quang uy (2004) “ Ho t tính b o vệ c a polyglutamic acid (PGA) ối v i papain chống l i tác dụng c a tia phóng x gamma” Tạp chí KHCNDHQGHN KHTN & CN TXX Số ê Phƣớc ƣờng, Lê Thị Xuân Thúy (2013), “Nghiên c u c i tiến kỹ thu t tuyển n i sử dụng axit gammachì t n n y t ic ể tách lo i than ho t tính ion c”, Tạp chí KHCN-DHDN, số 12 ệ Adetoro, O; Aditya, B; Irorere, V; Hill, D.; Williams, V and Iza, R (2015), "Polygamma-glutamic acid production, properties and applications", Microbiology 161 Akagi, T.; Matsusaki, M and Akashi, M (2010), "Pharmaceutical and Medical Applications of Poly Gamma Glutamic Acid", Amino Acid Homopolymers Occurring in Nature 15, pp 119-153 kishige, and aruki, T (1995), " etermination of γ-Polyglutamic Using Cetyltrimethylammonium Bromide", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 42(11), pp 878-886 Ashiuchi, M (2010), "Occurrence and Biosynthetic Mechanism of PolyGammaGlutamic Acid", Amino-Acid Homopolymers Occurring in Nature 15, pp 77-93 Ashiuchi, m; Soda, K and Misono, H (1999), "A Poly-γ-glutamate Synthetic System of Bacillus subtilis IFO 3336: Gene Cloning and Biochemical Analysis of Poly-γ- glutamate Produced by Escherichia coli Clone Cells", Biochemical and Biophysical Research Communications 263(1), pp 6-12 10 Ashiuchi, M.; Nawa, C.; Kamei, T.; Song, J J.; Hong, S P.; Sung, M H.; Soda, K.; Yagi, T and Misono, H (2001), "Physiological and biochemical characteristics of po y γ-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis", European Journal of Biochemistry 268(20), pp 5321-5328 11 Ashiuchi, M.; Shimanouchi, K.; Horiuchi, T.; Kamei, T and Misono, H (2006), "Genetically Engineered Poly-gamma- glutamate Producer from Bacillus subtilis ISW1214", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 70(7), pp 1794-1797 12 Bajaj, I B and Singhal, R S (2010), "Effect of aeration and agitation on synthesis of po y γ-glutamic acid in batch cultures of Bacillus licheniformis NCIM 2324", Biotechnology and Bioprocess Engineering 15(4), pp 635-640 13 Bajaj, I B and Singhal, R S (2009), "Sequential Optimization Approach for Enhanced Production of Poly gamma Glutamic Acid from Newly Isolated Bacillus subtilis", Food Technology and Biotechnology 47(3), pp 313–322 14 Bajaj, I B and Singhal, R S (2011), "Poly gamma glutamic acid – An emerging biopolymer of commercial interest", Bioresource Technology 102(10), pp 5551- 5561 15 Bhattacharyya, D.; Hestekin, J A.; Brushaber, P.; Cullen, L.; Bachas, L G and Sikdar, S K (1998), "Novel poly-glutamic acid functionalized microfiltration membranes for sorption of heavy metals at high capacity", Journal of Membrane Science 141(1), pp 121-135 16 Bhunia, B.; Mukhopadhy, D G.; Mandal, T and Dey, A (2012), "Improved production, characterizationand f occu ation properties of po y (γ)-glutamic acid produced from Bacillus subtilis", Journal of Biochemical Technology 3(4) 17 Bovarnick, M (1942), "The formation of extracellular D-Glutamic acid polypeptide by Bacillus subtilis", J Biol.Chem 145, pp 415-421 18 Buescher, J M and Margaritis, A (2007), "Microbial Biosynthesis of Polyglutamic Acid Biopolymer and Applications in the Biopharmaceutical, Biomedical and Food Industries", Critical Reviews in Biotechnology 27(1), pp 1-19 19 Candela, T and Fouet, A (2005), "Bacillus anthracis CapD, belonging to the γ- glutamyltranspeptidase family, is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan", Molecular Microbiology 57(3), pp 717-726 20 Candela, T and Fouet, A (2006), "Poly-gamma-glutamate in bacteria", Molecular Microbiology 60(5), pp 1091-1098 21 Cromwick, A.M; Birrer, G.A and Gross, R.A (1996), "Effects of pH and aeration on γ-poly(glutamic acid) formation by Bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures", Biotechnology and Bioengineering 50(2), pp 222-227 22 Do, T H.; Suzuki, Y.; Abe, N.; Kaneko, J.; Itoh, Y and Kimura, K (2011), "Mutations Suppressing the Loss of DegQ Function in Bacillus subtilis (natto) 114 Poly-γ-Glutamate Synthesis", Applied and Environmental Microbiology 77(23), pp 8249-8258 23 Dubois, M; Gilles, K.A; Hamilton, J.K and Rebers, P.A (1956), "Calorimetric method for determination of sugars and related substances ", Analytical Chemistry 28, pp 350-356 24 Fukushima, T.; Kitajima, T.; Yamaguchi, H.; Ouyang, Q.; Furuhata, K.; Yamamoto, H.; Shida, T and Sekiguchi, J (2008), "Identification and Characterization of Novel Cell Wall Hydrolase Cwlt: A Two-Domain Autolysin Exhibiting N-Acetylmuramidase and Dl-Endopeptidase Activities", Journal of Biological Chemistry 283(17), pp 11117-11125 25 Goto, and unioka, M (1992), " iosynthesis and ydro ysis of Po y(γ- glutamic acid) from Bacillus subtilis IF03335", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 56(7), pp 1031-1035 26 Hara, T.; Fujio, Y and Ueda (1982), "Polyglutamate production by bacillus subtilis (natto)", J Appl Biochem 3, pp 112-120 27 Hiroyuki, T (2010), "Food Applications of Poly-Gamma-Glutamic Acid", AminoAcid Homopolymers Occurring in Nature 15, pp 155-168 28 Ho, G H.; Ho, T I.; Hsieh, K H.; Su, Y C ; Lin, P Y ; Yang, J ; Yang, K and Yang, S (2006), "γ-Polyglutamic Acid Produced by Bacillus Subtilis (Natto): Structural Characteristics, Chemical Properties and Biological Functionalities", Journal of the Chinese Chemical Society 53(6), pp 13631384 29 House, W and Riley, D (1962), The biosynthesis of homopolymeric peptides, Biosynthesis, Vol 3, academic press, New York and London, 389-412 30 Hsieh, C.W; Lin, W.C; Hin, W.C; Huang, Y.P; Lai, C H and Ko, W C (2009), " mprovement of the stabi ity of nattokinase using γ-polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation", LWT - Food Science and Technology 42(1), pp 144-149 31 Huang, Ji.; Du, Y.; Xu, G.; Zhang, H.; Zhu, F.; Huang, L and Xu, Z (2011), "High yield and cost-effective production of po y(γ-glutamic acid) with Bacillus subtilis", Engineering in Life Sciences 11(3), pp 291-297 32 Ivanovíc, G and Erdos (1937), "Ein Beitrag zum Wesen der Kapselsubtanz des Milzbrandbazillus", Immunitatsforsch 90, pp 5-19 33 Judit, E.; Fleischer, R.; Levente, N and Janos, B (2006), "Poly gamma glutamic acid based crosslinked nanoparticles ", Polymer Preprints 47(1) 34 Jun, Y.; Hong, X.; Jun, W.; Min, J and Pingkai, O (2007), "Removal of r( ), Ni( ) and u( ) by po y(γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis NX-2", Journal of Biomaterials Science Polymer Edition 18(2), pp 193– 204 35 Kimura, K and Itoh, Y (2003), "Characterization of Poly-γ-Glutamate Hydrolase Encoded by a Bacteriophage Genome: Possible Role in Phage Infection of Bacillus subtilis Encapsulated with Poly-γ-Glutamate", Applied and Environmental Microbiology 69(5), pp 2491-2497 36 Kimura, K; Tran, L S P; Uchida, I and Itoh, Y (2004), "Characterization of aci us subti is γ-glutamyltransferase and its involvement in the degradation of capsule poly-γ-glutamate", Microbiology 150(12), pp 4115-4123 37 Manocha, B., Margaritis, A A Novel Method for the Selective Recovery and Purification gamma-Polyglutamic Acid from Bacillus licheniformis Fermentation Broth 2010 Biochemical 734-736 38 Mitsui, N; Murasawa, H and Sekiguchi, J (2011), "Disruption of the cell wall lytic enzyme CwlO affects the amount and molecular size of poly-gammaglutamic acid produced by Bacillus subtilis (natto)", The Journal of General and Applied Microbiology 57(1), pp 35-43 39 Ogawa, Y ; Yamaguchi, and Yuasa, T (1997), "Efficient production of γ- polyglutamic acid by Bacillus subtilis (natto) in jar fermenters.", Biosci Biotechnol Biochem 61, pp 1684-1687 40 Radu, J E F.; Novak, L.; Hartmann, J.; Beheshti, N.; Kjøniksen, A L.; Nyström, B and Borbély, J (2008), "Structural and dynamical characterization of polygamma-glutamic acid-based cross-linked nanoparticles", Colloid and Polymer Science 286(4), pp 365-376 41 Sawamura, S (1913), "On Bacillus Natto", J Coll Agric Tokyo 5(189191) 42 Shi, F; Xu, Z and Cen, P (2006), "Efficient production of poly-γ-glutamic acid by bacillus subtilis ZJU-7", Applied Biochemistry and Biotechnology 133(3), pp 271-281 43 Shih, I L and Van, Y T (2001), "The production of poly-(gamma-glutamic acid) from microorganisms and its various applications", Bioresource Technology 79(3), pp 207-25 44 Shih, I L.; Van, Y T and Chang, Y N (2002), "Application of statistical experimental methods to optimize production of po y(γ-glutamic acid) by Bacillus licheniformis CCRC 12826", Enzyme and Microbial Technology 31(3), pp 213- 220 45 Sung, M H.; Park, C.; Kim, C J.; Poo, H.; Soda, K and Ashiuchi, M (2005), "Natural and edible biopolymer poly-γ-glutamic acid: synthesis, production, and applications", The Chemical Record 5(6), pp 352-366 46 Suzuki, T and Tahara, Y (2003), "Characterization of the Bacillus subtilis ywt Gene, Whose Product s nvo ved in γ-Polyglutamic Acid Degradation", Journal of Bacteriology 185(7), pp 2379-2382 47 Tanaka, T.; Hiruta, O.; Futamura, T.; Uotani, K.; Satoh, A.; Taniguchi, M and Susumu, O (1993), "Purification and haracterization of Po y(γ-glutamic acid) Hydrolase from a Filamentous Fungus, Myrothecium sp TM-4222", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 57(12), pp 2148-2153 48 Tanimoto, H.; Mori, M.; Motoki, M.; Torii, K.; Kadowaki, M and Noguchi, T (2001), "Natto Mucilage Containing Poly- gamma- glutamic Acid Increases Soluble Calcium in the Rat Small Intestine", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65(3), pp 516-521 49 Tarui, Y; Iida, H.; Ono, E.; Miki, W.; Hirasawa, E; Fujita, K.; Tanaka, T and Taniguchi, M (2005), "Biosynthesis of poly-gamma-glutamic acid in plants: 119 transient expression of poly-gamma-glutamate synthetase complex in tobacco leaves", J Biosci Bioeng 100(4), pp 443-448 50 Troy, (1973), " hemistry and biosynthesis of po y γ g utamy capsule in Bacillus licheniformis", J Biol Chem 248, pp 305 - 316 51 Wan-Taek Ju, Yong-Su Song, Woo-Jin Jung, Ro-Dong Park (2014), “Enhanced production of po y-γ-glutamic acid by a newly-isolated Bacillus ti i ” 52 Wang, N.; Yang, G.; Che, C and Liu, Y (2011), "Heterogenous expression of poly-γ-glutamic acid synthetase complex gene of Bacillus licheniformis WBL-3", Applied Biochemistry and Microbiology 47(4), pp 381-385 53 Weber, J (1990), "Poly gamma-glutamic acids are the major constituents of nematocysts in Hydra (Hydrozoa, Cnidaria)", Journal of Biological Chemistry 265(17), pp 9664-9669 54 Wu, Q; Xu, H; Liang, J and Yao, J (2010), "Contribution of Glycerol on Production of Po y(γ-Glutamic Acid) in Bacillus subtilis NX-2", Applied Biochemistry and Biotechnology 160(2), pp 386-392 55 Wu, Q; Xu, ; Xu, and Ouyang, P (2006), " iosynthesis of po y(γ- glutamic acid) in Bacillus subtilis NX-2: Regulation of stereochemical composition of po y(γ- glutamic acid)", Process Biochemistry 41(7), pp 16501655 56 Zeng et al AMB Expr (2017) 7:213, “Production of po y-γ-glutamic acid by a thermotolerant glutamate-independent strain and comparative analysis of the g utamate dependent diference”