Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và định tên chủng bacillus có đặc tính probiotic địnhh hướng ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp giáo viên hƣớng dẫn tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn định tên chủng Bacillus có đặc tính probiotic định hƣớng ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi’’ Sau thời gian làm việc với tinh thần nghiêm túc tích cực đến đề tài hoàn thành Để có đƣợc kết trƣớc hết tơi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng Bộ môn Công nghệ Gen Th.S Nguyễn Thị Hồng Nhung thuộc môn Công nghệ Vi sinh- Hóa sinh – Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp ngƣời tận tình hƣớng dẫn suốt trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, ban lãnh đạo cán nhân viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Mặc dù cố gắng để hoàn thành đề tài song hạn chế mặt thời gian, kinh nghiệm thân điều kiện nghiên cứu nên tránh khỏi thiếu sót tồn định Tơi kính mong nhận đƣợc lời nhận xét, đóng góp ý kiến thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thảo i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I T NG QU N 1.1 Tổng quan Bacillus 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus 1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Baccillus 1.1.3 Cơ sở khoa học để lựa chọn chủng Bacillus sản xuất probiotic 1.1.4 Ứng dụng Bacillus chăn nuôi 11 1.2 Tổng quan Probiotic 12 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu , khái niệm phân loại 12 1.2.2 Vai trò Probiotic 13 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn vi sinh vật probiotic: 15 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh chăn nuôi 16 1.3.1 Trên giới 16 1.3.2 Ở Việt Nam 18 PHẦN MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu, dụng cụ hóa chất 20 2.4 Môi trƣờng nghiên cứu 21 2.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.5.1 Phân lập 21 2.5.2 Phƣơng pháp bảo quản giống 22 ii 2.5.3 Tuyển chọn chủng có đặc tính Probiotic 23 2.5.4 Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 29 2.5.5 Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi sinh vật 29 2.5.6 Định danh vi khuẩn phƣơng pháp sinh học phân tử 31 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn 33 3.2 Sàng lọc tuyển chọn chủng vi sinh vật có đặc tính làm probiotic 34 3.2.1 Khảo sát hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định 34 3.2.2 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào 36 3.2.3 Khảo sát khả chịu pH dày 38 3.2.4 Khảo sát khả chịu muối mật 39 3.2.5 Khả đề kháng chất kháng sinh chủng vi sinh 41 3.2.6 Xác định khả bám dính vào màng nhầy niêm mạc ruột 43 3.3 Đặc tính sinh lý sinh hóa chủng Probiotic 43 3.3.1 Định danh vi khuẩn phƣơng pháp sinh học phân tử 45 3.3.2 Tổng hợp số đặc tính probiotic chủng B.BP 48 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU TH M KHẢO iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Chú thích CFU Colony-Forming Unit CMC Carboxymethiylcellulose ĐC FAO Đối chứng Food and agriculture Organization of the United Nations Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên hiệp quốc MPA Meat-Peptone Agar TSA Trypcase Soya Agar TSB Trypton Soya Broth SDS Sodium dodecyl sulfate TB Tế bào VSV Vi sinh vật TE Tris EDTA PBS Phosphate Buffered Saline Ge Gentamycin TT Tetracycline St Streptomycin NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn 33 Bảng 3.2 Kết vòng kháng vi sinh vật kiểm định 35 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng vi sinh vật 36 Bảng 3.4 Tỉ lệ TB sống sót (%) chủng theo thời gian mức pH 38 Bảng 3.5 Tỉ lệ tế bào (%) chủng theo thời gian nồng độ muối mật khác 40 Bảng 3.6 Kết kháng kháng sinh chủng 41 Bảng 3.7 Khả bám dính màng nhầy niêm mạc ruột chủng vi sinh vật 43 Bảng 3.8 Khả lên men loại đƣờng chủng 44 Bảng 3.9 Các đặc tính probiotic chủng B.BP 48 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus Hình 3.1 Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định chủng Bacillus 36 Hình 3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào phân giải chất chủng Bacillus 37 Hình 3.3 Khả kháng kháng sinh chủng Bacillus 42 Hình 3.4 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng Bacillus B.BP 44 Hình 3.5 Khả lên men đƣờng chủng B.BP 44 Hình 3.6 Kết điện di tách chiết DN tổng số 45 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR chủng B.BP 45 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi từ chế phẩm sinh học phát triển áp dụng rộng rãi, số sử dụng trực khuẩn Bacillus thức ăn chăn ni Hằng năm, giới có hàng triệu gia súc, gia cầm chết bệnh đƣờng tiêu hóa nhƣ: bệnh tiêu chảy gặp nhiều lợn bò, bệnh phân trắng gà, bệnh đƣờng ruột khác Nguyên nhân chủ yếu vi sinh vật có hại xâm nhập vào thể vật chủ làm suy giảm miễn dịch giảm chức đƣờng ruột phần khác vi khuẩn gây bệnh nhƣ Ecoli, Salmonela làm suy yếu sinh vật có lợi đƣờng ruột, làm tổn thƣơng dẫn đến bệnh nhƣ tiêu chảy, nhiễm trùng đƣờng ruột Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh việc bổ sung vi khuẩn có lợi cho đƣờng ruột cần thiết từ nghành cơng nghiệp tạo men vi sinh ứng dụng vào thức ăn chăn nuôi đƣợc phát triển trọng Các vi sinh vật có ích hỗ trợ khơi phục lại cân đƣờng ruột Chính vậy, chế phẩm sinh học chứa lợi khuẩn probiotic có vai trị quan trọng sức khỏe Nó trì trạng thái cân vi khuẩn đƣờng ruột, tăng cƣờng sức khỏe đƣờng ruột, nhƣng tăng cƣờng hệ thống miễn dịch.Không vậy, chế phẩm sử dụng thức ăn chăn ni cịn có khả cải thiện sức khỏe vật nuôi, tăng chất lƣợng vật ni Bên cạnh đó, chế phẩm probiotic cịn góp phần mang lại sản phẩm chất lƣợng nghành chăn nuôi, mang lại nguồn thu không nhỏ cho kinh tế quốc dân Ngoài tác dụng probiotic cung cấp chất quan trọng cho thể nhƣ folic acid, niacin, riboflavin, vitamin B6 B12 Hiện nay, dạng chế phẩm sinh học từ Bacillus đƣợc sử dụng ngày phổ biến bệnh đƣờng ruột gia súc ƣu điểm thuận lợi cho việc sản xuất probiotic Từ lí này, đƣợc đồng ý Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh, Viện Cơng nghệ sinh học, trƣờng Đại học Lâm nghiệp, dƣới hƣớng dẫn PGS TS Bùi Văn Thắng Ths Nguyễn Thị Hồng Nhung thực đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn định tên chủng Bacillus có đặc tính probiotic định hƣớng ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi’’ N PHẦN I 1.1 Tổng quan Bacillus Q N 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus Bacillus đƣợc phát vào năm 1835 Christion Erenberg tên loài vi khuẩn lúc “Vibio subtilis” Năm 1872, Cohn đặt tên lại Bacillus subtilis (Gordon, 1981) Họ Bacillaceae đƣợc chia làm chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trƣng họ hình thành nội bào tử [1; 2] 1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Baccillus 1.1.2.1 Đặc điểm phân loại Theo khóa phân loại Bergey (2004) [20], Bacillus thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus 1.1.2.2 Đặc điểm phân bố Nhờ khả sinh bào tử nên Bacillus tồn thời gian dài điều kiện khác nhau.Chúng phổ biến tự nhiên nên phân lập từ nhiều nguồn khác nhƣ đất, nƣớc, khơng khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn, [1,4] 1.1.2.3 Đặc điểm hình thái đặc điểm ni cấy - Điều kiện phát triển nhiệt độ tối ƣu 370C - Nhu cầu CO2: vi khuẩn hiếu khí nhƣng lại có khả phát triển mơi trƣờng thiếu oxy - Độ pH: 7,0- 7,4 - Bacillus TB hình que, thẳng gần thẳng, kích thƣớc 0,3 - 2,2 x 1,2 -7 µm Các TB thƣờng xếp thành cặp hay chuỗi, đầu trịn vng Là vi khuẩn bắt màu Gram dƣơng, hầu hết có catalase dƣơng tính Chúng thƣờng di động nhờ roi Một TB hình thành nội bào tử, nội bào tử có hình oval hình trụ Bào tử có khả chịu nhiệt, axit, hình thành nội bào tử không bị ngăn cản tiếp xúc khơng khí Các lồi thuộc chi Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử mà giữ nguyên hình que mang bào tử, số trƣờng hợp phình to lên chút [24] Tùy theo lồi, bào tử nằm giữa, gần cuối, cuối [4; 5] - Hình dạng vi khuẩn môi trƣờng TSA (Trypcase Soya Agar) khuẩn lạc dạng trịn, rìa cƣa khơng đều, đƣờng kính 3-5 nm màu vàng xám, tâm sẫm màu Sau ngày bề mặt nhăn nheo, màu ngả nâu - Hình dạng vi khuẩn mơi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth) Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại nhƣ vẩn mây đáy, khó tan lắc 1.1.2.4 Đặc điểm sinh hóa - Lên men khơng sinh loại đƣờng nhƣ: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose arabinose - Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả di động (+) hiếu khí (+) Hình 1.1 Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus sống sót cao (>100%) [9] Cũng tƣơng tự với kết nghiên cứu tôi, nghiên cứu Kim cộng (2007), Trần Quốc Việt cộng (2008) cho thấy, chủng vi sinh vật thử nghiệm có khả tồn mơi trƣờng với nồng độ muối mật từ 0,3-0,5% [11] Ở nồng độ 1- 3% tỉ lệ sống sót tế bào giảm dần nhƣng đạt tỉ lệ cao (trên 50% nồng độ muối mật 0,5% đạt tỉ lệ từ 52 – 86% nồng độ – 2%) 3.2.5 Khả đề kháng chất kháng sinh chủng vi sinh Trong sở để chọn lọc đƣợc chủng probiotic tốt khả kháng chất kháng sinh yếu tố quan trọng Tôi tiến hành thử nghiệm với loại kháng sinh: Gentamycin, Tetracycline, Streptomycin loại kháng sinh đƣợc dùng phổ biến để chữa bệnh thƣờng gặp gia súc gia cầm [18] Vì vậy, tơi sử dụng với liều tối thiểu có khả ức chế phát triển vsv gây bệnh (5 - 30 µg/ml) Gentamycin (Ge) nồng độ 50 µg/ml , 10 µg/ml; Tetracycline (TT) nồng độ 50 µg/ml, 10 µg/ml Streptomycin (St) nồng độ 50 µg ml, 10 µg/ml[23] Kết đƣợc trình bày bảng 3.6 sau: Bảng 3.6 Kết kháng kháng sinh chủng STT Kí hiệu mẫu Tetracycline Gentamycin Streptomycin 50µg/ ml 10µg/ ml 50µg/ml 10µg/ml 50µg/ml 10µg/ml B.TH + + - + + + B.BP - + - + + + Ghi chú: +: Kháng -: Khơng kháng 41 Hình 3.3 Khả kháng kháng sinh chủng Bacillus Qua kết đƣợc ghi bảng 3.6 hình 3.3 tơi đánh giá khả kháng chất kháng sinh chủng nhƣ sau: + Chủng B.TH: Có khả kháng loại kháng sinh Streptomycine, Tetramycline, Gentamycin nồng độ 10 µg/ml 50 µg/ml Khơng kháng đƣợc Streptomycin, Tetracycline Gentamycin nồng độ 50 µg/ml + Chủng B.BP: Có khả kháng kháng sinh Tetramycline, Gentamycin nồng độ 10µg ml, Streptomycin nồng độ 50 µg/ml, 10 µg/ml, khơng kháng đƣợc Tetramycline Gentamycin nồng độ 50 µg/ml Như vậy, trình điều trị bệnh thƣờng gặp cho vật ni, phối hợp sử dụng chế phẩm probiotic với chất kháng sinh (Tetracycine, Streptomycin, Gentamycin) kháng sinh khơng có khả tiêu diệt làm hoạt tính chủng vi sinh vật hữu ích tuyển chọn đường ruột vật nuôi 42 Từ kết trên, định chọn lọc chủng B.TH, B.BP tiếp tục vào bƣớc chọn lọc 3.2.6 Xác định khả bám dính vào màng nhầy niêm mạc ruột Các chủng probiotic phát huy tác dụng có lợi lên vật chủ chúng định cƣ tồn ruột non để từ hình thành khuẩn lạc, tăng khả kết dính đƣờng ruột Khả bám dính vào màng nhầy niêm mạc ruột yếu tố quan trọng để chọn chủng có đặc tính probiotic Vì vậy, tơi tiến hành thí nghiệm thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.7 sau: Bảng 3.7 Khả bám dính màng nhầy niêm mạc ruột chủng vi sinh vật TT Ký hiệu chủng Nồng độ ban đầu Khả bám dính (CFU/ml) (CF /gam ruột) B.TH 4,3 × 1010 2,93 × 108 B.BP 5,36 × 109 4,05 ×108 Qua kết đƣợc ghi bảng 3.7 trên, nhận thấy: Cả chủng vi sinh vật đƣợc nghiên cứu có khả bám dính màng nhầy ruột non với mật độ cao, cụ thể nhƣ sau: mật độ tế bào chủng B.BP (4,05 ×108) cao so với chủng B.TH (2,93 × 108) - Mặt khác so sánh với kết nghiên cứu tác giả Trần Quốc Việt cs (2009) khả bám dính màng nhầy niêm mạc ruột chủng vi sinh vật probiotic [11], nhận thấy kết phù hợp Tổng hợp kết phần 3.2 (khả kháng vi sinh vật kiểm định, khả sinh enzyme ngoại bào, khả chịu pH thấp muối mật, khả kháng kháng sinh, khả bám dính), tơi định chọn chủng B.BP để nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh đến lồi phƣơng pháp sinh học phân tử 3.3 Đặc tính sinh lý sinh hóa chủng Probiotic Theo phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.5 tơi thu đƣợc kết trình bày hình 3.4 sau: 43 Hình 3.4 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng Bacillus B.BP 1: Hình th i tế ào; 2: Hình th i khuẩn ạc Bảng 3.8 Khả lên men loại đƣờng chủng Kí hiệu chủng B.BP Tên đƣờng Manitol + Glucose + Fructose + Sucrose + Lactose - Ghi chú: +: lên men đƣợc -: khơng lên men đƣợc Hình 3.5 Khả lên men đƣờng chủng B.BP Qua bảng 3.8 hình 3.5 tơi nhận thấy rằng: chủng B.BP có khả lên men loại đƣợc nhƣng đƣờng lactose khơng lên men đƣợc 44 3.3.1 Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử Các chủng B.BP đƣợc tách chiết DN theo phƣơng pháp 2.5.6.1 Sau thực phản ứng PCR theo phƣơng pháp 2.5.6.2 Kết thu đƣợc nhƣ hình 3.6 sau: Hình 3.6 Kết điện di tách chiết DNA tổng số Giếng 1: mẫu đối chứng âm c a vi khuẩn; Giếng 2: Ch ng Bacillus B.BP Kết hình 3.6 cho thấy, sau tách chiết DNA tổng số kết điện di chủng B.BP lên rõ, băng vạch sang bị đứt gãy Sản phẩm sau tách chiết đƣợc pha loãng 10 lần để thực phản ứng PCR 1500bp Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR chủng B.BP Giến 1: Th n DNA 100 p; Giến 2: Mẫu âm tính vi khuẩn; Giến 3: Ch n ci us P 45 Kết hình 3.7 cho thấy, giếng số (chủng Bacillus B.BP) cho sản phẩm PCR vạch kích thƣớc 1500 bp Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Trần Thị Bích Quyên phân lập định danh chủng vi sinh vật có đặc tính probiotic nghiên cứu đƣợc công bố Sản phẩm PCR chủng B.BP đƣợc gửi đến Công ty TNHH Phát Triển Công Nghệ Ứng Dụng Việt Nam, để định danh đến lồi cách giải trình tự gen 16S – rRN so sánh với ngân hàng gen Kết nhƣ sau: CAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGG CGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGAT AACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCAT GGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCC GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACG ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCA ATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTT TTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAA ATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGA ATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTG AAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACT TGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCT GTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGACTGCTGAGTGTTAGGA GGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAAGGCATTAAGCACTCCCTCTG CGGAGTACGGTCGCCAGACTGAAAATCAACCGAATTGATTGGGGCC GGGCCAATCAAAGGAG Chủng B.BP đƣợc xác định dựa quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào nhƣ có đƣợc số kết sinh hóa nêu phần 3.3 Chuỗi gen 46 16S rRN chủng cho thấy độ tƣơng đồng 99% với lồi Bacillus subtilis thơng qua BLAST Từ tơi kết luận chủng B.BP Bacillus subtilis gọi chủng Bacillus subtilis B.BP Qua tìm hiểu, tơi đƣợc biết Bacillus subtilis chủng phổ biến đất cỏ khô Bacillus subtilis lợi khuẩn tự nhiên có hệ vi sinh đƣờng ruột ngƣời vật ni Bacillus subtilis đƣợc sử dụng men vi sinh dạng nƣớc nhờ khả phát tán nhanh hệ tiêu hóa nhƣ có khả chịu đựng điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt, môi trƣờng acid hệ tiêu hóa ngƣời động vật Đƣợc ứng dụng rộng rãi sản xuất chế phẩm vi sinh, y học, thực phẩm có khả sinh loại enzyme nhƣ: celullase, protease, amylase, [15, 10] Ngoài ra, Bacillus subtilis chuyển hóa chất khó tiêu thành chất dễ tiêu góp phần cải thiện chất dinh dƣỡng , kích thích tiêu hóa thức ăn giúp vật nuôi tăng trọng nhanh, làm giảm mật độ vi sinh vật gây bệnh đẩy lùi đƣợc dịch bệnh Chính nhờ đặc tính ƣu việt tơi sử dụng chủng Bacillus subtilis B.BP ứng dụng để tạo chế phẩm vi sinh bổ sung thức ăn chăn ni 47 3.3.2 Tổng hợp số đặc tính probiotic chủng P Bảng 3.9 Các đặc tính probiotic chủng B.BP Đặc tính probiotic Đánh giá chung Khả đối Salmonella Trung bình (d = 18,5 mm) kháng với vi khuẩn Shigella Trung bình (d = 19 mm) kiểm định Ecoli Trung bình (d = 16,5 mm) Amylase Trung bình (d = 18,5 mm) Cellulase Trung bình (d = 19,5 mm) Protease Trung bình (d = 17 mm) pH = Đạt (51%) pH = Đạt (61,5%) pH = Đạt ( 65,4%) 0,5% Đạt (87,5%) Khả chịu 1% Đạt (74,1%) muối mật 2% Đạt (60,77%) 3% Đạt (50%) Tetracycline Đạt (10 µg/ml) Streptomycin Đạt (10 µg/ml 50 µg/ml) Gentamycin Đạt (10 µg/ml) Khả sinh enzyme ngoại bào Khả chịu pH thấp Khả kháng kháng sinh Khả bám dính niêm mạc Cao (4,05 × 108 CFU/ml) ruột Nhƣ vậy, thấy chủng Bacillus subtilis B.BP có đặc tính phù hợp để ứng dụng tạo chế phẩm probiotic sử dụng thức ăn chăn nuôi 48 PHẦN KẾ L ẬN VÀ KIẾN N HỊ 4.1 Kết luận Phân lập đƣợc 10 chủng nghi ngờ Bacillus từ nguồn: Đất, mẫu chế phẩm đƣợc kí hiệu: B.Đ, B.CP, B.TH, B.BP, B1, B2, B.VM, B.CL, B3, B4 Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus B.BP có hoạt tính Probiotic cao (khả kháng vi sinh vật kiểm định, sinh enzyme ngoại bào, chịu pH thấp muối mật, kháng kháng sinh, bám dính niêm mạc ruột cao) phù hợp để tạo chế phẩm Probiotic Nghiên cứu đƣợc đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng B.BP định danh đƣợc chủng Bacillus subtilis B.BP sinh học phân tử 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu đƣợc ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, phát triển chủng tối ƣu đƣợc điều kiện nuôi cấy chủng - Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm ứng dụng Bacillus thức ăn chăn nuôi 49 ÀI LIỆ H M KHẢO Tài liệu Tiếng việt Đào Thị Thanh Xuân (2008), Nghiên cứu s d ng nhóm VK Bacillus tạo chế phẩm sinh học x í mơi trườn nước ni th y sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Hà Nội Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phƣợng, Lê Ngọc Mỹ (1995), B nh đường tiêu hóa lợn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Thị Thu Nga (2011), Khảo sát khả năn sinh tổng hợp protease c a số ch ng Bacillus, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM Dƣơng Thị Toan (2015) Tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi lợn thịt, gà thịt số trại chăn nuôi địa bàn tinh Bắc Giang Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu, "Nghiên cứu khả sống mơi trƣờng đƣờng tiêu hóa động vật số chủng VSV nhằm bƣớc chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics," 82 - 84, Tạp chí khoa học, Trƣờng Đại học Nông lâm, Đại học Huế, 2009 Hội Nhi khoa Tp HCM (2007), Bacillus clausii vai trò probiotics điều trị tiêu chảy, Báo cáo hội thảo chuyên đề probiotic Lê Ngọc Tú, La Văn Phú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, Enzyme vi sinh vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật, 1982 Lƣơng Đức Phẩm (2007), Các chế phẩm sinh học ùn tron chăn nuôi nuôi trồng th y sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 112-152 Nguyễn Đức Quỳnh Nhƣ (2008), Phân lập sàng lọc số ch ng Bacillus có hoạt tính probiotic ni trồng th y sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM 10.Phạm Thị Trân Châu (2007), Công ngh sinh học (tập 3), NXB Giáo dục 11.Trần Quốc Việt c.s (2008), Nghiên cứu thông số kĩ thuật sản xuất probiotic dạng lỏng dạng bột ùn tron chăn nuôi, Báo cáo khoa học hàng năm, Viện Chăn nuôi, Viện VSV CNSH - Đại học Quốc Gia Hà Nội 12.Trần Thị Ái Liên, "Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic," Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM, 2011, pp - 9, 39 – 40 13.Trần Thị Thu Thủy (2003), "Khảo sát tác dụng thay Kháng sinh probiotic phòng ngừa tiêu chảy E.coli heo con," in Luận văn Thạc sĩ Kho học Nơng nghi p, Trƣờng ĐH Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh, 2003, pp 21 - 24 , 28 - 43 14.Trần Trƣờng Nhân (2009), Phân lập VK Bacillus subtilis từ phân heo đối kháng với E coli ứng d ng sản xuất probiotic, Luận văn tốt nghiệp ngành Kỹ sƣ Chăn nuôi-Thú Y, Trƣờng ĐH Nông lâm Tp HCM 15.Văn Thị Thủy (2011), Phân lập ch ng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao ni cá tra, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên 16.Văn Thị Thủy, Phân lập chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao ni cá tra, in Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Nông Lâm Tp HCM, 2011, pp 36, 52 – 54 Tài liệu Tiếng anh 17.Abou- Taleb, Khadia A.A., Mashhoor, W.A, Nasr, Sohair M.S and Abde-Azeem, Hoda H M (2009), Nutritional and Znviromental Factors Affecting Cellulase Production by two strains of cellulotylic bacilli, Aus J Basic and Applied sciences, 3(3), pp 2429-2436, 18.Badre Halimi, Carine Dortu, Anthong Argwelles Arias philippe Thonart, Bernard joris Patrick Pakes (2010), Antilisterial Activity on Poultry Meat of Amylosin, Bacteriocin from Bacillus amyloliquefaciens GA1, Probiotic & Antimicro Prot, DOI10.1007/s 12602-00-9040-9 19.Baumann P, Clark A M, Baumann L, Broadwell H A 1991, Bacillus sphaericus as a mosquito pathogen Properties of the organisms and its toxins Microbiol, Rev.55, pp 425-436 20.Bergey manual of Systematic bacteriology, 2004 21.Bottone E J and Peluso R W (2003), “Production by Bacillus pumilus (MSH) of an antifungal compound that is active against Mucoraceae and Aspergillus species: preliminary report”, Journal of Medical Microbiology, 52, 69 - 74 22.Bula J.A, Costilow R, Sapple E.S (1978), “Biology of Bacillus popillae, Adv Appl, Microbiol, 23, pp 1-18 23.Bula J , Costilow R, Sapple E.S (1978), “Biology of Bacillus popillae, Adv Appl, Microbiol, 23, pp 1-18 24.Carbonnelle, F Dennis, A.Marmonier, G pion, R Vargues, Bacteriologie medicaie techniques useuelies, SIMEP SA Paris, France, 1987 25.Eui-Sun Son and Jong-Il Kim (2002), Purification and Characterization of Caseinolytic Extracellular protease from Bacillus amyloliquefaciens S94, The Journal of Microbiology 26.FAO/WHO Working group (2002), Guideline for the evaluation of probiotic in food, Food and Agriculture Organizationof the United Nations 27 Fuller R., Probiotics in man and animals, J Appl Bacteriol: 66, pp 65–78, 1989 28.Gibson T Gordon Ruth E (1975), Bacillus in Bergey`s Manual of Detemenative Bacteriology, R.E Buchanan & N.E Gibbons Editors, willion & Wilkins 29.Havenaar, R and J.H.J Huis in't Veld, 1992 Probiotics: A General View In: The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease, Wood, B.J.B (Ed.) Chapman and Hall, New York, USA., pp: 209-224 30.Huilin Yang, Yuling liao, Bin Wang, Ying Lin, and Lipan (2011), Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens XH7, which exhibits production of purine nucleosides, Journal of bacteriology, pp 5393-5594 31.Idris SE, Iglesias DJ, Talon M, Borriss R (2007), Tryptophan- dependen production of Indoles-3-Acetic (IAA) affects level of plant grawth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42, Molecular-Microbe Interactions, 20 ( 6), pp 619-626 32.Kimura, N Ono, M (1989), “Prevention of aflatoxin contamination in cereals and nuts by applying Iturin A there to Australian patent office”, AU – A – 39235 33.Munimbazi C and Bullerman L B (1997), “Inhibition of aflatoxin production of Aspergillus parasiticus pumi us”, M cop tho o i , 140, 163-169 NRRL 2999 by Bacillus 34.Muñoz, R., rena, M E., Silva, J., González, S N (2010), “Inhibition of mycotoxin-producing Aspergillus nomius vsc 23 by lactic acid bacteria and Saccharomyces cerevisiae”, Brazilian Journal of Microbiology, 41: 1019 - 1026 35.Norio Kimura and Susumu Hirano (1988), “Inhibitory Strains of Bacillus subtilis for Growth and Aflatoxinproduction of Aflatoxigenic Fungi”, Agric Biol Chem., 52 (5), 1173 - 1179 36 Priest (F.G), Goodfellow (M.), Shute (LA) and Berkeley (R.C.W) (1987), Bacillus amyloliquefaciens sp nov nom rev, Int, j Syst Bacteriol, 37, pp 69-71 37.Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K., Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam, Int J Syst Evol Microbiol: 59, pp 550-554, 2009 38.Sander,M.E., Morelli, L and Tompkins, T A., Sporeformers as human probiotic: Bacillus, sporolactobacillus, and Brevibacillus, Comprehensive Review in food Science and food Safety 2: pp 101 - 110, 2003 39.SCAN, "Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the Safety of Use of Bacillus Species in Animal Nutrition," European Commission Health & Consumer Protection Directorate-General., 2002 40.Sutyak K, Wrawan R, Aroutchera A, Chikindas M (2008), Isolation of the Bacillus amyloliquefaciens antimicrobial peptide subtilesin from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens, J Appl Microbiol 104, pp 1067-1074 41.Todar, K Ph D (2008), Bacillus and related endospore-forming bacteria, Todar’s online textbook of bacteriology 42.Vahjen W., Glaser V and Simon O., Influence of xylanase supplemented feed on the development of selected bacterial groups in the intestinal tract ò broilerchicks(1998) 43 Saeedi M, Shahidi F, Mortazavi SA, Milani E, Yazdi FT (2015) Isolation and identification of lactic acid bacteria in winter salad (Local Pickle) during fermentation using 16S rRNA gene sequence analysis J Food Saf 35:287–294 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH a.B.TH b B.BP c.B1 d B.CP Hình PL1: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Bacillus a.Giữ giống ống thạch nghiêng b Giữ giống Glyxerol Hình PL2: Hình ảnh giữ giống chủng vi khuẩn PHỤ LỤC BẢN Bảng PL1 Mật độ tế bào (CFU/ml) chủng tới giá trị pH thời gian khác Kí hiệu hời gian (giờ) pH B.TH B.BP 108 6,8 × 107 5,5 × 107 5,1 × 107 108 7,1 × 107 6,8 × 107 6,15 × 107 108 7,8 × 107 6,95 × 107 6,54 × 107 1,12 × 108 6,96 × 107 6,45 × 107 5,18 × 107 1,12 × 108 0,8 × 108 0,69 × 108 0,59 × 108 1,12 × 108 0,91 × 108 0,78 × 108 0,71 × 108 Bảng PL2 Mật độ tế bào (CFU/ml) chủng nồng độ muối mật thời gian khác hời gian (giờ) Kí hiệu B.TH B.BP Nồng độ muối mật (%) 0,5 0,5 108 108 108 108 1,12 × 108 1,12 × 108 0,96 × 108 0,85 × 108 0,74 × 108 0,69 × 108 1,06 × 108 0,97 × 108 0,93× 108 0,83 × 108 0,66 × 108 0,61× 108 1,02 × 108 0,91 × 108 0,86 × 108 0,72 × 108 0,61 × 108 0,51 × 108 0,98 × 108 0,83 × 108 1,12 × 108 0,85 × 108 0,74 × 108 0,68 × 108 1,12 × 108 0,78 × 108 0,67 × 108 0,56 × 108