Luận văn thạc sĩ phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase và khả năng ứng dụng

- Khảo sát tính chất chitosan tạo thành phương pháp sinh học so sánh với chitosan sản xuất phương pháp hóa học chitosan thương mại - Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin phương pháp sinh học III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2016 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2016 V- Cán hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS Nguyễn Hoài Hương CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc TP.HCM, ngày……tháng……năm 2017 Học viên thực Luận văn ii LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn tất quý thầy cô trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, thầy cô ngành Công nghệ sinh học tận tình giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm kiến thức, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian học tập tạo điều kiện thực để tơi hồn thành luận văn Đặc biệt xin cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Hồi Hương tận tình hướng dẫn tạo điều kiện để thực hoàn thành tốt luận văn Xin gửi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến – Trung tâm phân tích kỹ thuật cao Sài Gịn STC sinh viên Đỗ Thị Phương Trinh giúp tơi hồn thành kết chạy điện di mẫu enzyme Cuối cùng, xin cảm ơn thầy cô hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét cho luận văn để tơi hồn thiện tốt Tơi xin chúc thầy nhiều sức khỏe thành công sống Học viên thực Luận văn Nguyễn Trần Thiện Đức iii TÓM TẮT PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CÁC CHỦNG NÀY TRONG SẢN XUẤT CHITOSAN TỪ CHITIN Trong nghiên cứu này, 26 chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu đất thu thập từ địa điểm khác Vũng Tàu, Cần Giờ, có chủng (CD1, CD5, CD10) cho thấy khả sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase định danh Bacillus cereus, B amyloliquefaciens B siamensis Môi trường sử dụng lên men chủng chuyển hóa chitin huyền phù thành chitosan chứa nguồn C tinh bột 2%, nguồn N cao nấm men 1%, nguồn khoáng MgSO4 0,04% bổ sung NaCl 0,1% Hiệu suất thu hồi chitosan sử dụng acid acetic 2% hòa tan chitosan 73%, 52%, 49% tương ứng với chủng CD1, CD5 CD10 Độ hòa tan, độ nhớt, độ deacetyl hóa khối lượng phân tử, hoạt tính kháng khuẩn chitosan sinh học không khác biệt nhiều so với chitosan hóa học chitosan thương mại iv ABSTRACT ISOLATION AND SCREENING OF CHITIN DEACETYLASE PRODUCING MICROORGANISMS AND APPLICATION POTENTIAL IN CHITOSAN PRODUCTION FROM CHITIN In this study, 26 bacterial strains were isolated from soil samples, collected from different locations in Ba Ria Vung Tau Province, among which only three strains namely CD1, CD5 and CD10 showed their chitin deacetylase activity and were identified as Bacillus cereus, B amyloliquefaciens and B siamensis, respectively The culture medium for above – mentioned strains to convert colloidal chitin to chitosan contained 2% soluble starch as the carbon source, 1% yeast extract as the nitrogen source and several minerals such as 0,04% MgSO4 and 0,1% NaCl Chitosan recovery yields by using 2% acetic acid to dissolve chitosan were 73%, 52%, 49% for CD1, CD5 and CD10 respectively Chitosan obtained by biological method displayed solubility, viscosity, deacetylation degree, molecular weight and antibacterial activity in the same range as this obtained by chemical method as well as the commercial one v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH xi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu .2 Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài Kết cấu luận văn thạc sĩ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chitin 1.1.1 Giới thiệu .5 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Tính chất hóa học 1.1.4 Tính chất sinh học 1.1.5 Nguồn nguyên liệu thu nhận 1.1.6 Tình hình sản xuất nghiên cứu Việt Nam giới .7 1.1.6.1 Tình hình sản xuất nghiên cứu Việt Nam 1.1.6.2 Tình hình sản xuất nghiên cứu giới 1.1.7 Ứng dụng 1.2 Tổng quan chitosan vi 1.2.1 Giới thiệu .9 1.2.2 Tính chất hóa lý 10 1.2.3 Tính chất sinh học 10 1.2.4 Các tính chất chitosan 14 1.2.4.1 Mức độ deacetyl hóa 14 1.2.4.2 Trọng lượng phân tử Chitosan 14 1.2.4.3 Độ nhớt 11 1.2.4.4 Tính tan 11 1.2.4.5 Tỷ trọng 12 1.2.4.6 Khả kết hợp với nước khả kết hợp với chất béo 12 1.2.4.7 Khả tạo màng 12 1.2.4.8 Hoạt tính sinh học chitosan 12 1.2.5 Nguồn nguyên liệu thu nhận 14 1.2.6 Công nghệ sản xuất chitosan .14 1.2.6.1 Quy trình sản xuất chitosan từ chitin phương pháp hóa học 15 1.2.6.2 Quy trình sản xuất chitosan phương pháp bán sinh học .16 1.2.7 Tình hình sản xuất nghiên cứu Việt Nam giới 18 1.2.7.1 Tình hình sản xuất nghiên cứu Việt Nam 18 1.2.7.2 Tình hình sản xuất nghiên cứu giới 19 1.2.8 Ứng dụng .19 1.3 Tổng quan enzyme chitin deacetylase 20 1.3.1 Giới thiệu enzyme chitin deacetylase .20 1.3.2 Cơ chế xúc tác 20 1.3.3 Phướng pháp xác định hoạt tính 22 1.3.4 Điều kiện hoạt động enzyme .22 1.3.5 Ứng dụng 23 1.3.6 Lịch sử nghiên cứu enzyme chitin deacetylas 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 25 2.1.1 Thời gian 25 vii 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2.1 Nguồn mẫu .25 2.2.2 Hóa chất .27 2.2.3 Thiết bị – dụng cụ 27 2.2.3.1 Thiết bị 27 2.2.3.2 Dụng cụ 28 2.3 Phương pháp luận .28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase30 2.4.1.1 Thu thập mẫu .30 2.4.1.2 Tăng sinh, phân lập chủng khiết 31 2.4.1.3 Sàng lọc 31 2.4.1.4 Định danh chủng sàng lọc .32 2.4.2 Khảo sát khả chuyển hóa chitin thành chitosan chủng sàng lọc 36 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Phân lập sang lọc chủng vi sinh vật có khả sinh enzyme chitin deacetylase .48 3.1.1 Tăng sinh, phân lập chủng khiết .48 3.1.2 Sàng lọc 48 3.1.3 Định danh sơ chủng sàng lọc .49 3.1.3.1 Đặc điểm hình thái .49 3.1.3.2 Kết định tính khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn 49 3.1.4 Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc phương pháp sinh học phân tử 53 3.2 Khảo sát khả chuyển hóa chitin thành chitosan chủng sàng lọc 53 viii 3.2.1 Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng mơi trường lên men chọn nuôi cấy chủng sàng lọc 53 3.2.1.1 Định tính diện chitosan .54 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng chất đến hiệu suất thu hồi chitosan 55 3.2.2.1 Nguồn Carbon 56 3.2.2.2 Nguồn Nitơ 57 3.2.2.3 Thành phần khoáng 58 3.2.3 Tăng hiệu suất thu hồi cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan 60 3.2.4 Tăng hiệu suất thu hồi cách thay đổi chất cảm ứng 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .72 Kết luận 72 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO .74 ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CDA : Chitin deacetylase CS :Chitinase DDA : Độ deacetyl LMWC : Low molecular weight chitosan VSV : Vi sinh vật PHỤ LỤC J: HOẠT TÍNH ENZYME CHITIN DEACETYLASE Từ kết quét phổ p-nitroaniline chuẩn (Phụ lục E), ta tìm ƛ max= 395 nm  Phương trình đường chuẩn p-nitroaniline Nồng độ 10 20 30 40 50 OD 0.15 0.259 0.39 0.53 0.676 0.8 0.7 y = 0.0132x + 0.0041 R² = 0.997 0.6 0.5 0.4 Series1 0.3 Linear (Series1) 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 60 Hình 3.10 Phương trình đường chuẩn p-nitroaniline HL CDA (µg/ml/giờ) = ((Aλmax-Ao)-b)*F*60 phút/(a*T phút) Trong Aλmax = giá trị hấp thụ hỗn hợp phản ứng enzyme sau thời gian phản ứng đo bước sóng hấp thụ cực đại A(0) = giá trị hấp thụ hỗn hợp phản ứng với enzyme bất hoạt đo bước sóng hấp thụ cực đại F = hệ số pha loãng T thời gian phản ứng enzyme (phút) 60 = 60 phút PHỤ LỤC K: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PP SDS - PAGE  Định lượng protein phương pháp điện di SDS - PAGE Rf tỷ số khoảng cách di chuyển protein khoảng cách di chuyển phẩm màu brommophenol blue Rf MW Log (MW) 0,105 266250 5,4 0,183 169500 5,2 0,304 144370 5,1 0,405 65120 4,8 0,605 34960 4,5 0,788 14230 4,1 z Đồ thị biểu diễn tương quan Rf log( khối lượng phân tử) protein Tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính liên quan giá trị Rf log (MW) protein thang chuẩn phần mềm excel, ta phương trình sau: Y = - 1,8612X + 5,5914 Trong đó: Y = log (MW) protein X = Rf: tỷ số khoảng cách di chuyển protein khoảng cách di chuyển phẩm màu brommophenol blue CD10 CD5 CD1 Thang chuẩn Kết chạy điện di SDS - PAGE CD1 CD5 CD10 Khoảng cách di chuyển (cm) Rf Khoảng cách di chuyển (cm) 1,9 0,365 2,1 0,423 2,8 0,538 4,1 0,788 Rf Khoảng cách di chuyển (cm) Rf 2,3 0,442 3,3 0,634 2,8 0,538 2,8 0,538 Theo kết điện di đồ, xác định trọng lượng phân tử mẫu ta được: Giếng 1: CD1: Với Rf = 0.365 Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.365)+5.5914 = 81669 Da Rf = 0.423 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.423)+5.5914 = 63696 Da Rf = 0.538 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.519)+5.5914 = 38911 Da Rf = 0.788 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.788)+5.5914 = 13328 Da Giếng 2: CD10: Với Rf = 0.634 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.634)+5.5914 = 25786 Da Với Rf = 0.538 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.538)+5.5914 = 38911 Da Giếng 3: CD5: Với Rf = 0.442 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.634)+5.5914 = 58715 Da Với Rf = 0.538 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.538)+5.5914 = 38911 Da Kết luận: - Trong mẫu CD1 xuất loại protein có khối lượng phân tử khác - Ở mẫu CD10 có xuất loại protein có khối lượng phân tử 25786 Da 38911 Da - Ở mẫu CD5 có xuất loại protein có khối lượng phân tử 58715 Da 38911 Da Cả mẫu có loại protein có khối lượng 38911 Da Có thể bước đầu nghi ngờ khối lượng enzyme chitin deacetylase chủng vi sinh vật PHỤ LỤC L: XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ  Nguồn Carbon CD1 ĐỘ HÒA TAN ‘DO HOA TAN CD1 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels CD1 Values GLU1 SUC1 TB1 Number of Observations Read Number of Observations Used ‘DO HOA TAN CD1 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DOHOATAN Sum of Source DF Model Error Corrected Total Squares Mean Square 206.8888889 103.4444444 12.6666667 2.1111111 Coeff Var Root MSE 0.942308 2.782276 1.452966 DF CD1 49.00 Pr > F 0.0002 219.5555556 R-Square Source F Value DOHOATAN Mean 52.22222 Anova SS Mean Square F Value 206.8888889 103.4444444 49.00 Pr > F 0.0002 ‘DO HOA TAN CD1 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DOHOATAN NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 2.111111 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 2.9029 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CD1 A 57.667 TB1 B 53.000 GLU1 C 46.000 SUC1 ‘DO HOA TAN CD1 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DOHOATAN NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 2.111111 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 4.3983 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CD1 A 57.667 TB1 B 53.000 GLU1 C 46.000 SUC1  ĐỘ HÒA TAN CD2 NGUỒN CARBON ‘DO HOA TAN CD5 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels CD5 Values GLU1 SUC1 TB1 Number of Observations Read Number of Observations Used ‘DO HOA TAN CD5 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DOHOATAN Sum of Source DF Model Error Corrected Total Squares Mean Square 450.6666667 225.3333333 35.3333333 5.8888889 Coeff Var Root MSE 0.927298 4.439091 2.426703 DF CD5 38.26 Pr > F 0.0004 486.0000000 R-Square Source F Value DOHOATAN Mean 54.66667 Anova SS Mean Square F Value 450.6666667 225.3333333 38.26 Pr > F 0.0004 ‘DO HOA TAN CD5 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DOHOATAN NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error Alpha rate 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 5.888889 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 4.8483 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CD5 A 63.333 TB1 B 54.667 GLU1 C 46.000 SUC1  Độ hòa tan CD3 nguồn carbon ‘DO HOA TAN CD10 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels CD10 Values GLU1 SUC1 TB1 Number of Observations Read Number of Observations Used ‘DO HOA TAN CD10 CAC NGUON CARBON’ 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DOHOATAN Sum of Source DF Model Error Corrected Total R-Square Squares Mean Square 308.2222222 154.1111111 26.6666667 4.4444444 F Value 34.67 Pr > F 0.0005 334.8888889 Coeff Var Root MSE DOHOATAN Mean 0.920372 3.969386 Source DF CD10 2.108185 53.11111 Anova SS Mean Square F Value 308.2222222 154.1111111 34.67 Pr > F 0.0005 ‘DO HOA TAN CD10 CAC NGUON CARBON’ 10 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DOHOATAN NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 4.444444 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 4.2119 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CD10 A 60.333 TB1 B 53.000 GLU1 C 46.000 SUC1 ‘DO HOA TAN CD10 CAC NGUON CARBON’ 11 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DOHOATAN NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error Alpha rate 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 4.444444 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 6.3817 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CD10 A 60.333 TB1 B 53.000 GLU1 C 46.000 SUC1  Độ deacetyl nguồn Carbon CD1 ‘DO DEACETYL CD1 CAC NGUON CARBON’ 12 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels CD1 Values GLU1 SUC1 TB1 Number of Observations Read Number of Observations Used ‘DO DEACETYL CD1 CAC NGUON CARBON’ 13 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DODEACETYL Sum of Source DF Model Error Squares 184.2222222 10.0000000 Corrected Total Mean Square 92.1111111 Root MSE 0.948513 2.721066 1.290994 CD1 55.27 0.0001 194.2222222 Coeff Var DF Pr > F 1.6666667 R-Square Source F Value Anova SS 184.2222222 DODEACETYL Mean 47.44444 Mean Square F Value 92.1111111 55.27 Pr > F 0.0001 ‘DO DEACETYL CD1 CAC NGUON CARBON’ 14 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DODEACETYL NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 1.666667 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 2.5793 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CD1 A 53.333 TB1 B 46.667 GLU1 C 42.333 SUC1 ‘DO DEACETYL CD1 CAC NGUON CARBON’ 15 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DODEACETYL NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error Alpha rate 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 1.666667 3.70743 Least Significant Difference 3.908 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CD1 A 53.333 TB1 B 46.667 GLU1 C 42.333 SUC1  Độ deacetyl nguồn carbon CD5 ‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’ 16 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels CD5 Values GLU1 SUC1 TB1 Number of Observations Read Number of Observations Used ‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’ 17 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DODEACETYL Sum of Source DF Model Error Corrected Total Squares Mean Square 600.8888889 300.4444444 11.3333333 1.8888889 Coeff Var Root MSE 0.981488 2.392518 1.374369 DF CD5 159.06 F 600.8888889 300.4444444 159.06 F 612.2222222 R-Square Source F Value 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DODEACETYL NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 1.888889 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 2.7458 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CD5 A 67.667 TB1 B 57.000 GLU1 C 47.667 SUC1  Độ deacetyl nguồn Carbon ‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’ 19 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Class Level Information Class CD10 Levels Values GLU1 SUC1 TB1 Number of Observations Read Number of Observations Used ‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’ 20 00:00 Wednesday, October 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DODEACETYL Sum of Source DF Model Error Squares Mean Square 504.2222222 252.1111111 9.3333333 Corrected Total Root MSE 0.981826 2.319209 1.247219 CD10 162.07 F 1.5555556 R-Square Source F Value DODEACETYL Mean 53.77778 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 504.2222222 252.1111111 162.07