Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy chủng bacillus tb1 kích thích sinh tổng hợp poly g glutamic acid

LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập Trường Đại Học Lâm nghiệp, dạy tận tình Thầy Cô giáo Trường đặc biệt Thầy Cô giáo công tác giảng dạy Viện Công Nghệ Sinh học, giúp em hiểu biết Ngành Cơng Nghệ sinh học nói chung chun ngành Cơng nghệ vi sinh - hóa sinh nói riêng Thời gian qua em tiến hành thực tập khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu khảo sát điều kiện ni cấy chủng Bacillus TB1 kích thích sinh tổng hợp poly -glutamic acid” phịng thí nghiệm Viện Cơng Nghệ sinh học trường Đại học Lâm nghiệp Nhờ giúp đỡ tận tình Thầy Cơ Bạn đề tài hoàn thành Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô công tác Viện Công nghệ sinh học trường Đại Học Lâm nghiệp dạy cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu chuyên ngành Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh suốt thời gian qua Đặc biệt Ts Nguyễn Như Ngọc trực tiếp hướng dẫn, bảo chun mơn để em hồn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Cơ cán phịng thí nghiệm mơn Cơng Nghệ Vi sinh - Hóa sinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ nhiệt tình bạn bè để em hồn thành tốt đề tài Do thời gian nghiên cứu có hạn, vốn kiến thức kinh nghiệm cịn hạn chế nên em khơng thể tránh khỏi thiếu sót Kính mong q Thầy Cơ, bạn đóng góp ý kiến để đề tài em tốt Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực LÊ THỊ HẰNG MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu poly γ-glutamic acid 1.2 Phân loại poly γ-glutamic acid 1.3 Tính chất poly γ-glutamic acid 1.4 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp poly γ-glutamic acid 1.4.1 Bacillus subtilis 1.4.2 Bacillus lichenformis 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp  - PGA 1.5.1 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến trình sinh trưởng sinh tổng hợp γ-PGA 1.5.2 Ảnh hưởng yếu tố ngoại cảnh đến trình sinh tổng hợp  PGA 12 1.6 Ứng dụng γ-PGA 14 1.6.1 Trong lĩnh vực môi trường 14 1.6.2 Trong lĩnh vực y dược 15 1.6.3 Trong lĩnh vực nông nghiệp 16 1.6.4 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm 16 1.6.5.Trong lĩnh vực mỹ phẩm, chăm sóc da 18 1.7 Tình hình nghiên cứu -PGA giới Việt Nam 18 1.7.1.Tình hình nghiên cứu -PGA giới 18 1.7.2 Tình hình nghiên cứu  - PGA Việt Nam 19 CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Vật liệu hóa chất 22 2.3.1 Vật liệu 22 2.3.2 Dụng cụ thiết bị 22 2.3.3 Hóa chất 22 2.4 Các môi trường sử dụng nghiên cứu 23 2.5 Địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm 24 2.6 Phương pháp nghiên cứu 24 2.6.1 Phương pháp xác định khả sinh tổng hợp -PGA chủng Bacillus TB1 24 2.6.2 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp  - PGA 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 32 3.1 Phương pháp xác định khả sinh tổng hợp -PGA chủng Bacillus TB1 32 3.1.1 Khả tạo màng môi trường đặc hiệu chủng Bacillus TB1 32 3.1.2 Khả tạo độ nhớt nhớt kế mao quản 32 3.1.3 Kết thu nhận γ-PGA 33 3.1.4 Kết chạy sắc ký mỏng 33 3.2 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng sinh tổng hợp  - PGA 34 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp  - PGA 34 3.2.2 Nghiên cứu nguồn dinh dưỡng cho trình sinh tổng hợp -PGA 36 3.2.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc 37 3.2.4 Ảnh hưởng pH 39 3.2.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon 41 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ 43 3.2.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ 44 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 47 4.1 KẾT LUẬN 47 4.2 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT cst Đơn vị đo độ nhớt thông thường kGy Kilo Gray kDa Kilo Dalton LB Lauria Broth γ-PGA Poly gamma glutamic acid PGA Poly glutamic Acid v/p Vòng/ phút DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần môi trường dinh dưỡng cho trình sinh tổng hợp γPGA vi khuẩn [61] Bảng 2.1: Thành phần môi trường LB 23 Bảng 2.2: Thành phần môi trường đặc hiệu [61] 23 Bảng 2.3: Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp  PGA 27 Bảng 2.4: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến khả tạo độ nhớt hàm lượng -PGA thô 27 Bảng 2.5: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả tạo độ nhớt hàm lượng PGA thô 28 Bảng 2.6: Ảnh hưởng cuả pH đến khả tạo độ nhớt hàm lượng -PGA thô 29 Bảng 2.7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo độ nhớt hàm lượng PGA thô 29 Bảng 2.8: Ảnh hưởng cuả nguồn cacbon đến khả tạo độ nhớt hàm lượng -PGA thô 30 Bảng 2.9: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tạo độ nhớt hàm lượng PGA thô 31 Bảng 3.1: khả tạo độ nhớt nhớt kế mao quản chủng vi khuẩn 120h 32 Bảng 3.2: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả tạo độ nhớt hàm lượng  - PGA chủng Bacillus TB1 35 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 36 Bảng 3.4: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 38 Bảng 3.5: Ảnh hưởng độ pH đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 39 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 42 Bảng 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 43 Bảng 3.8: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử γ-PGA [40] Hình 3.1: Ảnh chụp màng vi khuẩn TB1tạo môi trường đặc hiệu 32 Hình 3.2: Hàm lượng γ-PGA sau thu nhận phương pháp Manocha 33 Hình 3.3: Sắc ký mỏng sản phẩm thủy phân từ dịch nhớt canh trường 34 Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả tạo độ nhớt hàm lượng  - PGA chủng Bacillus TB1 35 Hình 3.5: Biểu đồ ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng tới khả sinh tổng hợp -PGA vi khuẩn TB1 thời điểm 96 37 Hình 3.6: Biểu đồ ảnh hưởng tốc độ lắc tới khả sinh tổng hợp  - PGA vi khuẩn TB1 96 38 Hình 3.7: Biểu đồ ảnh hưởng pH tới khả sinh tổng hợp  - PGA 40 Hình 3.8: Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả sinh tổng hợp  PGA Bacillus TB1 96 42 Hình 3.9: Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh sinh hợp  - PGA vi khuẩn TB1tại thời điểm 96 44 Hình 3.10: Biểu đồ ảnh hưởng nguồn nitơ tới khả sinh tổng hợp  PGA vi khuẩn TB1 96 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo tổ chức y tế giới, nhu cầu sử dụng hợp chất tự nhiên công nghệ thực phẩm xu tất yếu, đặc biệt hợp chất có hoạt tính sinh học tổng hợp từ trình sinh học vi sinh vật So với hợp chất tổng hợp phương pháp hóa học, chúng có ưu điểm vượt trội an toàn cho sức khỏe người thân thiện với môi trường Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm Việt Nam nay, việc sử dụng hóa chất độc hại, nhiều phụ gia có nguồn gốc hóa học ngày phổ biến, làm cho vấn đề đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm trở nên báo động hết Để góp phần giải vấn đề này, việc nghiên cứu tạo chất phụ gia có nguồn gốc sinh học, phù hợp tiêu chuẩn an tồn, thay hóa chất độc hại ngày quan tâm Poly -glutamic acid (-PGA) loại polymer sinh học tự nhiên tạo từ phân tử axit glutamic Với ưu polymer có khả phân hủy sinh học, khơng độc với người tự nhiên, tạo muối với kim loại không bị phân cắt protease Do đó, γ-PGA ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác nhau, như: Trong lĩnh vực mơi trường, γ-PGA có khả xử lý số kim loại nặng, làm vật liệu bao bì có khả phân hủy sinh học hay loại bỏ thuốc nhuộm khỏi nước Trong lĩnh lực y dược, γ-PGA dùng chất mang, keo sinh học… Trong lĩnh lực thực phẩm, γ-PGA sử dụng loại chất phụ gia để ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết tinh hay chất ổn định….Ngồi ra, γ-PGA cịn ứng dụng rộng rãi lĩnh vực nông nghiệp, làm đẹp số ngành cơng nghiệp khác γ-PGA sản xuất cách trùng hợp axit glutamic thông qua đường hóa học phổ biến theo đường sinh học Hiện nay, trình lên men thu nhận γ-PGA thường thực chủng vi sinh vật có sản phẩm lên men truyền thống như: Tương bần (Việt Nam), Natto (Nhật Bản), Thua - nao (Thái Lan), Chungkookjang (Hàn Quốc)… Với nhu cầu sử dụng γ-PGA ngày tăng, nhà khoa học nước giới tích cực nghiên cứu để chọn lọc chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp γ-PGA với hiệu suất cao từ tự nhiên Tuy nhiên, để thu nhận lượng γ-PGA lớn đáp ứng với nhu cầu thị trường, việc nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để ni cấy chủng vi sinh vật thu nhận γ-PGA mối quan tâm lớn nhà khoa học Xuất phát từ sở trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khảo sát điều kiện ni cấy chủng Bacillus TB1 kích thích sinh tổng hợp poly -glutamic acid” CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu poly γ-glutamic acid γ-PGA lần phát Ivonovics Bruckner năm 1937 họ nghiên cứu lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus anthracis [24] Sau đó, nguồn tự nhiên khác giàu γ-PGA chất nhầy Natto (đậu nành lên men Nhật Bản), có chứa hỗn hợp γ-PGA fructan sản xuất Bacillus subtilis [40, 17] Tuy nhiên, γ-PGA sản xuất chủ yếu vi khuẩn Gram dương, bao gồm chi Bacillus Nó báo cáo loại vi khuẩn Gram âm (Fusobacterium nucleatum), số vi khuẩn cổ sinh vật nhân chuẩn có khả sản xuất γ-PGA [17] γ-PGA tìm thấy tế bào thần kinh chuột trạng thái liên kết cộng hóa trị với tubulin [19] γ-PGA polymer tự nhiên, mang điện tích âm có đơn phân axit L- glutamic hay D- glutamic chứa hai đơn phân liên kết với mối liên kết nhóm γ-carboxyl nhóm α-amino [40] Hình 1.1: Cấu trúc phân tử γ-PGA [40] Khả tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2 nhóm αCOOH γ-COOH theo thứ tự giảm dần theo mạch Thông thường, α-NH2 kiện nuôi cấy tĩnh Bảng 3.6 đồ thị 3.8 thể ảnh hưởng nguồn cacbon đến hình thành γ-PGA Bảng 3.6: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 Nguồn Cacbon (g/l) Độ nhớt dung dịch môi trường đặc hiệu (cst) 10 15 20 Citric acid 2,027 2,423 2,86 2,174 Glucose 1,458 1,785 2,107 1,901 Lactose 1,272 1,529 1,770 1,690 Sucrose 1,276 1,315 1,604 1,507 Hình 3.8: Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khả sinh tổng hợp  - PGA Bacillus TB1 96 Sự hình thành  - PGA sử dụng nguồn cacbon axit citric với nồng độ 15g/l cho hàm lượng cao 22,3g/l Tếp theo đến thí nghiệm sử dụng đường glucose 15g/l cho hàm lượng γ-PGA sản sinh 13.1g/l Các mẫu sử dụng đường lactose đường sucrose cho hàm lượng γ-PGA cao đạt 10.1g/l 7,8g/l Khi sử dụng citric acid làm nguồn cacbon cho việc 42 sinh trưởng phát triển vi khuẩn sử dụng trực tiếp mà khơng phải thơng qua q trình chuyển đổi trung gian [6] Đối với đường lại, vi khuẩn hấp thụ chất chậm axit citric thời gian chuyển hóa tế bào vi khuẩn cần phải chuyển hóa thành hợp chất trung gian trước thành axit citric Các loại đường sau chuyển hóa có xu hướng thành axit hữu cơ, làm giảm trình sinh tổng hợp γ-PGA Một số nghiên cứu không sử dụng glucose làm nguồn carbon tổng hợp γ-PGA, không sử dụng axit citric thành phần mơi trường, việc hình thành γ-PGA khơng có [53] Vì vậy, việc sử dụng hàm lượng axit citric 15g/l cho trình tổng hợp γ-PGA thích hợp 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ Chủng vi khuẩn TB1 loài vi khuẩn ưa ấm có khả sinh trưởng phát triển tốt dải nhiệt độ 300C đến 450C Để tìm nhiệt độ thích hợp cho khả sinh tổng hợp  - PGA, tiến hành cấy chủng vào bình tam giác chứa mơi trường E, điều kiện ni cấy tĩnh, có pH ban đầu nhiệt độ 300C, 350C, 400C, 450C, 500C Sau 24 mẫu lấy kiểm tra hàm lượng  - PGA, kết thúc trình lên men sau thời điểm 120 Kết nghiên cứu biểu bảng 3.7 đồ thị 3.9: Bảng 3.7: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 Thời gian (giờ) Độ nhớt dung dịch môi trường đặc hiệu(cst) 24 48 72 96 120 300C 1,025 1,095 1,188 1,269 1,188 350C 1,223 1,293 1,868 2,038 1,829 400C 1,482 1,783 2,385 2,788 2,571 450C 1,114 1,230 1,290 1,305 1,399 500C 1,023 1,051 1,107 1,165 1,153 Nhiệt độ 43 Hình 3.9: Biểu đồ ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh sinh hợp  PGA vi khuẩn TB1tại thời điểm 96 Kết nghiên cứu bảng 3.7 hình 3.9 cho thấy chủng TB1 khả sinh tổng hợp  - PGA yếu nhiệt độ 500C, dải nhiệt độ35oC, 45oC hình thành cao giao động khoảng - 10 g/l  PGA Tại thời điểm 400C hình thành -PGA đạt giá trị lớn 22,7g/l thời điểm 96 lên men giảm xuống 8,8g/l sau 120 lên men Sự ảnh hưởng nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng vi khuẩn TB1, tác động trực tiếp đến hình thành -PGA Một số nghiên cứu cho thấy hình thành  - PGA như: chủng B subtilis (Natto) nhiệt độ 400C, thời điểm 96h cho hàm lượng -PGA đạt 35g/l [38] Qua thí nghiệm chọn nhiệt độ lên men 400C, với môi trường E làm sở cho nghiên cứu sau 3.2.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ Để lựa chọn nguồn nitơ thích hợp với vi khuẩn sinh  - PGA,tiến hành cấy chủng vào bình tam giác chứa mơi trường E, điều kiện nuôi cấy 44 tĩnh, nhiệt độ tối ưu 400C, có pH ban đầu Thay cao nấm nem NH4Cl, NH4NO3 với nồng độ 0,5%, 1%, 1,5%, 2% Sau 96h lấy mẫu xác định hàm hượng  - PGA, đối chiếu, so sánh để xác định nồng độ nitơ thích hợp cho q trình sinh tổng hợp -PGA Kết thí nghiệm biểu bảng 3.8 hình 3.10 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả tạo độ nhớt chủng TB1 Nguồn Nitơ(g/l) Độ nhớt dung dịch môi trường đặc hiệu (cst) 10 15 20 NH4NO3 1,272 1,716 1,952 1,789 NH4Cl 1,589 1,624 1,820 1,802 1.965 2.796 3.021 2,689 Cao nấm men Hình 3.10: Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn nitơ tới khả sinh tổng hợp  - PGA vi khuẩn TB1 96 Sau 96 hàm lượng -PGA đạt giá trị cao 29,8g/l nồng độ cao nấm men 15g/l Đối với NH4NO3 NH4Cl nồng độ -PGA đạt cực đại dao động khoảng - 9g/l Một nguyên nhân làm cho -PGA 45 sinh tổng hợp sử dụng cao nấm nem mẫu lại trình sinh tổng hợp nitơ, gốc NH4+ NH4NO3 có tính bazo nên đẩy mơi trường lên men chuyển dịch theo hướng tăng pH Đối với NH4Cl gốc Cl- làm giảm môi trường lên men, ảnh hưởng đến hình thành số vi khuẩn, hình thành -PGA Như trình sinh tổng hợp -PGA sử dụng nguồn cao nấm nem nồng độ 15g/l làm nguồn nitơ 46 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN  Đã xác định khả sinh tổng hợp -PGA chủng Bacillus TB1 dựa vào phương pháp: + Khả tạo màng môi trường đặc hiệu + Khả tạo độ nhớt nhớt kế mao quản + Xác định hàm lượng -PGA dịch nuôi cấy + Xác định hợp chất -PGA sắc ký mỏng  Đã xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng Bacillus TB1, đó: + Thời gian lên men: 96 thu 20,5g/l γ-PGA + pH = thu 20,5g/l γ-PGA + Tốc độ lắc: 0v/p thu 20,5g/l γ-PGA + Nguồn dinh dưỡng: môi trường đặc hiệu E thu 20,5g/l γ-PGA + Nguồn cacbon: acid citric 15g/l thu 22,3g/l γ-PGA + Nhiệt độ 40oC thu 22,7g/l γ-PGA + Nguồn nitơ: Cao nấm men 15g/l thu 29,8g/l γ-PGA 4.2 KIẾN NGHỊ Vì hạn chế mặt thời gian, nên đề tài chưa triển khai thêm nhiều nội dung Để tăng hiệu ứng dụng tề tài này, em đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm số nội dung sau: - Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến trình sinh trưởng sinh tổng hợp poly -glutamic acid chủng Bacillus TB1 - Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện ni cấy theo quy hoạch thực nghiệm phương pháp tốn học - Tìm quy trình thu nhận, tinh γ-PGAthích hợp - Ứng dụng chế phẩm γ-PGAtrong ngành công nghiệp đời sống 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Phạm, Hữu Lý; Đỗ, Thị Bích Thanh Lê, Đức Giang (2007), "Nghiên cứu số polyme bị phân hủy sinh học sở L-axit Glutamic", Tạp chí khoa học cơng nghệ 45(1), pp 47-54 Phạm, Hữu Lý; Đỗ, Thị Bích Thanh Lê, Đức Giang (2007), "Nghiên cứu số polyme bị phân hủy sinh học sở L-axit Glutamic", Tạp chí khoa học công nghệ 45(1), pp 47-54 Nguyễn Quang Huy (2004) “ Hoạt tính bảo vệ polyglutamic acid (PGA) papain chống lại tác dụng tia phóng xạ ” Tạp chí KHCN-DHQGHN KHTN & CN TXX Số Lê Phước Cường, Lê Thị Xuân Thúy (2013), “Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật tuyển sử dụng axit -polyglutamic để tách loại than hoạt tính ion chì nước”, Tạp chí KHCN-DHDN, số 12 Nguyễn Chí Dũng, Trần Liên Hà, Đặng Thị Thu (2016) “Nghiên cứu sinh tổng hợp thu nhận poly γ-glutamic acid hướng ứng dụng thực phẩm” Tài liệu Tiếng Anh Adetoro, O; Aditya, B; Irorere, V; Hill, D.; Williams, V and Iza, R (2015), "Poly -glutamic acid production, properties and applications", Microbiology 161 Akishige, K and Haruki, T (1995), "Determination of γ-Polyglutamic Using Cetyltrimethylammonium Bromide", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 42(11), pp 878-886 8.Ashiuchi, M; Shimanouchi, K; Nakamura, H; Kamei, T; Soda, K; Park, C; Sung, M.H and Misono, H (2004), "Enzymatic Synthesis of HighMolecular-Mass Poly-γ- Glutamate and Regulation of Its Stereochemistry", Applied and Environmental Microbiology 70(7), pp 4249-4255 9.Ashiuchi, M.; Nawa, C.; Kamei, T.; Song, J J.; Hong, S P.; Sung, M H.; Soda, K.; Yagi, T and Misono, H (2001), "Physiological and biochemical characteristics of poly γ-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis", European Journal of Biochemistry 268(20), pp 5321-5328 10 Ashiuchi, M and Misono, H (2002), "Biochemistry and molecular genetics of poly- γ-glutamate synthesis", Applied Microbiology and Biotechnology 59(1), pp 9-14 11 Bajaj, I B and Singhal, R S (2009), "Sequential Optimization Approach for Enhanced Production of Poly  Glutamic Acid from Newly Isolated Bacillus subtilis", Food Technology and Biotechnology 47(3), pp 313-322 12 Bhattacharyya, D.; Hestekin, J A.; Brushaber, P.; Cullen, L.; Bachas, L G and Sikdar, S K (1998), "Novel poly-glutamic acid functionalized microfiltration membranes for sorption of heavy metals at high capacity", Journal of Membrane Science 141(1), pp 121-135 13 Bhunia, B.; Mukhopadhy, D G.; Mandal, T and Dey, A (2012), "Improved production, characterizationand flocculation properties of poly (γ)glutamic acid produced from Bacillus subtilis", Journal of Biochemical Technology 14 Ben-Zur N., Goldman D M (2007),” γ-Poly glutamic acid: a novel peptide for skin care”, Cosmetics Toiletries 122, 65-74 15 Buescher, J M and Margaritis, A (2007), "Microbial Biosynthesis of Polyglutamic Acid Biopolymer and Applications in the Biopharmaceutical, Biomedical and Food Industries", Critical Reviews in Biotechnology 16 Candela, T and Fouet, A (2005), "Bacillus anthracis CapD, belonging to the γ- glutamyltranspeptidase family, is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan", Molecular Microbiology 57(3), pp 717-726 17 Candela T., Fouet A (2006), “Poly--glutamate in bacteria”, Mol Microbiol 60, 1091-1098 18 Chunhachart, O.; Hanayama, T.; Hidesaki, M.; Tanimoto, H and Tahara, Y (2006), "Structure of the Hydrolyzed Product (F-2) Released from Poly gamma glutamic Acid by -Glutamyl Hydrolase YwtD of Bacillus subtilis", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 70(9), pp 22892291 19 Eddé B., Rossier J., Le Caer J P., Desbruyères E., Gros F., Denoulet P ( 1990 ), “ Posttranslational glutamylation of alpha-tubulin”, Science 247, 83-85 20 Goto, A and Kunioka, M (1992), "Biosynthesis and Hydrolysis of Poly(γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis IF03335", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 56(7), pp 1031-1035 21 Hiroyuki, T (2010), "Food Applications of Poly- -Glutamic Acid", AminoAcid Homopolymers Occurring in Nature 15, pp 155-168 22 Ho, G H.; Ho, T I.; Hsieh, K H.; Su, Y C ; Lin, P Y ; Yang, J ; Yang, K H and Yang, S C (2006), "γ-Polyglutamic Acid Produced by Bacillus Subtilis (Natto): Structural Characteristics, Chemical Properties and Biological Functionalities", Journal of the Chinese Chemical Society 53(6), pp 1363-1384 23 House, W and Riley, D (1962), “The biosynthesis of homopolymeric peptides, Biosynthesis”, Vol 3, academic press, New York and London, 389-412 24 Ivanovíc, G and Erdos (1937), "Ein Beitrag zum Wesen der Kapselsubtanz des Milzbrandbazillus", Immunitatsforsch 90, pp 5-19 25 Inbaraj B S., Chiu C P., Ho G H., Yang J., Chen B H ( 2006 ).” Removal of cationic dyes from aqueous solution using an anionic poly-γ-glutamic acid-based adsorbent” J Hazard Mater 137, 226-234 26 John, F H.; Peter, H.A.S.; Staley, J.T and Williams, S.T (1994),”Bergey's Manual of Determinative Bacteriology”, Ninth ed, ed 9th, LWW, 754 27 Jung, D Y.; Jung, S.; Yun, J S.; Kim, J N.; Wee, Y J.; Jang, H G and Ryu, H W (2005), "Influences of cultural medium component on the production of poly(γ- glutamic acid) by Bacillus sp RKY3", Biotechnology and Bioprocess Engineering 10(4), pp 289-295 28 Kim T W., Lee T Y., Bae H C., Hahm J H., Kim Y H., Park C., Kang T H., Kim C J., Sung M H., Poo H ( 2007 ) “Oral administration of high molecular mass poly-γ-glutamate induces NK cell-mediated antitumor immunity” J Immunol 179, 775-780 29 King, E.C; Blacker, A.J and Bugg, T.D.H (2000), "Enzymatic Breakdown of Poly- γ-d-glutamic Acid in Bacillus licheniformis: Identification of a Polyglutamyl γ- Hydrolase Enzyme", Biomacromolecules 1(1), pp 75-83 30 Kedia, G.; Hill, H; Hill, R and Radecka, I (2010), "Production of poly-γ-glutamic acid by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis with different growth media ", J Nanosci Nanotechnol 10, pp 1-9 31 Kubota, H.; Matsunobu, T.; Uotani, K.; Takebe, H.; Satoh, A.; Tanaka, T and Taniguchi, M (1993), "Production of Poly(gamma-glutamic acid) by Bacillus subtilis F-2-01", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 57(7), pp 1212- 1213 32 Lim S., Kim J., Shim J., Imm B., Sung M., Imm J (2012).”Effect of poly-γ-glutamic acids (PGA) on oil uptake and sensory quality in doughnuts” Food Sci Biotechnol 21, 247-252 33 Luana, P; Moraes, N and Ranulfo, M (2013), "The Existing Studies on Biosynthesis of Poly(ɣ-glutamic acid) by Fermentation", Food and Public Health 3(1), pp 28- 36 34 Masaaki, M (2006), "Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species", Journal of Bioscience and Bioengineering 101(1), pp 1-8 35 Mitsui, N; Murasawa, H and Sekiguchi, J (2011), "Disruption of the cell wall lytic enzyme CwlO affects the amount and molecular size of poly-gamma-glutamic acid produced by Bacillus subtilis (natto)", The Journal of General and Applied Microbiology 57(1), pp 35-43 36 Mitsuiki M., Mizuno A., Tanimoto H., Motoki M (1998).” Relationship between the antifreeze activities and the chemical structures of oligo- and poly(glutamic acid)s” J Agric Food Chem 46, 891895 37 Manocha, B., Margaritis, A.” A Novel Method for the Selective Recovery and Purification -Polyglutamic Acid from Bacillus licheniformis Fermentation Broth” 2010 Biochemical 734-736 38 Ogawa, Y.F; Yamaguchi, K and Yuasa, T(1997),”efficient production of poly--glutamic aicd by bacillus subtilis ( natto) in far fermenters”, Biosci Biotechnol Biochem 61,pp.1684 – 1687 39 Otani Y., Tabata Y., Ikada Y (1999) “Sealing effect of rapidly curable gelatin-poly( L-glutamic acid) hydrogel glue on lung air leak” Ann Thorac Surg 67, 922-926 40 Shih, I L and Van, Y T (2001), "The production of poly-(glutamic acid) from microorganisms and its various applications", Bioresource Technology 79(3), pp 207-25 41 Shih, I L.; Van, Y T and Sau, Y Y (2003), "Antifreeze activities of poly(γ- glutamic acid) produced by Bacillus licheniformis", Biotechnology Letters 25(20), pp 1709-1712 42 Shih, I L.; Van, Y T and Chang, Y N (2002), "Application of statistical experimental methods to optimize production of poly(γ-glutamic acid) by Bacillus licheniformis CCRC 12826", Enzyme and Microbial Technology 31(3), pp 213- 220 43 Shi, F; Xu, Z and Cen, P (2006), "Efficient production of poly-γglutamic acid by bacillus subtilis ZJU-7", Applied Biochemistry and Biotechnology 133(3), pp 271-281 44 Soliman N A., Berekaa M M., Abdel-Fattah Y R (2005) “Polyglutamic acid (PGA) production by Bacillus sp SAB-26: application of Plackett-Burman experimental design to evaluate culture requirements” Appl Microbiol Biotechnol 69, 259-267 45 Sawamura, S (1913), "On Bacillus Natto", J Coll Agric Tokyo 5(189-191) 46 Sung M H., Park C., Choi J C., Uyama H., Park S L ( 2005a ) “Hyaluronidase inhibitor containing poly--glutamic acid as an effective component” US Patent 12/090,678 47 Sung, M H.; Park, C.; Kim, C J.; Poo, H.; Soda, K and Ashiuchi, M (2005), "Natural and edible biopolymer poly-γ-glutamic acid: synthesis, production, and applications", The Chemical Record 5(6), pp 352-366 48 Sung, M H.; Park, C.; Kim, C J.; Poo, H.; Soda, K and Ashiuchi, M (2005), "Natural and edible biopolymer poly-γ-glutamic acid: synthesis, production, and applications", The Chemical Record 5(6), pp 352-366 49 Suzuki, T and Tahara, Y (2003), "Characterization of the Bacillus subtilis ywtD Gene, Whose Product Is Involved in γ-Polyglutamic Acid Degradation", Journal of Bacteriology 185(7), pp 2379-2382 50 Thorne, C B., Leonard, C.G., 1958 “Isolation of D- and Lglutamyl polypeptides from culture filtrates of Bacillus subtilis”, J Biol Chem., Vol 233, no 5, pp 1109-1112 51 Toshio, H and Seinosuke, U (1982), "Regulation of Polyglutamate 55 Production in Bacillus subtilis (natto): Transformation of High PGA Productivity", Agricultural and Biological Chemistry 46(9), pp 2275-2281 52 Tanimoto, H., Sato, H., Kuraishi, C., Kido, K., Seguto, K., 1995 „High absorption mineral-containing composition and foods” US patent US 5447,732 53 Troy, F.A (1973), "Chemistry and biosynthesis of poly γ D glutamyl capsule in Bacillus licheniformis", J Biol Chem 248, pp 305 316 54 Vedan, I (2006), -poly-glutamic acid, Vedan Taiwan 55 Wang, L L.; Wu, Y X.; Xu, R W.; Wu, G Y and Yang, W T (2008), "Synthesis and Characterization of Poly L-Glutamic Acid-Co-LAspartic Acid", Chinese Journal of Polymer Science 26(04), pp 381-391 56 Yoon, S H.; Jin, H D.; Sang, Y L and Ho, N C (2000), "Production of poly-γ- glutamic acid by fed-batch culture of Bacillus licheniformis", Biotechnology Letters 22(7), pp 585-588 57 Yokoi, H; Arima, T; Hirose, J; Hayashi, S and Takasaki, Y (1996), "Flocculation properties of poly(γ-glutamic acid) produced by Bacillus subtilis", Journal of Fermentation and Bioengineering 82(1), pp 84-87 58 Wu, Q; Xu, H; Xu, L and Ouyang, P (2006), “Biosynthesis of poly(-glutamic acid) in Bacillus subtilis NX–2: Regulation of stereochemical composition of poly(  - glutamic acid)” Process Biochemistry 41(7), pp 1650 – 1655 59 Zeng et al “Production of poly-γ-glutamic acid by a thermotolerant glutamate-independent strain and comparative analysis of the glutamate dependent diference” 60 Wu, Q; Xu, H; Liang, J and Yao, J (2010), "Contribution of Glycerol on Production of Poly(γ-Glutamic Acid) in Bacillus subtilis NX-2", Applied Biochemistry and Biotechnology 160(2), pp 386-392 61 Wan-Tack Ju; Yong, S.; Woo- jin, J.; Ro-Dong, P (2014): “Enhanced production ò poly--glutamic acid by a newly-isolated Bacillus subtilis” 62 Zwartouw from Bacillus H T., anthracis grown in activity” Biochem J 63, 437-442 Smith vivo: H (1956) “Polyglutamic structure and acid aggression PHỤ LỤC Hìn h P L :Ảnhk h uẩnlạctrênmơitrườngđặch iệu,ảnhchụpq u kín a h iểnvin h uộnG m chủngB a cilu sT B trênmôitrườngđặch iệuở9 g iờ Bảng PL1: Thành phần môi trường môi trường lên men sinh tổng hợp -PGA Thành phần Môi trường Môi trường Môi trường Môi trường Môi trường E(g/l) E1(g/l) E2(g/l) E3(g/l) 40,00 20,00 10,00 20,00 Axit citric 12,00 12,00 12,00 12,00 glycerol 80,00 80,00 80,00 80,00 10,00 20,00 40,00 Axit L glutamic Đậu tương bột Cao nấm E4(g/l) 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 MgSO4.7H2O 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 FeCl3 6H2O 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 K2HPO4 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 CaCl2 2H2O 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 MnSO4 H2O 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 men