Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme laccase từ chủng nấm aspergillus niger phân lập được từ rừng núi luốt đại học lâm nghiệp

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ long biết ơn sau sắc đến TS Nguyễn Nhƣ Ngọc ngƣời dành nhiều thời gian hƣớng dẫn tận tình, cung cấp nhiều kiến thức quý báu, tạo điều kện thuận lợi tốt cho em trình thực đề tài khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cán phịng Vi Sinh Hóa Sinh Viện Cơng Nghệ Sinh Học ngƣời giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em học tập q trình làm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành đề tài Một lần nữa, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất người! SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Thị Minh Hiền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Enzyme Laccase 1.1.1 Giới thiệu enzyme Laccase 1.1.2 Tính chất hóa sinh Laccase 1.1.3 Cơ chế hoạt động enzyme 1.1.4 Ứng dụng enzyme Laccase 1.2 Hệ vi sinh vật có khả sinh Laccase 10 1.2.1 Nấm thực vật 10 1.2.2 Vi khuẩn xạ khuẩn 11 1.2.3 Côn trùng 11 1.3 Tổng quan vể chủng nấm Aspergillus niger 11 1.4 Tình hình nghiên cứu enzyme Laccase 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 12 1.4.2 Tính hình nghiên cứu nƣớc 13 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Vật liệu nghiên cứu 14 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 14 2.3.1.Hóa chất mơi trƣờng sử dụng 15 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Xác định hoạt tính enzyme Laccase chủng Aspergillus niger 19 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng sinh enzyme Laccase 20 2.4.3 Thử hoạt tính enzyme Laccase 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết xác định hoạt tính enzyme laccase chủng nấm Aspergillus niger 25 3.2 Kết xác định, chọn lọc môi trƣờng ni cấy thích hợp cho chủng Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme Laccase 25 3.3 Kết khảo sát ảnh hƣởng pH đến khả sinh tổng hợp Laccase 27 3.4 Kết ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme Laccase 29 3.5 Kết ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp Laccase 30 3.6 Kết ảnh hƣởng nguồn đƣờng đến khả sinh tổng hợp Laccase 32 3.7 Kết ảnh hƣởng nguồn nitrogen đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng Aspergillus niger 33 PHẦN 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC VIẾT TẮT Ký hiệu Viết tắt l Microlit ml Mililit mm Milimet ABTS 2, '-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate ETDA Ethylendiamin Tetraacetic Acid SDS Natri dodecyl sulfat VSV Vi sinh vật h Giờ RBBR Rubidium bromide DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc phân tử Laccase Hình 1.2: Hình ảnh cụm xúc tác Laccase hình 3.1: Hình thái chủng nấm mốc Aspergillus niger môi trƣờng PDA 25 Hình 3.2: Hình ảnh thử hoạt tính chất acid tannic chủng nấm mốc Aspergillus niger 25 Hình 3.3: Ảnh vịng phản ứng màu Laccase môi trƣờng chứa chất acid tannic sau 96 26 Hình 3.4: Ảnh vịng phản ứng màu Laccase nuôi pH đến pH sau 96 28 Hình 3.5: Ảnh vịng phản ứng màu Laccase nhiệt độ từ 4oC đến 40oC sau thu dịch 96 29 Hình 3.6: Ảnh đƣờng kính vịng phản ứng màu Laccase với chất aacid tannic tốc độ lắc từ 50 – 200 vòng/phút 31 Hình 3.7: Ảnh vịng phản ứng màu Laccase nguồn cacbon sau 96 nuôi cấy 32 Hình 3.8: Hình ảnh vịng phản ứng màu chủng Aspergillus niger nguồn nitơ khác sau 96 34 DANH MỤC SƠ ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả sinh enzyme Laccase sau 96 nuôi cấy 26 Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng pH đến khả sinh enzyme Laccase 96h 27 Biểu đồ 3.3:Đồ thị ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp enzyme Laccase 29 Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khă sinh tổng hợp enzyme Laccase 31 Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp enzyme Laccase 32 Biều đồ 3.6: Ảnh hƣởng nguồn nitrogen đến khả sinh enzyme Laccase 34 MỞ ĐẦU Việt Nam nƣớc mà tình trạng nhiễm mơi trƣờng trở nên báo động, có tình trạng ô nhiễm nguồn thuốc nhuộm công nghiệp chế biến bột giấy, công nghiệp sản xuất, bảo quản thực phẩm vải, không đƣợc xử lý tốt Đa số nƣớc thải từ khu công nghiệp nhà máy đƣợc xử lý chủ yếu phƣơng pháp hóa học vật lý nhƣ hấp phụ, keo tụ tạo bông, trao đối ion, oxy hóa điện hóa Tuy nhiên, phƣơng pháp có số hạn chế nhƣ tạo bùn thải, chi phí cao sử dụng lƣợng lớn hóa chất Do đó, xử lý nƣớc thải phƣơng pháp sinh học có vai trị quan trọng giá thành rẻ, xử lý triệt để, không tạo sản phẩm thứ cấp Xu hƣớng ứng dụng enzyme ngoại bào nhƣ: Laccase, mangan peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP), có khả xúc tác phản ứng oxy hóa khử đƣợc xem biện pháp hiệu có tiềm ứng dụng cao việc phân giải hợp chất hữu cơ, vô nhƣ: Dichloro - Trichloroethane Diphenyl, lignin (nƣớc thải nhà máy giấy), hydrocarbon vòng thơm (biphenol,benzidine, ) có nƣớc nhiễm dầu mỏ, Trong Laccase đặc biệt đƣợc quan tâm enzyme nằm hệ enzyme lignolytic polyphenol oxydase, có khả oxy hóa diphenol hợp chất có liên quan, loại enzyme xử lý nƣớc thải nghành công nghiệp nhƣ: dệt nhuộm , tổng hợp hữu cơ, thực phẩm , dƣợc phẩm v.v Mặt khác chủng tổng hợp Laccase tự nhiên thƣờng có hoạt tính thấp địi hỏi chất cảm ứng tạo enzym với giá thành cao Trên thị trƣờng enzyme Laccase đƣợc thƣơng mại hóa nhƣng chƣa đƣợc sử dụng phổ biến nhu cầu sử dụng ngƣời cao nhƣng ngƣời ta thƣờng hƣớng tới chế phẩm sinh học hóa học xử lý chất độc nƣớc thải mà giá thành rẻ Trong vài năm gần nghiên cứu nhằm phân lập chủng đột biến chủng vi sinh vật có khả sinh Laccase ngày nhiều Cùng với nhiều nghiên cứu khảo sát điều kiện nuôi cấy chuẩn phân lập tuyển chọn đƣợc để sinh enzyme nhằm mục đích đƣa mơi trƣờng thích hợp cho chủng tiết enzyme cao để tạo nhiều chế phẩm enzyme Laccase hoạt tính tốt giá thành giảm để phục vụ cho nhu cầu sử dụng ngƣời Để đáp ứng nhu cầu nguồn sử dụng enzyme thực đề tài: “Nghiên cứu khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger phân lập từ rừng núi Luốt Đại Học Lâm Nghiệp” CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Enzyme Laccase 1.1.1 Giới thiệu enzyme Laccase Laccase enzyme nằm hệ enzyme lignolytic có khả oxy hóa mạnh hợp chất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, lignin, dioxin, hợp chất có liên quan ngồi chũng cịn phân giải hợp chất vơ nhƣ iot[17] Laccases đóng vai trị quan trọng hình thành lignin cách thúc đẩy liên kết oxi hóa monolignols, họ phenol xảy tự nhiên [1,12] Ở dạng dimer trimer enzyme lacase có hoạt tính chúng oxy hóa phân giải chất độc hại nƣớc thải nhiễm Mà q trình phân giải chất độc hại nƣớc thải chủng vi sinh vật cần lấy oxy từ khơng khí để sinh trƣởng phát triển để sinh enzyme Laccase sản phẩm phụ tạo thành sau phản ứng nƣớc [4] Năm 1896, Laccase đƣợc chứng minh có mặt nấm lần Bertrand Laborde Kể từ hầu hết Laccases đƣợc phân lập từ nguồn gốc nấm đặc biệt từ nấm thối trắng thuộc lớp khác nhƣ Ascomycetes, Basidiomycete Deuteromycetes [10] Năm 1996, Orly Ardon cộng nghiên cứu thân đƣợc tìm thấy chất tuyệt vời cho việc canh tác Pleurotus, chiết xuất cuống đƣợc nghiên cứu cho thấy kích thích phát triển nấm môi trƣờng bề mặt hoạt động Laccase ngoại bào môi trƣờng lỏng Cảm ứng hoạt động Laccase phụ thuộc vào nồng độ chiết xuất bổ sung Sự kích thích Laccase đƣợc quan sát sớm sau sửa đổi CSE Chất nhuộm hoạt tính Laccase sau tách điện di gel cho thấy hai dải điều khiển mơi trƣờng có chiết xuất cuống gây Tất Laccase giống cấu trúc trung tâm xúc tác với nguyên tử đồng Những nguyên tử đồng đƣợc chia thành ba nhóm: Loại (T1), loại (T2) loại (T3), chúng khác tính chất hấp thụ ánh sáng điện Các nguyên tử đồng T1 T2 có tính chất hấp thụ điện tử tạo thành phổ điện tử mạnh, cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện từ hấp phụ điện tử hoạt hóa liên kết với anion mạnh [6] Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc phân tử Laccase Trái ngƣợc với hầu hết enzym, Laccase hoạt động nhiều loại chất nhƣ diphenol, polyphenol, amin thơm, benzenethiols chí số hợp chất vô nhƣ iốt Mặc dù, hầu hết chất Laccases nhiều hợp chất phenolic , độ đặc hiệu chúng đƣợc mở rộng chất trung gian nhƣ: ABTS 1-hydroxybenzotriazole [10] Với tính chất phản ứng với nhiều chất enzyme Laccases đƣợc ứng dụng nhiều nghành công nghiệp khác nhƣ: tẩy thuốc nhuộm, tẩy trắng bột giấy xử lý sinh học Vì vậy, cần tìm hiểu, nghiên cứu Laccases vi sinh từ nhiều nguồn khác nghiên cứu thêm nhiều đặc tính khác để mở rộng tiềm ứng dụng hệ enzyme Laccase với sinh thái Hình 3.4: Ảnh vịng phản ứng màu Laccase nuôi pH đến pH sau 96 Từ hình 3.4 biểu đồ 3.2 ta thấy nấm Aspergillus niger sinh enzyme laccase chủ yếu pH từ – tƣơng đối cao, pH5 vịng hoạt tính cao so với dải pH lại cao pH lại khoảng 0.1 – cm từ ta kết luận pH thích hợp nấm Aspergillus niger pH5 môi trƣờng lỏng VIS Ở pH cao thấp làm cho nấm tiết ngồi mơi trƣờng bị ức chế hoạt tính bị giảm Thời gian ni cấy chủng ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme ta thấy 96 thời gian mà nấm tiết tối đa enzyme thời gian 24 đến 72 enzyme tiết ngồi mơi trƣờng chƣa hết nên hoạt tính chƣa tốt hẳn Sau khoảng thời gian 96 enzyme bị ức chế sinh khối tế bào phát triển nhiều gây ức chế enzyme làm hoạt tính enzyme bị giảm dần Kết nghiên cứu luận án tiến sĩ PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà thu đƣợc cho thấy, pH Lac1 Lac2 đạt hoạt tính cao Lac1 hồn tồn hoạt tính giá trị pH 1, 7, 8, 9, Lac2 pH Về độ bền hoạt tính laccase tinh sạch, Lac1 pH hoạt tính cịn lại 50% giá trị pH 3, hoạt tính lại tƣơng ứng lần lƣợt 21 29% sau h Trong đó, Lac2 pH hoạt tính cịn lại 92% pH 3, 4, hoạt tính cịn lại tƣơng ứng lần lƣợt 54, 55 78% sau h 28 3.4 Kết ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme Laccase Nhiệt độ yếu tố quan trọng sinh trƣởng làm cho nấm bị ức chế hoạt động làm cho nấm sinh trƣởng mạnh sinh enzyme nhiều Dƣới kết thử ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme Laccase Đƣờng kính vịng phản ứng màu (mm) môi trƣờng lỏng đƣợc điều chỉnh pH5 25 20 4oC 15 20oC 10 25oC 30oC 40oC 24h 48h 72h 96h 120h THỜI GIAN Biểu đồ 3.3:Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp enzyme Laccase Hình 3.5: Ảnh vịng phản ứng màu Laccase nhiệt độ từ 4oC đến 40oC sau thu dịch 96 29 Từ biều đồ 3.3 ta nhận thấy chủng nấm CN1 sinh tổng hợp enzyme tốt nhiệt độ 25oC Vòng phân giải nấm 25oC cao chủng khác khảng từ 1.2 – 5.7 lần Ở nhiệt độ cao làm cho enzyme sinh bị giảm hoạt tính nhiệt, cịn nhiệt độ q thấp 4oC nấm sinh trƣởng chậm khả tiết enzyme để phân giải chất acid tannic thấp, 24 gần nhƣ nấm không tiết đƣợc enzyme Theo số nghiên cứu khác chủng Aspergillus sp FNA1 đƣợc phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp đất có nhiễm hợp chất thuốc trừ sâu cho thấy Aspergillus sp FNA1 phát triển tốt 37oC, pH5 Trên mơi trƣờng Czapek nghèo hoạt tính Laccase đạt cao 2608,3 U/l sau ngày ni cấy Laccase từ chủng FNA1 có pH tối ƣu - 5, nhiệt độ tối ƣu 50oC, bền khoảng pH -5 nhiệt độ dƣới 50oC [9] Từ thử nghiệm cho thấy thuộc chi nhƣng chủng nấm Aspergillus lại có mơi trƣờng, pH, nhiệt độ thích hợp cho lồi 3.5 Kết ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp Laccase Đối với chủng nuôi mơi trƣờng lỏng ni điều kiện có lắc tốc độ lắc quan trọng, tốc độ lắc làm cho sinh khối môi trƣờng không bị kết lại tế bào đƣợc tiếp xúc với môi trƣờng làm cho chúng sinh trƣởng tốt Tiến hành nuôi chủng nấm CN1 môi trƣờng lỏng đƣợc điều chỉnh pH5 nuôi lắc 25oC từ 1- ngày, kết đƣợc biểu diễn biểu đồ hình 3.4 30 Đƣờng kính vịng phản ứng màu (mm) 30 25 20 24h 15 48h 10 72h 96h 50 v/p 100 v/p 150 v/p 200 v/p TỐC ĐỘ LẮC Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hưởng tốc độ lắc đến khă sinh tổng hợp enzyme Laccase Hình 3.6: Ảnh đường kính vịng phản ứng màu Laccase với chất aacid tannic tốc độ lắc từ 50 – 200 vòng/phút Dựa vào biểu đồ 3.4 hình 3.6 thấy tốc độ lắc 150 vịng phân giải mơi trƣờng có chứa chất acid tannic đạt kết cao từ thấy ni chủng nấm Aspergillus niger tốc độ lắc 150 vịng/phút mơi trƣờng VIS có pH5 ni 25oC Ở tốc độ lắc 50 vịng/phút 200 vịng phút đƣờng kính vịng phân giải thấp so với tốc độ lắc 150 vòng /phút 31 3.6 Kết ảnh hƣởng nguồn đƣờng đến khả sinh tổng hợp Laccase Đƣờng nguồn cacbon để kiến tạo nên tế bào nấm nhƣng lƣợng cacbon không phù hợp gây ức chế hoạt động nấm nội dung ta tiến hành ni nấm mơi trƣờng VIS có pH5, nhiệt độ 25oC ni lắc 150 vịng/phút Đường kính vịng phản ứng màu (mm) 30 25 20 5g 10g 15 15g 10 20g Glucose Saccharose Fructose Lactose Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp enzyme Laccase Hình 3.7: Ảnh vòng phản ứng màu Laccase nguồn cacbon sau 96 nuôi cấy 32 Dựa kết cho thấy chủng nấm Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme tốt mơi trƣờng có chứa nguồn đƣờng saccharose loại đƣờng dùng với lƣợng 10g/l, nồng độ đƣờng saccharose thấp nấm không đủ nguồn dinh dƣỡng để sinh trƣởng làm hàm lƣợng enzyme bị giảm Ở nồng độ đƣờng cao làm hàm lƣợng đƣờng dƣ thừa ức chế hoạt động nấm enzyme cho nấm sinh trƣởng không đƣợc tốt enzyme đƣợc tiết bị ức chế hoạt động Ở nguồn đƣờng khác nhƣ lactose, fructose, glucose ba nguồn đƣờng khả sinh enzyme cao nhƣng chƣa đƣợc tốt sử dụng saccharose khả hấp thụ loại đƣờng lại đƣờng saccharose Theo nghiên cứu Đào Thị Ngọc Ánh cộng nghiên cứu thấy chủng FBD154 đƣợc phân lập từ vƣờn quốc gia Bidoup-núi bà sinh tổng hợp với hoạt tính Laccase cao 29.183 u/l môi trƣờng chứa mannose, lactose với hoạt tính đo đƣợc 28.541 u/l glucose hoạt tính đạt 23.386 u/l Trong mơi trƣờng có nguồn cacbon xylose, rỉ đƣờng, saccharose mẫu đối chứng hoạt tính Laccase thấp so với nguồn cacbon nêu Đặc biệt, mẫu khơng bổ sung đƣờng hoạt tính Laccase thấp [9] 3.7 Kết ảnh hƣởng nguồn nitrogen đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng Aspergillus niger Để xác định ảnh hƣởng nguồn nitro ta tiến hành nuôi chủng lƣợng khác nguồn nito khác môi trƣờng pH 5, lƣợng đƣờng saccharose dùng 10 g/l, nuôi lắc 25oC 150 vịng/phút Sau tiến hành ta có kết 33 35 30 25 1g 20 2g 15 3g 4g 10 Pepton cao nấm men (NH4)2SO4 NH4Cl Biều đồ 3.6: Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả sinh enzyme Laccase Hình 3.8: Hình ảnh vịng phản ứng màu chủng Aspergillus niger nguồn nitơ khác sau 96 Nhìn biểu đồ ta thấy hàm lƣợng nguồn nito khác có khả phân giải chất acid tannic khác Nhƣng cao nấm men với hàm lƣợng 3g/l vòng phân giải to 3.3 cm to nuôi Aspergillus niger điều kiện nồng độ lại Nhƣ ta thấy cao nấm men thích hợp nguồn nito 34 Kết nghiên cứu Dƣơng Minh Lam cộng sự, năm 2013 khẳng định hoạt tính laccase tốc độ sinh trƣởng, phát triển T maxima CPB30 tăng bổ sung RBBR 0,01% Trong mơi trƣờng, hoạt tính laccase tăng hàng trăm lần bổ sung RBBR nhƣ môi trƣờng khoáng 2,4/183,3, cao men 22/227, cao thịt 6,2/393 U/ml 35 PHẦN 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ loại môi trƣờng ta lựa chọn đƣợc mơi trƣờng VIS mơi trƣờng lên men thích hợp sinh tổng hợp enzyme Laccase cho chủng nấm Aspergillus niger - Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc) đến khả sinh tổng hợp enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger đƣợc kết quả: + Nhiệt độ phù hợp để nuôi chủng 25oC + pH môi trƣờng để chủng sinh enzyme Laccase pH5 + Tốc độ lắc phù hợp 150 vịng/phút + thời gian thích hợp để laccase sinh tổng hợp nhiều khoảng 96 - Khảo sát ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng (cacbon, nito) đến khả sinh tổng hợp enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger đƣợc kết quả: + Nguồn cacbon thích hợp cho sinh trƣởng tơng hợp enzyme Laccase đƣờng saccharose với hàm lƣợng 10g/l + Nguồn nito phù hợp cho chủng sinh tổng hợp enzyme cao nấm men với hàm lƣợng g/l 4.2 Kiến nghị Do không đủ thời gian điều kiện nên đề tài cịn thiếu xót có thời gian điều kiện tơi mong muốn nghiên cứu sâu nhƣ: - Nghiên cứu quy trình tách chiết tinh enzyme Laccase tạo chế phẩm - Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp chủng nấm Aspergillus rộng nhƣ ảnh hƣởng ion kim loại, ảnh hƣởng chất cảm ứng, 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Trịnh Thu Thủy1* , Nguyễn Văn Giang1 , Nguyễn Ngọc Bằng2 , Phạm Thu Trang ‗‗phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme Laccase từ gỗ mục’’ Tạp chí Khoa học Phát triển 2015, tập 13, số 7: 11731178 [2] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Nguyên Quang với Đề tài: ―Phân lập nghiên cứu khả chuyển hóa số chất đa vòng thơm nấm sợi sinh tổng hợp enzyme Laccase từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin‖ Năm 2008 -2010 [3] Nguyễn Khởi Nghĩa ―phân lập tuyển chọn số dịng nấm từ gỗ mục có khả loại màu thuốc nhuộm đồng sông cửu long” Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ Tập 53, Phần B (2017): 79-87 [4] nguyễn ngọc hà Luận văn dƣợc sĩ chuyên khoa cấp đề tài ― bƣớc đầu chế tạo đánh giá hoạt tính enzyme Laccase phức hệ nano chitosan‖ [5] Nguyễn Thị Phƣơng Mai1, 2, Lê Quang Hịa1 , Tơ Kim Anh1 Tinh xác định đặc tính Laccase tái tổ hợp từ aspergillus niger D15#26 lcc1 1.8B Tạp chí Khoa học Công nghệ 50 (3) (2012) 297-307 [6] Đào thị ngọc ánh ―Nghiên cứu phân loại, khả phân hủy DDT sinh Laccase chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu” [7] Ảnh hƣởng số ion kim loại lên khả sinh tổng hợp Laccase nấm Pleurotus sp - Ngụy Thị Mai Thảo, Trần Văn Khuê, Lƣơng Bảo Uyên* Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hồ Chí Minh, *baouyenih@yahoo.com - tạp chí sinh học 2014, 36(1se): 107-111 [8] TS Đặng vũ hồng miên hệ nấm mốc việt nam [9] Trần Thị Thu Hiền, Lê Thị Hiền, Nguyễn Văn Huynh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị cẩm Hà phân lập, ―Nghiên cứu môi trường thích hợp sinh tổng hợp Laccase chủng nấm đảm thu thập từ vườn quốc gia bidoup- núi bà 37 khả loại màu thuốc nhuộm chủng” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(2): 313-325, 2016 [10] Đào Thị Ngọc Ánh, Nguyễn Nguyên Quang, Đặng Thị Cẩm Hà (viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh Laccase chủng nấm Aspergillus sp FNA1 Tài liệu tiếng anh [11] S.S Desai and C Nityanand, 2011 Microbial Laccases and their Applications: A Review Asian Journal of Biotechnology, 3: 98-124 [12] Production of Lactase by Trichoderma sp Isil Seyis* and Nilufer Aksoz - Hacettepe University, Faculty of Science, Department of Biology, Beytepe, TR-06532 Ankara, Turkey - Food Technol Biotechnol 42 (2) 121– 124 (2004) [13] Sergio Riva (2006) Laccase: blue enzymes for green chemistry.trends biotechnology, 24(5): 219-226 [14] Tatiana Alves Rigamonte Fernandes 1,2 * , Wendel Batista da Silveira , Flávia Maria Lopes Passos , Tiago Domingues Zucch Laccases from Actinobacteria—What We Have and What to Expect [15] Yamazaki HI Cuticular phenoloxidase from the silkworm, bombyx mori: properties, solubilization, and purification Insect Biochemistry 1972;2(8):431–444 [16] US National Library of Medicine National Institutes of Health Laccase: Microbial Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications [17] Arias ME, Arenas M, Rodríguez J, Soliveri J, Ball AS, Hernández M Kraft pulp biobleaching and mediated oxidation of a nonphenolic substrate by Laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335 [18] Toca-Herera, J.L.,JF Osma and S.Rodriguez-Couyo, 2007 Potential of Solid-State Fermentation for laccase Production In: Conmmunicating Curent 38 Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, MendezVilas, A (Ed) Formatex Publishers, Spain, ISBN: 9788461194223, pp: 391400 [19] Verma, A.K., C Raghukumar, P.Verma, Y.S.Shouche and C.G.Naik, 2010 Four marine-derived fungi for bioremediation of raw textile mill efuents Bioderadation, 21: 217-233 Trang web tham khảo [20] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2962899/ [21] https://www.researchgate.net/figure/Model-of-catalytic-cluster-ofLaccase-made-of-four-copper-atoms-Type-1-T1-copper_fig1_26280180 39 PHỤ LỤC Dƣới bảng số liệu đƣờng kính vịng phân giải màu điều kiện nuôi cấy thu enzyme khác nhau: Bảng 3.1: Kết ảnh hưởng môi trường đến khả sinh enzyme Laccase chủng nấm CN1 Thời gian 24h 48h 72h 96h 120h Môi trƣờng 1.99 0.01 4.83 0.29 6.93 0.12 10.03 0.06 6.97 0.06 GYMP 2.97 0.06 5.90 0.17 6.90 0.17 5.00 0.10 4.27 0.46 MEG 1.99 0.02 4.27 0.46 6.03 0.06 7.97 0.06 7.03 0.06 PDB 0.99 0.01 4.30 0.52 8.03 0.06 6.03 0.06 1.93 0.12 Cám trấu 0.00 0.00 1.97 0.06 4.97 0.06 7.05 0.07 6.10 0.10 VIS Đơn vị: mm Bảng 3.2: Kết ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme Laccase Thời gian 24h 48h 72h 96h 120h 4.93 0.12 11.10 0.10 15.07 0.12 17.03 0.06 11.97 0.06 4.97V 06 9.03 0.06 13.03 0.06 19.07 0.12 16.10 0.10 5.10 0.10 10.93 0.12 15.97 0.06 20.10 0.10 17.10 0.10 0.38 0.03 9.27 0.46 14.90 0.17 15.97 0.06 3.97 0.06 7.93 0.12 9.90 0.10 12.93 0.12 10.93 0.12 1.97 0.06 6.90 0.17 12.03 0.06 12.97 0.06 8.97 0.06 1.93 0.12 6.93 0.12 8.90 0.17 10.93 0.12 8.93 0.12 10 0.97 0.06 5.90 0.17 8.87 0.15 9.90 0.10 7.27 0.46 pH Đơn vị : mm 40 9.93 0.12 Bảng 3.3: Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme Laccase Thời gian 24h 48h 72h 96h 120h 4oC 0.00 0.00 0.97 0.06 2.93 0.12 3.90 0.10 4.93 0.12 20oC 4.03 0.06 6.97 0.06 10.07 0.06 12.03 0.06 10.03 0.06 25oC 5.10 0.10 11.03 0.06 21.03 0.06 23.10 0.10 20.07 0.12 30oC 3.97 0.06 9.90 0.10 15.97 0.06 19.03 0.06 15.90 0.17 40oC 4.97 0.06 9.23 0.40 11.90 0.10 16.93 0.12 14.90 0.17 Nhiệt độ Đơn vị : mm Bảng 3.4: Kết ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh enzyme Laccase Thời gian 24h 48h 72h 96h 120h 50 2.90 0.17 5.93 0.12 8.03 0.06 11.07 0.12 8.93 0.12 100 4.93 0.12 11.03 0.06 17.03 0.06 22.03 0.06 19.03 0.06 150 7.07 0.12 15.03 0.06 20.03 0.06 25.07 0.12 21.07 0.12 200 4.90 0.17 12.93 0.12 18.93 0.12 21.90 0.10 18.93 0.12 Tốc độ lắc Đơn vị: mm 41 Bảng 3.5: Kết ảnh hưởng loại đường đến khả sinh enzyme g/l 5g 10g 15g 20g Glucose 10.07 0.12 23.93 0.12 23.03 0.06 16.97 0.06 Saccharose 13.03 0.06 26.97 0.06 22.07 0.12 19.07 0.12 Fructose 8.93 0.12 17.03 0.06 21.97 0.06 20.07 0.06 Lactose 10.97 0.06 17.90 0.17 23.93 0.12 16.90 0.17 Nguồn cacbon Đơn vị: mm Bảng 3.6 Kết ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng nấm g/l 1g 2g 3g 4g Pepton 11.90 0.17 22.07 0.12 31.07 0.12 24.07 0.12 cao nấm men 15.03 0.06 24.03 0.06 33.03 0.06 27.03 0.06 (NH4)2SO4 13.93 0.12 20.90 0.17 26.90 0.17 20.93 0.12 NH4Cl 14.90 0.10 19.93 0.12 27.90 0.10 21.90 0.17 Nguồn nitrogen Đơn vị: mm 42