Phân lập, tuyển chọn các chủng baciluus subtilis có khả năng sinh tổng hợp poly gamma glutamic acid

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Baciluus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP POLY GAMMA GLUTAMIC ACID NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Vũ Kim Dung Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hải Yến Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài khóa luận, em xin chân thành cảm ơn thầy cô ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, đặc biệt ban lãnh đạo Viện thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập trƣờng Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Th.S Đào Văn Minh – cán phịng Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp – Viện Nghiên cứu Phát triển Vùng, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình giúp đỡ em suốt thời gian thực tập nghiên cứu, giúp cho em có thêm kiến thức chuyên môn, xây dựng tảng vững phục vụ cho việc học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Vũ Kim Dung – chủ nhiệm mơn Vi sinh – Hóa sinh viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè, ngƣời ln bên động viên, khích lệ, giúp đỡ em suốt q trình học tập, làm việc hoàn thành đề tài Với cố gắng thực đề tài cách nghiêm túc nhƣng thiếu sót hạn chế thân, gặp phải điều mà em chƣa làm đƣợc Rất mong nhận đƣợc đóng góp đƣa ý kiến quý thầy giáo, cô giáo để luận văn đƣợc hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Polygammar Glutamic Acid 1.1.1 Giới thiệu PGA 1.1.2 Tính chất PGA 1.1.3 Phân loại PGA 1.1.4 Ứng dụng PGA 1.2 Các nguồn thu nhận PGA 1.2.1 Bacillus subtilis 1.2.2 Bacillus licheniformis 10 1.2.3 Bacillus anthracis 10 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp PGA 10 1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp PGA 13 1.4.1 Ảnh hƣởng yếu tố dinh dƣỡng 13 1.4.2 Ảnh hƣởng yếu tố ngoại cảnh 14 1.5 Thu hồi PGA 15 1.6 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 15 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu 18 2.3.1 Nguồn phân lập 18 2.3.2 Hóa chất 18 2.3.3 Môi trƣờng nuôi cấy 18 ii 2.3.4 Thiết bị 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn chủng có khả sinh PGA 19 2.4.2 Phƣơng pháp giữ giống vi sinh vật 21 2.4.3 Phƣơng pháp định tên sinh hóa sinh học phân tử 21 2.4.4 Phƣơng pháp khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh tổng hợp PGA 25 2.4.5 Phƣơng pháp thu hồi PGA 27 2.4.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng PGA 27 2.5 Phƣơng pháp xác định sơ khả loại bỏ ion Fe3+, Cu2+ 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Phân lập 29 3.2 Tuyển chọn đƣợc chủng B subtilis có khả sinh tổng hợp PGA cao 31 3.3 Định tên 34 3.3.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa 34 3.3.2 Định danh sinh học phân tử 35 3.4 Kết khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp PGA chủng TN5 39 3.4.1 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh tổng hợp PGA 39 3.4.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy 40 3.4.3 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng – Natri glutamate 41 3.4.4 Ảnh hƣởng tỉ lệ cấp giống 42 3.4.5 Ảnh hƣởng nồng độ nitơ 43 3.5 Xác định sơ khả kết tủa ion Fe3+, Cu2+ 44 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chủng vi khuẩn có khả tạo γ-PGA (Candela Fouet) Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập 29 Bảng 3.2 Khả phát triển chủng vi sinh vật môi trƣờng đặc hiệu (E đặc) 31 Bảng 3.3 Sự thay đổi hàm lƣợng PGA thời gian nuôi cấy chủng vi sinh vật 32 iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử γ-PGA (Shih, Van, 2001) Hình 1.2 Ứng dụng PGA sản xuất nông nghiệp Hình 1.3 Bacillus subtilis (A&A Bio) Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp γ-PGA (Lou cs, 2016) 11 Hình 1.5 Q trình polymer hóa γ-PGA (Sung cs, 2005) 12 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn γ-PGA 28 Hình 3.1 Sự phát triển chủng vi sinh vật môi trường E sau 96 33 Hình 3.2 Hình thái chủng TN5 34 a Hình thái khuẩn lạc 34 b Kết phản ứng VP 34 c Kết phản ứng catalase 34 d Kết nhuộm Gram 34 Hình 3.3 Điện di đồ DNA tổng số chủng TN5 35 Hình 3.4 Sản phẩm PCR vùng 16S RNA chủng TN5 36 Hình 3.5 Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng TN5 37 Hình 3.6 So trình tự 16s RNA chủng TN5 NCBI 38 Hình 3.7 Biểu đồ biểu ảnh hưởng pH đến khả sinh PGA chủng B.subtillis TN5 39 Hình 3.8 Khảo sát thời gian nuôi cấy chủng B subtillis TN5 40 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả sinh PGA 41 Hình 3.10 Biểu đồ thể ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống đến khả sinh PGA chủng B subtilis TN5 42 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ NH4Cl đến khả sinh PGA chủng B subtilis TN5 43 Hình 3.12 Khả loại ion Fe3+, Cu2+(a kết tủa ion Fe3+, b kết tuả ion Cu2+) 44 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT γ-PGA: Poly γ- glutamic acid rRNA: Ribonucleic aicd PDGA: Poly- D glutamic aicd PCR: Polymelase Chain Reaction D, L-γ-PGA: D, L-poly gammar glutamic acid C: Canxi TE: Đệm Tris- HCL EDTA H: Hidro Rpm: vòng/ phút O: Oxi TCA: Trichloroacitric acid N: Nito CET: CTAB 0,1M + NaCl 1M g/l: Gam/lit CTAB: Cityltrimethyl ammo E: môi trƣờng đặc hiệu CS: Cộng ATP: Adenosine triphosphate OD: Độ đục DNA: Deoxylribonucleic acid EDTA: Ethylene diamine tetra citric rRNA: Ribonucleic aicd riboxom LB: Luria Bertani v/v: thể tích/ thể tích w/v: khối lƣợng/thể tích vi ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, sản phẩm lên men truyền thống phong phú Trong sản phẩm lên men từ đậu tƣơng với hệ vi sinh đặc trƣng, cung cấp nhiều hợp chất có lợi cho ngƣời Việc khai thác hệ vi sinh vật từ sản phẩm lên men phát triển cung cấp nhiều hợp chất có khả ứng dụng rộng rãi Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đƣợc vi sinh vật tổng hợp sử dụng vào chu trình sống chúng So với hợp chất đƣợc tổng hợp đƣờng hóa học chúng có ƣu điểm vƣợt trội nhƣ an tồn cho sức khỏe ngƣời, thân thiện với môi trƣờng Do đó, acid poly γ-glutamic (PGA) đƣợc sản xuất từ vi khuẩn đƣợc xem nguồn lƣợng tiềm ngành công nghệ sinh học Axit Poly γ-glutamic (PGA) đƣợc tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn Bacillus có nhiều sản phẩm lên men từ đậu tƣơng: Natto, Chungkookjang, Thua nao PGA polymer mang điện tích âm, tồn dƣới dạng homo-polyamide đƣợc hình thành D - L - glutamic nối với liên kết hai nhóm α-amino γ-carboxyl PGA có khối lƣợng phân tử lớn nằm khoảng khối lƣợng từ 100 – 2000kDa Chính đặc tính PGA phong phú: khả hịa tan nƣớc lớn, có khả bị phân hủy sinh học, không gây độc hại cho thể sinh vật môi trƣờng Do axit Poly γ-glutamic có nhiều ứng dụng nhiều lĩnh vực: thực phẩm, y tế, môi trƣờng, nông nghiệp số ngành công nghiệp khác Đã đƣợc nhiều công ty giới sản xuất với giá thành cao Tại Việt Nam, chƣa có nghiên cứu sản xuất PGA từ vi khuẩn đƣợc phân lập từ Tƣơng Xuất phát từ vấn đề trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả sinh tổng hợp Poly gamma glutamic acid” CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Polygammar Glutamic Acid 1.1.1 Giới thiệu PGA Axit poly gamma glutamic (γ-PGA) polymer tự nhiên, mang điện tích âm có đơn phân axit L – glutamic hay axit D – glutamic chứa hai đơn phân liên kết với mối liên kết nhóm γ – carboxyl nhóm α – amino (Shih Van, 2001) Khả tham gia phản ứng hóa học với nhóm α – NH2 nhóm α – COOH tạo nên liên kết α – peptit, tạo sản phẩm α – PGA thơng qua phản ứng hóa học cách trùng hợp nucleophile Nhƣng có đƣợc hệ xúc tác thích hợp, nhóm α – NH2 liên kết với nhóm γ – COOH để tạo nên liên kết γ – peptit Sự hình thành γ – PGA khác với hình thành protein, glutamate đƣợc polymer hóa bên tế bào thơng qua mối liên kết γ – amide, tổng hợp cách độc lập với ribosome Do vậy, chất ức chế protein, chẳng hạn chứa chloramphenicol khơng có ảnh hƣởng đến việc tổng hợp y – PGA Nhờ trình polymer hóa, γ – PGA đƣợc hình thành từ 10000 phân tử axit glutamic Tùy theo môi trƣờng phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, γ – PGA đƣợc hình thành với loại khác nhau, loại đƣợc tạo thành từ toàn D-γ-PGA, loại đƣợc tạo thành nhờ toàn L-γ-PGA loại đƣợc tạo thành nhờ polymer hóa hỗn hợp D,L-γ-PGA Sự khác biệt có đƣợc vi khuẩn có khả chuyển hóa trực tiếp hay gián tiếp axit Lglutamic thành axit D-glutamic hai dạng thành đồng trùng hợp tạo D,L-γ-PGA gọi chung γ-PGA Hình 1.1 Cấu trúc phân tử γ-PGA (Shih, Van, 2001) γ – PGA lần đƣợc phát Inovovics Brukner viên nang Bacillus anthracis đƣợc thả vào môi trƣờng sau hấp khử trùng (Shih Van, 2001) Một nguồn tự nhiên khác γ – PGA chất nhầy natto (đậu nành lên men – loại thực phẩm truyền thống Nhật Bản), có chứa hỗn hợp γ – PGA fructan đƣợc sản sinh Bacillus subtilis Sawamura (Shih Van, 2001; Candela Fouet, 2006) 1.1.2 Tính chất PGA Cơng thức phân tử: (C5H7NO3)n Kích thƣớc nhƣ khối lƣợng polyme đa dạng phụ thuộc vào cấu trúc nhƣ dạng liên kết với chất khác canh trƣờng vi sinh vật Khối lƣợng trung bình phân tử γ-PGA từ vài kDa đến hàng triệu kDa Nhìn chung, phân tử γ – PGA thƣờng có khối lƣợng lớn nhiều so với D-PGA hay L-PGA Dạng neo thƣờng có kích thƣớc nhỏ dạng tự (Sung cs, 2005) Tính chất vật lý: Axit poly γ-glutamic polymer tự nhiên, tinh thể có màu trắng, khơng màu, khơng mùi, khơng vị γ-PGA bị phân hủy sinh học, khơng độc với môi trƣờng, sinh vật ngƣời Axit poly γglutamic hòa tan tốt nƣớc tạo đƣợc liên kết bền vững với nƣớc, khả giữ nƣớc đƣợc xem tính chất trội axit poly γglutamic Nó đƣợc phân tách với thành phần trung tính khác nhờ sắc kí giấy (Ho cs, 2006) Tính chất hóa học: Do liên kết dƣ lƣợng glutamate thành phần nên γ – PGA có khả kháng protease, loại bỏ liên kết α – amino γ – PGA tồn dạng acid tự không tan nƣớc hịa tan hồn tồn nƣớc dƣới dạng muối với nhiều loại cation (Na+, Mg2+, K+, NH4+ hay Ca2+) Do tính chất nhóm cacboxyl amoni nên PGA có tính chất lƣỡng tính (Ho cs, 2006) kết thu đƣợc tế bào có hình que (trực khuẩn) Đặc tính sinh lý, sinh hóa: chủng có khả phát triển mơi trƣờng có nồng độ muối: 1-8%, pH 4-9, nhiệt độ dao động từ 25-50oC sinh khối cao từ 30-37oC, Catalase (+), VP (+), quan sát tế bào nhuộm Gram cho thấy chủng đƣợc chọn lựa trực khuẩn Gram (+) Qua đặc điểm chúng khẳng định TN5 chi Bacillus 3.3.2 Định danh sinh học phân tử Để khẳng định xác tên lồi chúng tơi tiến tách giải trình tự vùng 16SrRNA Để tách đƣợc gen mã hóa vùng 16S rRNA, bƣớc quan trọng tách chiết DNA hệ gen Sau tách DNA tổng số tiến hành điện di gel agarose 1% Kết cho thấy xuất băng rõ nét, không bị đứt gãy Hình 3.3 Điện di đồ DNA tổng số chủng TN5 3.3.2.1 Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA phản ứng PCR Ribosom có tất vi sinh vật đóng vai trị quan trọng tổng hợp protein Hơn gene mã hố rRNA có tính bảo thủ cao nên đƣợc sử dụng rộng rãi nghiên cứu đa dạng vi sinh vật thông tin quan trọng để định loại vi sinh vật Hiện ba loại gene mã hoá rRNA vi khuẩn (5S, 16S, 23S) gene mã hố cho 16S rRNA đƣợc nghiên cứu sử dụng nhiều có tính bảo thủ kích thƣớc khoảng 1500 bp đủ để phân loại loài dễ thao tác thí nghiệm Các cặp mồi đa đƣợc thiết kế ứng dụng để nhân đoạn gene 16S rRNA từ vi khuẩn khác Trong nghiên cứu này, sử dụng cặp mồi 27F 35 1492R để nhân đoạn gene 16S rRNA chủng TN5 theo thành phần chu trình nhiệt phần phƣơng pháp Phản ứng PCR đƣợc tiến hành sử dụng DNA tổng số chủng TN5, làm sợi khn, cặp mồi đặc hiệu chu trình nhiệt nhƣ nêu phần phƣơng pháp Kết điện di đồ sản phẩm PCR đƣợc thể hình 3.5 1500bp Hình 3.4 Sản phẩm PCR vùng 16S RNA chủng TN5 1: marker 1,5kb, : đoạn 16S RNA chủng TN5 Kết cho thấy sản phẩm PCR xuất băng có kích thƣớc khoảng 1500 bp nhƣ tính tốn lý thuyết Trên điện di đồ không thấy xuất sản phẩm phụ 3.3.2.2 Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng TN5 so sánh giữ liệu ngân hàng gen Sản phẩm PCR 16s rRNA sau tinh đƣợc tiến hành gửi giải trình tự hai chiều theo phƣơng pháp Sanger cải tiến Trình tự hai chiều đƣợc phân tích chƣơng trình http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html phần mềm BioEdit kết nhƣ hình 3.5 GCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGG ATACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCG CATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATG GACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAG GCGAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG 36 GACTGAGACACGGCCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATTGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGA GTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAAC AAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGA AAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT GGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCG GTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGT CATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATT CCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGT GGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT AAACGATGAGTGCTAAGTGTTAAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCT GCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAA GACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA GCATGGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTC TTGACATCCTCTGACAATCCTAGAAGATAGGACGTCCCCTTCGGGG GCAGAGTGACAGGTGGTTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA AATGTTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGT TGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAA CCGGAGGAAAAGGTTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAC CGAAACCCCCGAGGTTAACCCAATTCCCCCAAATTTGTTTTCCATT TCGGATCCAAATCTGGAACTTCAATGGCTTGAAACTGGGAATCCCT TTGAATCCCGAATAACCATGGCCGCGGGGAATACATTCCCCGGCC TTGGTAACCCCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTTTT Hình 3.5 Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng TN5 Kết cho thấy đoạn gen 16S rRNA chủng TN5 có 1400 bp Kiểm tra độ tƣơng đồng ngân hàng gen giới chƣơng trình Blast sở liệu NCBI cho kết hình 3.7 37 Hình 3.6 So trình tự 16s RNA chủng TN5 NCBI Kết so sánh trình tự 16S rRNA với liệu ngân hàng gen giới chƣơng trình BLAST, cho thấy chủng TN5 có độ tƣơng đồng cao với chi Bacillus Trong có độ tƣơng đồng 99% với loài Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens Kết hợp đặc điểm sinh lý, sinh hóa chúng tơi khẳng định chủng TN5 lồi Bacillus subtilis có độ tƣơng đồng 99% với chủng có mã hiệu nhƣ sau: EU294409.1, EU294410.1, KF112078, EU294413.1|, JX860845.1, KC146707.1 Từ kết khẳng định chủng TN5 thuộc chi Bacillus subtilis đặt tên chủng Bacillus subtilis TN5 38 3.4 Kết khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp PGA chủng TN5 3.4.1 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp PGA pH môi trƣờng nuôi cấy yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến trình sinh trƣởng sinh tổng hợp PGA chủng vi sinh vật Theo số công trình nghiên cứu cơng bố trƣớc, điều kiện sinh tổng hợp γ-PGA tốt khoảng pH – 7,5 Khảo sát thay đổi pH khoảng – 9, chủng vi sinh vật B subtillis TN5 đƣợc tăng sinh mơi trƣờng LB, sau tiến hành cấp giống 3% (v/v) sang môi trƣờng E Lên men 35oC, chế độ nuôi tĩnh, lấy mẫu thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, ly tâm loại sinh khối tiến hành xác định hàm lƣợng PGA Kết đƣợc thể biểu đồ: 16.00 13.23 Nồng độ PGA (mg/ml) 14.00 12.00 10.00 10.20 8.71 24 8.00 48 6.00 4.60 4.00 72 96 2.00 0.00 pH=6 pH=7 pH pH=8 pH=9 Hình 3.7 Biểu đồ biểu ảnh hưởng pH đến khả sinh PGA chủng B.subtillis TN5 pH có ảnh hƣởng lớn đến khả sinh PGA chủng vi sinh vật B subtillis TN5 Ở giá trị pH = 9, nồng độ PGA thấp có biến động khơng nhiều (cao 96 với hàm lƣợng 4,6 mg/ml – 4,5g/l) Hàm lƣợng PGA đạt giá trị cao 13,23 g/l pH = 7, sau pH8 pH6 So với báo cáo Wu Qun cs (2010), pH tối ƣu cho trình tổng hợp PGA 6,5 Điều khẳng định đặc tính khả thích ứng chủng khác Do chủng đƣợc phân lập từ nguồn khác điều kiện sinh 39 thái mơi trƣờng vùng có thay đổi lớn Vì lựa chọn pH = cho nghiên cứu 3.4.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy Thời gian lên men yếu tố quan trọng để xác định đƣợc thời điểm thu hồi PGA tốt Xác định đƣợc thời gian chủng B subtillis TN5 có khả tạo hàm lƣợng PGA cao khoảng thời gian ngắn xác định đƣợc thời gian thực nghiên cứu Chủng B subtillis TN5 đƣợc tăng sinh mơi trƣờng LB, sau tiến hành cấp giống 3% sang môi trƣờng E Lên men 35oC, chế độ nuôi tĩnh, lấy mẫu thời điểm 24, 48, 72, 96 120 Ly tâm loại sinh khối tiến hành xác định hàm lƣợng PGA Kết đƣợc thể biểu đồ: 16.00 Nồng độ PGA (mg/ml) 14.00 12.00 13.23 13.46 96 120 10.54 10.00 7.06 8.00 6.00 4.53 4.00 2.00 0.00 24 48 72 Thời gian Hình 3.8 Khảo sát thời gian nuôi cấy chủng B subtillis TN5 Qua kết cho thấy, khoảng thời gian từ 24 đến 96 hàm lƣợng PGA tăng mạnh đạt cực đại 96 với hàm lƣợng 13,23 mg/ml Qua 96 giờ, hàm lƣợng PGA có tăng nhƣng không đáng kể (từ 13,23 tăng lên 13,46 mg/ml) Do lựa chọn mốc thời gian 96 thời gian thích hợp cho nghiên cứu 40 3.4.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng – Natri glutamate Nồng độ chất cảm ứng nguồn chất cảm ứng hệ gen vi sinh vật tổng hợp hợp chất mong muốn Chất cảm ứng đƣợc sử dụng trình tổng hợp PGA natri glutamate đƣợc thay đổi nồng độ 0; 1; 2; % (w/w) Đã có nghiên cứu có lồi vi sinh vật khơng cần bổ sung nguồn chất cảm ứng có khả tổng hợp PGA Tuy nhiên, phần lớn nghiên cứu phải bổ sung nguồn chất cảm ứng Hàm lƣợng chất cảm ứng ảnh hƣởng đến trình tổng hợp nên chất cần thiết, q trình tổng hợp chất mong muốn suy giảm, ngƣợc lại nhiều ức chế trình tổng hợp Chủng TN5 sau đƣợc tăng sinh môi trƣờng LB 24 giờ, lắc 140 v/p, tiến hành cấp giống 3%(v/v) sang môi trƣờng lên men Quá trình lên men đƣợc ni 35oC, pH 7, ni tĩnh, lấy mẫu thời điểm 96 tiến hành xác định hàm lƣợng PGA 25.00 20.70 20.00 14.22 15.00 12.60 10.57 10.00 5.00 4.60 0.00 0% 1% 2% 2.5% 3% Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả sinh PGA Kết cho thấy chất cảm ứng có ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng PGA đƣợc sinh Ở nồng độ 0% (w/v) hàm lƣợng PGA đạt thấp 4,60 mg/ml tăng dần nồng độ Hàm lƣợng PGA cao đạt 20,70mg/ml (tƣơng ứng 20,7 g/l) nồng độ 2,5% (w/v) Lƣợng PGA tạo thành có xu hƣớng giảm dần nồng độ chất tăng lên Kết 41 trùng hợp với nghiên cứu Cromwick cs (1996) Nghiên cứu việc bổ sung 20 – 30 g/l acid glutamic vào canh trƣờng lên men phù hợp để sinh tổng hợp PGA 3.4.4 Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống Tỉ lệ cấp giống yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến trình lên men Tỉ lệ cấp giống cao hay thấp có ảnh hƣởng khơng tốt đến q trình lên men Khi tỉ lệ cấp giống thấp, tỉ lệ vi sinh vật ban đầu ít, tăng thời gian lên men có khả nhiễm tạp gây nên hiệu khơng cao Ngƣợc lại tỉ lệ cấp giống cao, tỉ lệ vi khuẩn ban đầu nhiều, khả tiêu thụ chất cảm ứng lớn gây nên ức chế trình sinh trƣởng phát triển vi sinh vật Chủng TN5 đƣợc tăng sinh cấp giống sang môi trƣờng E với tỉ lệ: 1%, 3%, 5%, 10% (v/v), lấy mẫu thời điểm 96 tiến hành xác định hàm lƣợng PGA Kết thu đƣợc thể qua biểu đồ dƣới đây: Chart Title 25.00 22.52 20.85 20.00 15.00 13.23 10.20 10.00 5.00 0.00 1% 3% 5% 10% Hình 3.10 Biểu đồ thể ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống đến khả sinh PGA chủng B subtilis TN5 Nghiên cứu với tỷ lệ cấp giống đến trình hình thành γ-PGA dao động khoảng 1% đến 10% với thời gian lên men 96 cho thấy: lƣợng cấp giống tỉ lệ 5% cho hàm lƣợng PGA cao đạt 22,52 mg/ml (tƣơng ứng 22,5 g/l) Tại tỉ lệ cấp giống 10% khả sinh tổng hợp 42 PGA giảm, đạt 10,2 mg/ml nồng độ 10% 13,2 mg/ml nồng độ 1% Nhƣ tỉ lệ cấp giống cao hay ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp, q vi khuẩn cần phải có thời gian sinh trƣởng phát triển, hình thành γ-PGA cần phải kéo dài hơn, tỷ lệ cấp giống cao dẫn tới cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng giai đoạn sinh trƣởng, gây cân canh trƣờng dẫn đến hình thành sản phẩm phụ, thay đổi môi trƣờng pH, ảnh hƣởng đến hiệu suất sinh γ-PGA Qua đó, lựa chọn tỉ lệ cấp giống 5% cho nghiên cứu 3.4.5 Ảnh hưởng nồng độ nitơ C, H, N, O ngun tố khống đa lƣợng khơng thể thiếu để cấu thành nên tế bào vi sinh vật Trong đó, nitơ nguồn dinh dƣỡng khơng thể thiếu thể sống để tổng hợp nên thành phần tế bào quan trọng nhƣ protein, acid nucleic, enzyme… Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ nitơ đến khả tổng hợp PGA chủng B subtillis TN5 quan trọng Với mục đích lựa chọn đƣợc nồng độ nitơ thích hợp để thu đƣợc PGA với nồng độ cao chi phí thấp 30.00 26.91 24.31 Nồng độ PGA (mg/ml) 25.00 22.73 20.70 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0.4% 0.7% 1.1% 1.5% Tỉ lệ NH4Cl Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ NH4Cl đến khả sinh PGA chủng B subtilis TN5 43 Qua nghiên cứu nhận thấy hàm lƣợng PGA đƣợc tổng hợp môi trƣờng E với tỷ lệ nitơ khác thay đổi lớn Ở tỉ lệ NH4Cl 1,1% đạt giá trị PGA cao 26,91 mg/ml (26,91 g/l) Nhƣ vậy, lựa chọn nồng độ Nitơ 1,1% (11g/l) cho nghiên cứu sau 3.5 Xác định sơ khả kết tủa ion Fe3+, Cu2+ PGA đƣợc biết đến nhƣ chất có khả ứng dụng xử lý mơi trƣờng Do có khả liên kết với ion kim loại tạo phức kết tủa, nên PGA đƣợc ứng dụng nhiều vào hệ thống xử lý nƣớc thải để loại bỏ ion kim loại, nhà máy mạ để thu hồi tái sử dụng kim loại Do vậy, tiến hành khảo sát khả loại ion kim loại phịng thí nghiệm với ion Fe3+, Cu2+ sau thí nghiệm nhìn thấy rõ kết tủa hình 3.13 b a Hình 3.12 Khả loại ion Fe3+, Cu2+ (a kết tủa ion Fe3+, b kết tuả ion Cu2+) Kết phân tích cho thấy hàm lƣợng μg PGA khả loại ion Fe3+ đến 80% Kết khả quan cần đƣợc nghiên cứu sâu điều kiện kết tủa nhƣ pH, khối lƣợng phân tử PGA Đối với Cu2+ khả kết tủa hơn, loại khoảng 20% Cu2+ nồng độ 2,5 μg PGA Kết giải thích pH q trình kết tủa 7, mà theo nghiên cứu trƣớc pH kết tuả Cu2+ pH axit… Để xác định đầy đủ thơng số q trình kết tủa cần phải có nghiên cứu sâu nhƣ pH, khối lƣợng PGA… Qua cho thấy PGA có tiềm ứng dụng môi trƣờng lớn 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã phân lập đƣợc chủng vi sinh vật, chủng vi sinh vật từ tƣơng Nam Đàn (Nghệ An), chủng từ tƣơng nếp Úc Kỳ (Phú Bình, Thái Nguyên), chủng từ Natto (đậu nành lên men – Nhật Bản) Tuyển chọn đƣợc chủng vi sinh vật có khả sinh PGA cao TN5 định tên chủng TN5 có tên Bacillus subtilis TN5 - Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp PGA chủng TN5 bao gồm: pH thích hợp: pH = 7, thời gian 96 giờ, nồng độ natri glutamate 2,5 %, tỉ lệ cấp giống 5%, nồng độ NH4Cl: 1,1% Kết thu đƣợc PGA cao đạt 26,91g/l - Nghiên cứu sơ xác định PGA có khả kết tủa ion Fe3+, Cu2+ nồng độ μg Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tác động đồng thời yếu tố ni cấy đến q trình sinh tổng hợp γ – PGA chủng B.subtilis TN5 Xác định phƣơng pháp tinh PGA phù hợp nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng PGA sản xuất nông nghiệp 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Chí Dũng, 2016 Nghiên cứu sinh tổng hợp thu nhận axit poly γglutamic hướng ứng dụng thực phẩm Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tiếng Anh: C.T Tsao, C.H Chang, Y.Y Lin, M.F Wu, J.L Wang, J.L Han, K.H Hsieh 2010 “Antibacterial activity and biocompatibility of a chitosan–γpoly(glutamic acid) polyelectrolyte complex hydrogel” Cromwick, A.M., Birrer, G.A., Gross, R.A., (1996) “Effects of pH and aeration on poly(glutamic acid) formation by Bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures” Biotechnol Bioeng 50, 222–227 Cadela, T & Fouet, A, 2006 Poly-gamma-glutamate in bacteria", Molecular Microbiology 60(5), pp 1091-1098 Du, G., Yang, G., Qu, Y., Chen, J., Lun, S., 2005 “Effects of glycerol on the production of poly(γ -glutamic acid) by Bacillus licheniformis” Process Biochtôi 40, 2143–2147 Ezzell J W, Abshire T G, Panchal R, Chabot D, Bavari S, Leffel E K, Purcell B, Friedlander A M, Ribot W J 2009 “Association of Bacillus anthracis capsule with lethal toxin during experimental infection” Goto A, Kunioka M, (1991), Biosynthesis and hydrolysis of poly (gammaglutamic acid) from Bacillus subtilis IFO3335 Biosci Biotechnol Biochtôi;56:1031–1035 Hara , T ; Fujio, Y and Ueda (1982), “Poly glutamate production by bacillus subtilis (natto)”, J Appl Biochtôi 3, pp 112-120 Ho, G.H., T.I., Hsieh, K.H., Su, Y.C., Lyn, P.Y., Yang, J., Yang K.H., Yang, S.C, 2006 “γ-Polyglutamic Acid Produced by Bacillus Subtilis (Natto): Structural Characteristics, Chemical Properties and Biological Functionalities” Journal of the Chinese Chemical Society 53(6), pp 1363-1384 Kunioka M , Goto A, (1994) “Biosynthesis of poly(γ,-glutamic acid) from L-glutamic acid, citric acid, and ammonium sulfate in Bacillus subtilis IFO3335” Microbiol Biotechnol 40:867-872 10.Lim S, Kim J, Shim J, Imm B, Sung M, Imm J 2012 “Effect of poly-γglutamic acids (PGA) on oil uptake and sensory quality in doughnuts” Food Sci Biotechnol (247–252) 11.Leonard, C.G, Housewright, R.D 1963 Polyglutamic acid synthesis by cell – free extracts of Bacillus licheniformis Biochim Biophys Acta 73, 530 – 532 12.Mitsuiki M, Mizuno A, Tanimoto H, Motoki M 1998 “Relationship between the antifreeze activities and the chemical structures of oligo- and poly(glutamic acid)” J Agric Food Chem (891–895) 13.Pe´rez-Camero G, Congregado F, Bou JJ, Munoz-Guerra S,(1999), Biosynthesis and ultrasonic degradation of bacterial poly(c-glutamic acid), Biotechnol Bioeng, 63:110–115 14.Jiang, H.; Shang, L.; Yoon, S H.; Lee, S Y and Yu, Z 2006, "Optimal Production of Poly-γ-glutamic Acid by Metabolically Engineered Escherichia coli", Biotechnology Letters 28(16), pp 1241-1246 15.Wang, N.; Yang, G.; Che, C and Liu, Y 2011, "Heterogenous expression of poly-γ-glutamic acid synthetase complex gene of Bacillus licheniformis WBL-3", Applied Biochemistry and Microbiology 47(4), pp 381-385 16.Wu, Q.; Xu, H.; Shi, N.; Yao, J.; Li, S and Ouyang, P 2008, "Improvement of poly(γ-glutamic acid) biosynthesis and redistribution of metabolic flux with the presence of different additives in Bacillus subtilis CGMCC 0833.", Appl Microbiol Biot 79(4), pp 527-535 17 Sawamura, S 1913, "On Bacillus Natto", J Coll Agric Tokyo 5(189191) 18 Toshio, H and Seinosuke, U (1982), "Regulation of Polyglutamate Production in Bacillus subtilis (natto): Transformation of High PGA Productivity", Agricultural and Biological Chemistry 46(9), pp 22752281 19 Troy, F.A (1973), "Chemistry and biosynthesis of poly γ D glutamyl capsule in Bacillus licheniformis", J Biol Chem 248, pp 305 - 316 20.Shih, I.L and Van, Y.T, 2001 "The production of poly-(gamma-glutamic acid from microorganisms and its various applications" Bioresource Technology 21.Shih, I.L and Van, Y.T, Chang Y.N, 2001 Applycation of statistical experimental methods to optimize production of poly (γ-glutamic acid) by Bacillus licheniformis CCRC 12826 Enzyme and Microbial Technology 22 Vedan, I (2006), Gamma-poly-glutamic acid, Vedan Taiwan 23 Wang, L L.; Wu, Y X.; Xu, R W.; Wu, G Y and Yang, W T (2008), "Synthesis and Characterization of Poly L-Glutamic Acid-Co-L-Aspartic Acid", Chinese Journal of Polymer Science 26(04), pp 381-391 24 Wu, Q; Xu, H; Liang, J and Yao, J (2010), "Contribution of Glycerol on Production of Poly(γ-Glutamic Acid) in Bacillus subtilis NX-2", Applied Biochemistry and Biotechnology 160(2), pp 386-392 25.Wu Qun, Xu Hong, Ouyang Pingkai, 2010 Kinetic analysis and pH-shift control strategy for poly(γ-glutamic acid) production with Bacillus subtils CGMCC 0833 Biochemical Engineering Journal, 50:24-28 26.Xiang Yu, Min Wang, Qunhui Wang, and Xuming Wang, 2011 Biosynthesis is of polyglutamic acid and its application on agriculture 183-185 Pp 1219-1223 27.Zhiting Luo, Yuan Guo, Jidong Liu, Hua Qiu, Mouming Zhao, Wei Zou, Shubo Li , 2016 Microbial synthesis of poly-γ-glutamic acid: current progress, challenges, and future perspectives Biotechnology for Biofuels 28.Zhang Yo-Bo, Li Zhang, Hua Jia – Chuan, Wang Yan-Yang, Qiao ChangShang, Zhang Jian – Fei, 2014 “Review in the biosynthesis and applications of poly – glutamic acid” BioTechnology An Indian Jourual 29.Zhang Yu-Bo, Li Zheng, Hua Jia-Chuan, Wang Yan-Yang, Qiao ChangSheng, Zhang Jian-Fei, 2014 Review in the biosynthesis and applications of poly-glutamic acid BioTechnology an Indian Jourual 10(24) 15184 – 15190