Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng steinernema sp tđ3 ở tam đảo vĩnh phúc có khả năng kháng khuẩn kháng nấm

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… HỒNG THỊ BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… HỒNG THỊ BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Ngày nay, nhờ có mặt nhiều kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn mạnh nên góp phần giải nhiều bệnh nhiễm trùng mắc phải Tuy nhiên tỷ lệ đề kháng kháng sinh vi khuẩn ngày tăng cao (ở Mỹ: khoảng 70%) Theo ước tính Trung tâm kiểm soát bệnh (Centers for Disease Control - CDC) Mỹ, hàng năm Mỹ có khoảng 90 000 ca tử vong/ triệu ca mắc bệnh nhiễm trùng [1] Sự kháng thuốc nhiều loại vi khuẩn ngày gia tăng mối lo ngại mang tính tồn cầu Nhiều kháng sinh mà người tìm khơng cịn cơng hiệu việc điều trị Nhiều kháng sinh xuất sử dụng thời gian ngắn bị kháng, việc nghiên cứu tìm loại kháng sinh thực thời gian ngắn, tìm loại kháng sinh điều trị vi khuẩn kháng kháng sinh Vì vậy, nhu cầu khẩn cấp cần có thuốc kháng vi sinh vật để kiểm soát bệnh cách có hiệu [2] Chính vậy, kháng sinh tổng hợp, kháng sinh bán tổng hợp, kháng sinh tự nhiên có mặt thị trường ngành cơng nghiệp dược phẩm tìm kiếm chất kháng vi sinh vật từ nguồn gốc khác vừa có hiệu lực cao, vừa có hoạt phổ rộng mà lại thân thiện với môi trường Các vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh với côn trùng (Entomopathogenic Nematodes - EPN) đối tượng nghiên cứu nhà khoa học khả diệt côn trùng gây hại khả sinh kháng sinh chúng có khả ngăn chặn vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết côn trùng vật chủ Nhiều nghiên cứu cho thấy sản phẩm trao đổi chất thứ cấp vi khuẩn cộng sinh có khả kháng vi sinh vật hoạt phổ rộng, ngăn chặn phát triển vi khuẩn, nấm tế bào ung thư [6,15] Việt Nam đất nước có vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ấm, mưa nhiều nên tuyến trùng ký sinh gây bệnh trùng có tính đa dạng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn cao Hiện nay, khoảng 40 chủng EPN phân lập từ vùng sinh thái khác Việt Nam [3,8] nguồn cung cấp vi khuẩn cộng sinh có ý nghĩa khoa học khơng Việt Nam mà cịn có ý nghĩa giới việc nghiên cứu chất kháng sinh phục vụ cho người, động vật, thực vật Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu tuyến trùng có giá trị v có ý nghĩa khoa học xác định hình thái , đa dạng loài chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng sản phẩm trao đổi chất chúng Chính vậy, lựa chọn đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp.TĐ3 Tam Đảo, Vĩnh Phúc có khả kháng khuẩn, kháng nấm Với mục tiêu: - Phân lập vi khuẩn cộng sinh từ tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 Tam Đảo, Vĩnh Phúc - Thử nghiệm khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn phân lập - Xác định số ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn cộng sinh - Tách chiết hoạt chất thử khả kháng vi sinh vật kiểm định - Định loại vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 phương pháp sinh học phân tử sở phân tích đoạn gen 16S rDNA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng lồi giun trịn (Nematodes) có ích, ký sinh số lồi trùng có hại- làm suy yếu giết chết côn trùng này, lại an toàn người, động vật thực vật [3] Trong số hàng nghìn lồi tuyến trùng ký sinh trùng có nhóm Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả vừa ký sinh vừa gây bệnh cho côn trùng, gồm giống Steinernema Heterorhabditis (giống Steinernema thuộc họ Steinernematidae Heterorhabditis thuộc họ Heterorhabditidae ngành giun trịn Mặc dù lồi tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc giống Steinernema Heterorhabditis lồi ký sinh bắt buộc trùng chúng lại có pha chuyên hóa tồn bên ngồi vật chủ trùng, (thường mơi trường đất) Đó ấu trùng tuổi 3, cịn gọi ấu trùng xâm nhiễm (infective juveniles - IJs), giai đoạn đặc biệt vịng đời phát triển nhóm tuyến trùng Ở giai đoạn này, IJs không cần dinh dưỡng chúng lại có khả tồn lâu dài môi trường đất, chưa gặp vật chủ Đây giai đoạn ấu trùng nằm chờ đất sẵn sàng xâm nhập vào vật chủ thích hợp để ký sinh, gây bệnh Khi tìm vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào thể trùng qua lỗ mở tự nhiên miệng, hậu môn lỗ thở số dạng IJs trang bị mấu kitin dạng sừng đục thủng thành thể côn trùng nơi xung yếu ranh giới đốt thể để xâm nhập Sau vào thể vật chủ, IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu, vi khuẩn cộng sinh giải phóng Nhờ mơi trường thích hợp huyết tương vật chủ, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi khuẩn cộng sinh nhân nhanh số lượng tạo độc tố gây chết vật chủ vòng 24 -48h [3] 1.1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối đực cái, trứng thụ tinh tinh trùng đực Điều có nghĩa để sinh sản thể côn trùng vật chủ, tuyến trùng cần xâm nhập IJs đực IJs cái, để chúng phát triển thành đực trưởng thành, cho phép chúng có điều kiện ghép đơi vật chủ Ở giai đoạn đầu, đẻ trứng vào thể côn trùng trứng nở thành ấu trùng hệ Các ấu trùng hệ không phát tán mà lại bên xác chết thể vật chủ để dinh dưỡng mơ trùng vật chủ phát triển nhanh chóng đạt đến giai đoạn trưởng thành hệ Trong trường hợp xác chết vật chủ nguồn thức ăn, hệ tiếp tục giao phối tiếp tục phát triển qua hệ 3, chí hệ bên thể vật chủ Cuối cùng, nguồn dinh dưỡng hết, hệ cuối xác chết côn trùng dừng lại pha ấu trùng tuổi Các ấu trùng bắt đầu chui khỏi xác chết côn trùng phát tán mơi trường bên ngồi trở thành IJs (tuổi 3) từ chúng tiếp tục chu kỳ phát triển với côn trùng vật chủ 1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis Không giống với loài Steineinema, loài tuyến trùng Heterorhabditis, IJs xâm nhập vào thể côn trùng phát triển thành lưỡng tính (Hermaphroditis) Con có khả sản sinh tinh trùng với trứng tự thụ tinh để sinh sản Từ hệ trở sau, IJs phát triển thành trưởng thành phân tính đực sinh sản hình thức giao phối Giai đoạn đầu lưỡng tính phân tính, chúng đẻ trứng (oviparous) giai đoạn sau già chúng đẻ trứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thai (oviviparous); lúc ấu trùng nở bên thể mẹ sử dụng thể mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi 2, biến thành bọc chứa ấu trùng tuổi Khi phá vỡ thành thể mẹ chui trở thành ấu trùng cảm nhiễm (tuổi 3) chúng giữ lại vỏ cutin ấu trùng tuổi [3] 1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN Mỗi ấu trùng xâm nhiễm của tuyến trùng EPN (infective juveniles –IJs) mang ruột của chúng một loài vi khuẩn cộng sinh chuyên hóa chúng gây bệnh cho côn trùng xâm nhập vào máu Các nghiên cứu 20 năm qua từ tuyến trùng EPN cho thấy vi khuẩn Xenorhabdus cộng sinh ruột ấu trùng cảm nhiễm Steinernema, cịn với lồi giống Heterorhabditis vi khuẩn cộng sinh thuộc giống Photorhabdus [15] 1.2.1 Vi khuẩn Xenorhabdus Xenorhabdus trực khuẩn Gram âm, khơng sinh bào tử, hình que, kỵ khí khơng bắt buộc Chúng sinh trưởng nhiệt độ tối ưu 280C; số chủng có khả phát triển 400C Xenorhabdus khác với chi khác họ Enterobacteriaceae có kích thước tế bào lớn 0,3 – x – 10 μm Lên men đường glucose sinh acid (khơng sinh khí) số đường khác lên men Phản ứng catalase âm tính khả chuyển nitrat thành nitrit Đa số chủng có deoxyribonuclease (DNase) protease dương tính Xenorhabdus có mối quan hệ mật thiết với tuyến trùng ký sinh gây bệnh trùng giống Steinernema có đặc tính miễn dịch Ở IJs loài Steinernema spp., VKCS nằm một cái bọc ở phần trước của ruột , phía sau thực quản Các tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có tính chun hóa cao: loại tuyến trùng tổ hợp với số Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn loài vi khuẩn, loài vi khuẩn tổ hợp với loài tuyến trùng định (bảng 1.1) [33] Bảng 1.1 Mối quan hệ tuyến trùng vi khuẩn cộng sinh TT EPN Steinernema abbasi S affine S apuliae S arenarium S bicornutum S carpocapsae S ceratophorum S cubanum S diaprepesi 10 S feltiae 11 S glaseri 12 S hermaphroditum 13 S intermedium 14 S karii 15 S kraussei 16 S kushidai 17 S longicaudum 18 S monticolum 19 S puertiricense 20 S rarum 21 S riobravis 22 S scapterisci 23 S scarabaei 24 S siamkayai 25 S thermophilum 26 S weiseri 27 Heterorhabditis bacteriophora 28 H megidis VKCS Flavimonas oryzihabitans X bovienii X kozodoii X kozodoii X budapestensis X nematophila X budapestensis X poinarii X doucetiae X bovienii X bovienii X griffiniae X bovienii X hominickii X bovienii X japonica X ehlershii X hominickii X romanii X szentirmaii X cabanillasii X innexi X koppenhoeferi X stockiae X indica X bovienii Photorhabdus luminescens P luminescens Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tài liệu tham khảo Elawad et al., 1998 Akhurst & Boemare, 1990 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Akhurst & Boemare, 1990 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Fischer-Le Saux et al., 1998 Akhurst & Boemare, 1990 Akhurst & Boemare, 1990 Tailliez et al., 2006 Poinar, 1990 Tailliez et al., 2006 Akhurst & Boemare, 1990 Nishimura et al., 1994 Tailliez et al., 2006 Fischer-Le Saux et al., 1998 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Fischer-Le Saux et al., 1998 Tailliez et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Somvanshi et al., 2006 Tailliez et al., 2006 Poinar, 1990 Poinar et al., 1987 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.1 cho thấy X bovienii có quan hệ cộng sinh với loài Steinernema, X poinarii với lồi, cịn lồi vi khuẩn Xenorhabdus khác có quan hệ cộng sinh với lồi Steinernema Điều cho thấy tính chun hóa tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn có tính đa dạng cao 1.2.2 Vi khuẩn Photorhabdus Photorhabdus có kích thước 0,5 -2 x 1- 10 μm, Gram âm, không sinh bảo tử di động lơng rung Hơ hấp kị khí khơng bắt buộc, nhiệt độ tối ưu 280C; số chủng phát triển 37- 380C Photorhabdus có phản ứng catalase dương tính khơng khử nitrat (chủ yếu âm tính với số loài thuộc họ Enterobacteriaceae) Photorhabdus lên men glucose sinh axit, khơng sinh khí có khả lên men đường Fructose, D- mannose, maltose, ribose, N – acetylglucosamine sinh axit, lên men glycerol yếu IJs của các loài tuyến trùng Heterorhabditis spp., vi khuẩn cộng sinh nằm dải rác theo chiều dài của ruột , chủ yếu vẫn là ở nửa trước ống ruột Hầu hết lồi vi khuẩn giống Photorhabdus có khả tạo sáng huỳnh quang sinh học [8] 1.2.3 Sự chuyển pha vi khuẩn cộng sinh Sự biến đổi pha đặc điểm phổ biến vi khuẩn, thay đổi đảo nghịch cho phép vi khuẩn tránh hàng rào miễn dịch côn trùng vật chủ nhiễm thực khuẩn thể Sự biến đổi pha xuất loài vi khuẩn giống Xenorhabdus Photorhabdus Sự biến đổi pha Xenorhabdus mơ tả dị hình dạng khuẩn lạc môi trường agar, khuẩn lạc khác màu viền khuẩn lạc chúng [22,26,31] Sự biến đổi pha Xenorhabdus nghiên cứu đầy đủ X nematophilus xác định đặc trưng biến đổi pha Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn loài [19] Đặc trưng pha I nhuộm màu đường viền xanh (xanh bromothymol đỏ congo) sản sinh chất kháng sinh, lecithinese [26], thể vùi protein tua viền [16] Ở pha II khơng có đặc trưng pha I có biểu yếu Các tế bào pha I lớn đa hình pha II [26] Các nghiên cứu gần cho thấy vai trò pha I sản sinh chất kháng khuẩn, kháng nấm nhằm ức chế vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết trùng, hạn chế cạnh tranh chất dinh dưỡng, dành nguồn dinh dưỡng cho tuyến trùng Ngồi ra, cách thủy phân trùng hệ enzyme protease, lipase,… pha I có khả chuyển hóa chất thành sản phẩm phù hợp cho tuyến trùng tăng trưởng sinh sản Sự xuất hiện tượng vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng EPN mạnh mẽ cho thấy yếu tố quan trọng mối tương quan tuyến trùng, vi khuẩn côn trùng vật chủ Tuy nhiên, giai đoạn biến thể (pha II) chưa có nghiên cứu rõ ràng chức chúng tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn - côn trùng vật chủ [3] Pha I pha II trì dịng chủng kỹ thuật nhân dịng thơng thường [16] 1.3 Mới quan hệ tương tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh Quan hệ cộng sinh mối quan hệ sinh thái phổ biến quần xã sinh vật sinh giới Nó đóng vai trị quan trọng việc hợp thành dạng sống Trái đất tạo đa dạng sinh học vô phong phú Tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh tương tác với nhau, bên thực nhiệm vụ, chức riêng để sinh tồn phát triển lại giúp bên để tồn tại, tổ hợp tách rời tồn độc lập môi trường tự nhiên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 31 Givaudan A., Baghdiguian S., Lanois A and Boemare N (1995), “Swarming and Swimming Changes Concomitant with phase variation in Xenorhabdus nematophilus”, Applied and Envitonmental Microbiology 61, 1408- 1413 32 Kaya H.K and Gaugler R (1993), “Entomopathogenic nematodes”, Annual Review of Entomology 38, 181-206 33 Owuama C.I (2001), “Entomopathogenic symbiotic bacteria, Xenorhabdus and Photorhabdus of nematodes”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 17, 505-515 34 Peter J Isaacson (2000), “Antimicrobial activity of Xenorhabdus sp (Enterobacteriaceae symbiont of the entomopathogenic nematode, Steinernema riobrave (Rhabditida: Steinernematidae)”, PhD thesis, Simon Fraser University, 96 pp 35 Smigielski, A.J., R.J.Akkhurst, and N.E.Boemare (1994), “Phase variation in Xenorhabdus nematophilus and Photorhabdus luminescens: diferences in respiratory activity and membrane energization”, Appl Environ Microbiol 60, 120-125 36 Thaler J.O., Baghdiguian S and Boemare N.E (1995), “Purification and characterization of nematophilicin, phage tail like bacteriocin, from the lysogenic strain FI of Xenorhabdus nematophilus”, Applied and Environmental Microbiology 61, 2049 -2052 37 Thaler J.O., Boyer Giglio M.H and Boemare N.E (1997), “New antimicrobial barriers produced by Xenorhabdus spp and Photorhabdus spp to secure the monoxenic development of entomopathogenic nematodes”, Symbiosis 22, 205-215 38 Thomas, G.M., and G.O.Poinar (1979), “Xenorhabdus gen nov., a genus of entomopathogenic and nematophilic bacteria of the family Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 Enterobacteriaceae”, Int J Syst Bacteriol 29, 352-360 39 Vanden Bergher D.A and Vietlink A.J (1991) Screening methods for anti-bacterial and antiviral agents from higher plants Methods in Plant Biochemistry 6, 47 - 68 40 Webster J M., Li J and Chen G (2000), “Anticancer property of dithiolopyrrolones”, US patent No 6020360 41 Webster J.M, Chen G., Hu K and Li J (2002), “Bacterial Metabolites”, In: Gaugler, R (ed), Entomopathogenic Nematology CABI Publishing, 99- 114 42 Webster J.M and Hu K (1998), “In vitro and in vivo characterization of a smallcolony variant of the primary from of Photorhabdus luminescens MD (Enterobacteriaceae)”, Applied and Environmental Microbiology 64, 3214-3219 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 PHỤ LỤC I Danh sách loài Xenorhabdus tham khảo cho lập phát sinh chủng loại Steinernema spp Phân bố TT Xenorhabdus spp Genbank X griffiniae DQ211710 S hermaphroditum Indonesia Xenorhabdus sp TN 21 X romanii DQ211717 S puertoricense Puero Rico X.miraniensis DQ211713 Steinernema sp Australia X bedding AY278675 Steinernema sp Australia X indica AM040494 S thermophilum India X.cabanillasii DQ211711 S riobrave USA X mauleonii DQ211715 Steinernema sp St Vicent X nematophila AY278674 S carpocapsae USA 10 X szentirmaii AJ810295 S rarum Argentina 11 X poinarii D78010 S glaseri USA 12 X budapestensis AJ810293 S bicornutum Serbia 13 X ehlersii AJ810294 S longicaudum China 14 X innexi AJ810292 S scapterisci Uruguay 15 X stockiae DQ202309 S siamkayai Thailand 16 X kozodoii DQ211716 S arenarium Russia 17 X japonica DQ202310 S kushidai Japan 18 Xenorhabdus sp TX1 DQ205447 S sangi Vietnam 19 X doicetiae DQ211709 S diaprepesi Martinique 20 X koppenhoeferi DQ205450 S scarabaei USA 21 X hominickii DQ205449 S monticolum Korea 22 X bovienii X82252 Australia S robustispiculum Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên S feltiae Vietnam http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 PHỤ LỤC II Các trình tự gen 16S rDNA chủng vi khuẩn cộng sinh có quan hệ họ hàng gần gũi với XTĐ18 genbank Xenorhabdus miraniensis strain Q1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: DQ211713.1 LOCUS DQ211713 DEFINITION Xenorhabdus miraniensis strain Q1 16S ribosomal RNA gene, partial 1481 bp DNA linear BCT 25-FEB-2009 sequence ACCESSION DQ211713 VERSION DQ211713.1 KEYWORDS SOURCE Xenorhabdus miraniensis ORGANISM GI:78461511 Xenorhabdus miraniensis Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Xenorhabdus REFERENCE (bases to 1481) AUTHORS Tailliez,P., Pages,S., Ginibre,N and Boemare,N TITLE New insight into diversity in the genus Xenorhabdus, including the description of ten novel species JOURNAL PUBMED REFERENCE Int J Syst Evol Microbiol 56 (PT 12), 2805-2818 (2006) 17158981 (bases to 1481) AUTHORS Pages,S., Boemare,N.E and Tailliez,P TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (16-SEP-2005) EMIP, INRA, Place Eugene Bataillon, Montpellier 34095, France FEATURES source Location/Qualifiers 1481 /organism="Xenorhabdus miraniensis" /mol_type="genomic DNA" /strain="Q1" /host="Steinernematidae" /db_xref="taxon:351674" /country="Australia" /note="type strain of Xenorhabdus miraniensis" rRNA 1481 /product="16S ribosomal RNA" Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66 ORIGIN tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gagcggcagc gggaagaagc 61 ttgcttcttt gccggcgagc ggcggacggg tgagtaatgt ctggggatct gcccgatgga 121 gggggataac cactggaaac ggtggctaat accgcataac ctcttaggag caaagtgggg 181 gaccttcggg cctcacgcca tcggatgaac ccagatggga ttagctagta ggcggggtaa 241 gggcccacct aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca cactgggact 301 gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa 361 gcctgatgca gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg ggttgtaaag tactttcagc 421 ggggaggaag gcrtgaagct gaatannctt caygattgac gttacccgca gaagaagcac 481 cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatta 541 ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggtcaat taagttagat gtgaaatccc cgggcttaac 601 ctgggaacgg catctaagac tggttggcta gagtctcgta gaggggggta gaattccacg 661 tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga 721 cgaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 781 tccacgctgt aaacgatgtc gatttggagg ttgtgccctt gaggygtggc ttccggagct 841 aacgcgttaa atcgaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aatgaattga 901 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta 961 cctactcttg acatccacgg aatttggcag agatgctgaa gtgccttcgg gacccgtgag 1021 acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac 1081 gagcgcaacc cttatccttt gttgccagca cgtgatggtg ggaactcaag ggagactgcc 1141 ggtgataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acgagtaggg 1201 ctacacacgt gctacaatgg cagatacaaa gagaagcgac ctcgcgagag caagcggaac 1261 tcataaagtc tgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc 1321 gctagtaatc gcagatcaga atgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1381 ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaaaag aagtcggtag cttaacctgc gggagggcgc 1441 tgaccacttt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca a // Xenorhabdus mauleonii strain VC01 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: DQ211715.1 LOCUS DQ211715 DEFINITION Xenorhabdus mauleonii strain VC01 16S ribosomal RNA gene, partial 1480 bp DNA linear BCT 25-FEB-2009 sequence ACCESSION DQ211715 VERSION DQ211715.1 KEYWORDS SOURCE Xenorhabdus mauleonii ORGANISM GI:78461635 Xenorhabdus mauleonii Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 67 Enterobacteriaceae; Xenorhabdus REFERENCE (bases to 1480) AUTHORS Tailliez,P., Pages,S., Ginibre,N and Boemare,N TITLE New insight into diversity in the genus Xenorhabdus, including the description of ten novel species JOURNAL PUBMED REFERENCE Int J Syst Evol Microbiol 56 (PT 12), 2805-2818 (2006) 17158981 (bases to 1480) AUTHORS Pages,S., Boemare,N.E and Tailliez,P TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-SEP-2005) EMIP, INRA, Place Eugene Bataillon, Montpellier 34095, France FEATURES source Location/Qualifiers 1480 /organism="Xenorhabdus mauleonii" /mol_type="genomic DNA" /strain="VC01" /host="Steinernema sp." /db_xref="taxon:351675" /country="Saint Vincent and the Grenadines: Saint Vincent" /note="type strain of Xenorhabdus mauleonii" rRNA 1480 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg cagcgggaag aagcttgctt ctttgccggc 61 gagcggcgga cgggtgagta atgtctgggg atctgcccga tggaggggga taaccactgg 121 aaacggtggc taataccgca taacctctga ggagcaaagt gggggacctt cgggcctcac 181 gccatcggat gaacccagat gggattagct agtaggcggg gtaatggccc acctaggcga 241 cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg gactgagaca cggcccagac 301 tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg 361 ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcggggag gaaggcgtag 421 gtcttaatac ggcttacgat tgacgttacc cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc 481 agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca 541 cgcaggcggt caattaagtt agatgtgaaa tccccgggct taacctggga actgcatcta 601 agactggttg gctagagtct cgtagagggg ggtagaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc 661 gtagagatgt ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacgaaga ctgacgctca 721 ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga 781 tgtcgatttg gaggttgtgc ccttgaggcg tggcttccgg agctaacgcg ttaaatcgac 841 cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 901 cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc 961 acggaatttg gcagagatgc cgaagtgcct tcgggaaccg tgagacaggt gctgcatggc 1021 tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 1081 ctttgttgcc agcacttcgg gtgggaactc aagggagact gccggtgata aaccggagga Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 1141 aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttaccagta gggctacaca cgtgctacaa 1201 tggcagatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg aactcataaa gtctgtcgta 1261 gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgtagatc 1321 agaatgctac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1381 tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgcttaccac tttgtgattc 1441 atgactgggg tgaagtcgta acaaggtaac cgtaggggaa // Xenorhabdus szentirmaii partial 16S rRNA gene, type strain DSM 16338T GenBank: AJ810295.1 LOCUS AJ810295 1524 bp DNA linear BCT 24-MAR-2005 DEFINITION Xenorhabdus szentirmaii partial 16S rRNA gene, type strain DSM 16338T ACCESSION AJ810295 VERSION AJ810295.1 KEYWORDS 16S ribosomal RNA; 16S rRNA gene SOURCE Xenorhabdus szentirmaii ORGANISM GI:51241592 Xenorhabdus szentirmaii Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Xenorhabdus REFERENCE AUTHORS Lengyel,K., Lang,E., Fodor,A., Szallas,E., Schumann,P and Stackebrandt,E TITLE Description of four novel species of Xenorhabdus, family Enterobacteriaceae: Xenorhabdus budapestensis sp nov., Xenorhabdus ehlersii sp nov., Xenorhabdus innexi sp nov., and Xenorhabdus szentirmaii sp nov JOURNAL PUBMED REFERENCE Syst Appl Microbiol 28 (2), 115-122 (2005) 15830803 (bases to 1524) AUTHORS Stackebrandt,E TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (11-AUG-2004) Stackebrandt E., Microbiology, DSMZ, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, GERMANY FEATURES source Location/Qualifiers 1524 /organism="Xenorhabdus szentirmaii" /mol_type="genomic DNA" /strain="type strain:DSM 16338" /host="Steinernema rarum" Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 69 /db_xref="taxon:290112" /country="Argentina:Cordoba" gene 1524 /gene="16S rRNA" rRNA 1524 /gene="16S rRNA" /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN tgatcctggc tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gagcggcagc 61 gggaagaagc gtgcttcttt gccggcgagc ggcggacggg tgagtaatgt ctggggatct 121 gcccgatgga gggggataac cactggaaac ggtggctaat accgcatgac ctcttgggag 181 caaagtgggg gaccttcggg cctcacgcca tcggatgaac ccagatggga ttagctagta 241 ggcggggtaa cggcccacct aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca 301 cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca 361 atgggcgcaa gcctgatgca gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg ggttgtaaag 421 tactttcagc ggggaggaag gcgtgagtct gaatacggct tacgattgac gttacccgca 481 gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta 541 atcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggtcaat taagttagat gtgaaatccc 601 cgggcttaac ccgggaacgg catctaagac tggttggcta gagtctcgta gaggggggta 661 gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaataccggt ggcgaaggcg 721 gccccctgga cgaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 781 accctggtag tccacgctgt aaacgatgtc gatttggagg ttgtgcccct gaggcgtggc 841 ttccggagct aacgcgttaa atcgaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca 901 aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg 961 aagaacctta cctactcttg acatccacgg aatttggcag agatgctgaa gtgccttcgg 1021 gaaccgtgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa 1081 gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttt gttgccagca cgtgatggtg ggaactcaag 1141 ggagactgcc ggtgataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1201 acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg cagatacaaa gagaagcgac ctcgcgagag 1261 caagcggaac tcataaagtc tgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga 1321 agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga atgctacggt gaatacgttc ccgggccttg 1381 tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaaaag aagtaggtag cttaaccttc 1441 gggagggcgc ttaccacttt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtaaccgt 1501 aggggaacct gcggctggat cacc // Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 PHỤ LỤC III Kết đọc trình tự phần đoạn gen 16S chủng XTĐ18 máy tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer Hình ảnh điện di đồ giải trình tự phần chủng XTĐ18 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 71 Hình ảnh điện di đồ giải trình tự phần chủng XTĐ18 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 72 Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt BSL Bướm sáp lớn Galleria mellonella BTB Bromothymol Blue DMSO Dimethyl sulfoxide EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid EPN Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode) EtBr Ethidium bromide h IJ Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile) NBTA Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient agar supplemented with bromothymol blue and triphenyl tetrazolium chloride) PCR Phản ứng khuyếch đại đoạn DNA (Polymerase Chain Reaction) TBE Dung dịch đệm điện di (Tris/Borate/EDTA) TTC Triphenyltetrazolium chloride VKCS Vi khuẩn cộng sinh VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 73 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Kế Long, nghiên cứu viên Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, người tận tình bảo, hướng cho tơi phương pháp luận vô giá trị để tơi có định hướng cho luận văn Tơi xin trân thành cảm ơn TS Phạm Hồng Hải, trưởng phịng Cơng nghệ Khai thác chế biến Tài nguyên thiên nhiên, Phó Giám đốc Liên hiệp Khoa học sản xuất, Cơng nghệ Hóa học- Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên tạo điều kiện cơng việc, thời gian tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn tới cô chú, anh chị phòng Hệ thống học phân tử di truyền bảo tồn, phòng Tuyến trùng học – Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật; phòng Khai thác chế biến tài ngun thiên nhiên, phịng Hóa sinh biển, phịng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên giúp nhiều trình làm luận văn Tơi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, phòng Đào tạo thầy cô Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật- Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập ngun cứu Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, anh chị đồng nghiệp Liên hiệp Khoa học sản xuất Cơng nghệ hóa học (UCE) ln động viên, khuyến khích để tơi hồn thành luận văn này./ Tôi chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Tác giả luận văn Hồng Thị Bích Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 74 MỤC LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 75 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh mục chất kháng sinh 13 Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp PCR 29 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 29 Bảng 2.3 Thành phần hỗn hợp phản ứng giải trình tự DNA 31 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng xác định trình tự DNA 31 Bảng 3.1 Kết kiểm tra sơ khả kháng VSVKĐ 37 Bảng 3.2 Khả kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn cộng sinh 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 42 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 43 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng VSVKĐ từ cặn chiết EtOAc 44 Bảng 3.7 Kết so sánh XTĐ18 với số loài genbank 46 Bảng 3.8 Ma trận khoảng cách di truyền theo mơ hình Kimura tham số 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 76 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cơng thức hố học số chất kháng vi sinh vật từ Xenorhabdus Photohabdus Error! Bookmark not defined Hình 2.1: Tuyến trùng (IJs) Steinernema sp.TĐ3 19 Hình 2.2 Ấu trùng bướm sáp lớn Galleria mellonella 19 Hình 2.3 Qui trình thu nhận cặn chiết từ dịch ni cấy chủng VKCS 27 Hình 3.1 Hình ảnh ấu trùng BSL chết nhiễm tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 (bên trái); nhiễm tuyến trùng Heterorhabditis sp.TĐ17 (bên phải) 33 Hình 3.2 Hình ảnh thu tuyến trùng Ijs phương pháp Whitetrap 34 Hình 3.3 Hình ảnh vị trí túi vi khuẩn cộng sinh thể tuyến trùng Steinernema sp TĐ3 34 Hình 3.4 .Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn cộng sinh pha sơ cấp 35 Hình 3.5 Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn cộng sinh pha thứ cấp 35 Hình 3.6 Pha sơ cấp VKCS 36 Hình 3.7 Pha thứ cấp VKCS 36 Hình 3.8 Hình ảnh tế bào vi khuẩn cộng sinh 37 Hình 3.9 Khả kháng VSVKĐ chủng VKCS 40 Hình 3.10 Ảnh kháng Staphilococcus aureus chủng VKCS 40 Hình 3.11 Đồ thị ảnh hưởng pH lên khả 41 kháng VSVKĐ XTĐ 18 41 Hình 3.12 Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ lên khả kháng VKVKĐ XTĐ 18 42 Hình 3.13 Đồ thị ảnh hưởng thờI gian ni cấy 43 Hình 3.17 Sản phẩm PCR gen 16S rDNA XTĐ18 46 Hình 3.18 So sánh đoạn gen 16S XTĐ18 với lồi nhóm 51 Hình 3.19 Cây phát sinh lồi theo phương pháp Minimum Evolution 53 (Số gốc giá trị tỷ lệ % bootstrap, thực phân tích với 1000 lần lấy lại mẫu) Error! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... chọn đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp. TĐ3 Tam Đảo, Vĩnh Phúc có khả kháng khuẩn, kháng nấm Với mục tiêu: - Phân lập. .. TẠO VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM VI? ??N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… HỒNG THỊ BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG... lập vi khuẩn cộng sinh từ tuyến trùng Steinernema sp. TĐ3 Tam Đảo, Vĩnh Phúc - Thử nghiệm khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn phân lập - Xác định số ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả