¡chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 30, s ố 6S (2014) 703-708 Phân lập định danh vi khuẩn lactic từ mực muối Phạm Thị Kim Ngọc*’1, Nguyễn Thị Minh Nguyệt2, Thái Mỹ Ngân2, Nguyễn Văn Dũng2 1K hoa H óa học Cơng nghệ Thực phắm , Truờng Đ ại học Bà Rịa - Vũng Tàu 2Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm , trưịng Đ i học Cơng nghiệp TP.H CM N hận ngày 10 tháng 10 n ăm 2014 C hinh sừa ngày 30 tháng 10 n ăm 2014; C hấp nhận đăng ngày 20 tháng 11 năm 2014 Tóm tắt: Mực muối dạng sản phẩm lên men truyền thống người miền Trung Việt Nam Trong trình muối mực, tác động nồng dộ muối cao diện nhóm vi sinh vật khác dã tạo nên nét đặc trưng sản phẩm M ột yếu tố dịnh đến chất lượng sản phẩm hệ vi sinh vật có khả lên men lactic Kết bước dầu dã phân lập dược chủng vi khuần Gram (+) diện mẫu mực muối khác Kết hợp quan sát dặc điểm hình thái với phương pháp hóa sinh, phân tích so sánh trình tự vùng gen 16S rDNA chúng tơi định danh loài vi khuẩn diện mực muối Bacillus thuringiensis, B amyloliqueýaciens, B subtilis, B atrophaeus, B licheniformis, B megaterium; Lactobacillus acidophilus, L plantarum lồi Staphylococcus sp Từ khóa: Mực muối, 16í’ rDNA, lên men lactic, vi khuẩn Lactic 1.Đặt vấn đề nghiên cứu cách khoa học đầy đủ, chất lượng sản phẩm phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm người chế biến điều kiện môi trường ủ lên men Vì việc phân lập định danh giống LAB có sản phẩm cần thiết phục vụ cho công tác nghiên cứu giảng dạy Trên sớ góp phần kiểm sốt quy trình chế biến nguồn giống khởi động để trì chất lượng ổn định cho sàn phầm truyền thống Mực muối (hay mắm mực) sản phảm lên men truyền thống chế biến từ mực ống tươi nhỏ Mực ướp muối theo tì lệ thối lượng mực: muối, đậy kín để lên mentự nhiên, sau khoảng 2-3 tháng ăn Trong trình muối mực, tác động cua nồng dộ muối cao diện cuacác nhóm vi sinh vật khác tạo nên oél đặc trưng mùi vị cấu trúc sản phàm Một yếu tố định đến chấl lượng sản phẩm hệ vi sinh vật có khả lên men lactic (LAB) Mực muối san phẩm truyền thống chưa Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 N g u y ên liệu Mực tươi mua chợ Phước Nguyên, thành phố Bà Rịa, tình Bà Rịa - Vũng Tàu Mực tươi, 'Tácgià liên hệ ĐT: 84-4-985929591 Email: kimngoc080283@gmail.com 703 704 P.T.K Ngọc nnk./T ạp chí Khoa họcĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, số 6S (2014) 703-708 lớp Vỏ ngồi màu trắng, khơng dập, túi mực cịn ngun, đầu cịn liền thân, trung bình con/100g Mực rửa sạch, để trộn với muối cho vào hũ nhựa sạch, đậy kín, để lên men tự nhiên Thí nghiệm tiến hành loại mực: nguyên con, bỏ nội tạng, bỏ túi mực tỉ lệ khối lượng mực muối: 3:0,75, 3:1 3:1,25 Sau tháng, sản phẩm mục muối dùng làm mẫu nghiên cứu 2.2 Hóa chất Muối sử dụng muối hạt công ty CP Muối TM Bà Rịa Vũng Tàu Casein công ty Himedia, hóa chất dùng cho phản ứng PCR cơng ty Fermentas (Mỹ), kit genomic DNA Isolation tách chiết DNA hãng GeNet Bio, cặp mồi sử dụng phản ứng PCR primer Lac Lac 2, hóa chất chạy điện di cơng ty Sigma, thang DNA 100 bp plus lkb plus ABM - Canada 2.3 Phương p h áp nghiên cứu * Phương pháp phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic: Sử dụng môi trường MRS thạch (g/1): Glucose - 20,0; K2H P04 - 2,0; CaC03 - 5,0; CH3COONa - 5,0; cao thịt - 10,0; triamoni xitrat 2,0; Pepton -10,0; M gS04.7H20 0,58; cao nấm men 5,0; M nS04.4H20 - 0,28; Tween 80 - ml; thạch 15,0; nước cất vừa đủ 1lít; pH= 6,0; khử trùng 121°c/15 phút [1], Dịch lên men pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn Nguyễn Lân Dũng [2] sau thu nhận khuẩn lạc điển hình Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn qua tiêu nhuộm Gram, tiến hành phản ứng sinh hóa nhằm định danh sơ chủng vi sinh vật lên men lactic * Phương pháp định danh dựa giải trình tự vùng gene 16S rDNA [3, 4, 5]: Chủng vi sinh vật phân lập tăng sinh môi trường MRS lỏng, thu nhận sinh khối tách chiết DNA kit Genomic DNA Isolation for bacteria hãng GeNet Bio Phản IÍUỊ PCR thực để khuếch đại vùng gene 16S rDNA máy PCR Mastercycler Eppendorf với tổng thể tích 25 |xl bao gồm: ũj H.1 DNA khuôn, 12,5 |xl PCR master mix, 1.1' |xl mồi (10 pmoles/|xl), 9,5 |il nước theo chu trinh nhiệt: 96°C/3 phút, 30 chu kỳ (94°CII phút, °c /l phút, 72°C/2 phút), 72°c/10 phủL giữ 4°c Sản phẩm PCR tinh xác định trình tự máy đọc trình tự tụ động lại cơng ty Nam Khoa Biotec Kết giải trìnhty xem cơng cụ SnapGene Viewer so sánh với trình tự vùng gene 16S rDNAcna lồi cơng bố từ liệu DDBJ EMBL GenBank Kết thảo luận 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật lên men laciic Từ mẫu mực muối khảo sát, chung '1 khuẩn khác phân lập tinh môi trường MRS, 37°c 48 Dựa vào hình thái khuẩn lạc tiêu bai nhuộm Gram, chủng vi khuẩn phân lập chia thành nhóm: nhóm tế bào hỉnh que, Gram (+), không sinh bào tử (chủng VKiM 6); nhóm tế bào hình cầu, Gram (+) (chunị VKM 2) nhóm tế bào hình que, Gram (+1 sinh bào tử (chủng VKM 3, 4, 5, 7, 8, 9) Đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc rá tả bảng Nhìn chung, khuẩn lạc thu đuợc đềuco điểm đặc trưng thường dùngdỉ nhận dạng dòng vi khuẩn sản sinh acid lactic như: vi khuẩn Gram (+), hình que hình cầu, mơi trường MRS khuẩn lạc nả trắng trắng sữa, kích thuớc khoảng 1] mm [6] Các kết khảo sát ban đầu cho phép dự đoán khuẩn lạc thuộc vào ả Lactobacillus, Bacillus Staphylococcus P.T.K Ngọc vànnk./Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tựnhiên Công nghệ, Tập 30, SỐ6S (2014) 703-708 705 Bảng Đặc điểm chủng vi khuẩn VKM VKM VKM VKM VKM VKM VKM VKM VKM -j£- 1■3 Ì.2 Các thử nghiệm sinh hóa - jE ~ Biến dưỡng citrate thử nghiệm cho khả sử dụng nguồn citrate nguồn carbon Từ kết quan sát đậc đỉểm hình thái tế Đây phản ứng điển hình giống íào khuẩn lạc, tiến hành phản Bacillus Thử nghiệm cho kết dương (+) ímg sinh hóa đậc tning cho nhóm dự đốn tính khuẩn lạc: VKM 4, 5, 7, âm (-) Kết thử nghiệm trình bày bảng tính VKM 1, 2, Điều kết Kết hợp kểt khả sinh catalase (-) luận khuẩn lạc cho thử nghiệm (+) thuộc lơi hoạt tính làm đơng tụ sữa (+), chúng tơi cho giống Bacillus Khuẩn lạc VKM dù kết lãng khuẩn lạc VKM thuộc giống thừ nghiệm (-) tính tiêu cho íactobacillus vi khuẩn diện thấy hình thái tế bào gần giống với Bacillus rong sữa chuyển đường lactose thành acid có sinh bào tử, khác với khuẩn lạc VKM 1, actic làm giảm pH Tại pH = 4,7 tương đương Do VKM thuộc nhóm liềm đằng điện casein nên xảy Bacillus song chủng khác nên linh kết tụ để tạo gel khả sử dụng citrate khác 706 P.T.K Ngọc n n k/T p chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tựnhiên Cơng nghệ, Tập 30, số 6S (2014) 703-708 Bảng Kết thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm Hoạt tính làm dông tụ sữa Khả biến dưỡng citrate Khả sinh catalase Khả sinh protease VKM + VKM + VKM Chủng vi khuẩn VKM VKM VKM + + + Thử nghiệm khả sinh enzyme catalase nhằm ghi nhận đặc điểm hiếu khí hay kị khí nhóm vi khuẩn Kết thử nghiệm khuẩn lạc VKM (-) tính, cịn lại (+) tính Thử nghiệm khả sinh protease ngoại bào cách cấy chấm điểm vi khuẩn lên môi trường thạch M RS có bo sung casein Kết cho thấy khuẩn lạc VKM 1, 4, 5, có khả sinh protease, cịn lại (-) tính Các kết thực nghiệm thu cho phép dụ đoán sau: khuẩn lạc VKM thuộc giống Lactobacillus, khuẩn lạc VKM thuộc giống Staphylococcus, khuẩn lạc cịn lại thuộc giống Bacillus Ngồi ra, q tình nghiên cứu chúng tơi cịn nhận thấy khác biệt mật độ xuất khuẩn lạc mẫu mực khảo sát khác biệt nồng độ muối dạng mực muối định: - Đối vói khuẩn lạc Staphylococcus diện tất mẫu loại tụ cầu có mặt đường ruột nguyên liệu dễ mọc loại môi trường ni cấy - nghiệm thức có nồng độ muối thấp (3:0,75), chủng Bacillus diện chủng Lactobacillus chiếm ưu - nồng độ muối cao (3:1 3:1,25) khơng có diện chủng Lactobacillus, phần lớn có mặt Bacillus VKM + + + + + + + + + VKM VKM9 + + + + 3.3 Kết định danh kỹ thuật sinh học phân tử DNA hệ gen chủng vi khuẩn đuợc tách chiết Đoạn gen mã hóa cho 16S rDNA khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụnị cặp mồi phổ biến Lac Lac 2, sau đuợc tinh dùng làm khuôn phản ứng đọc trình tự với mồi xi mồi ngược Kết đọc trinh tự xử lý phần mềm SnapGene Viewer so sánh với liệu cua DDBJ, EMBL, GenBank công cụ Blast Search để xác định đến tên loài Kết khuếch đại vùng gene 16S rDNA (hình 1) thu băng DNA có kích thuớc khoảng 340 bp, phù hợp với chiều dài đoan gen mà hai mồi Lac 1, Lac khuếch đại Ở cuối bảng gel khơng có dấu hiệu smeaí vạch DNA nào, điều chứng tỏ sản phẩm PCR khuếch đại xác gene mục tiêu 16S rDNA, đạt độ tin cậy cao Mặc khác, mẫu đối chứng âm không xuii vạch DNA chứng tỏ thành phần tronị phản ứng PCR đảm bảo chất lượng, không lái tạp DNA khác cặp mồi Lac 1, Lac dặc hiệu với gene mục tiêu Kết so sánh trinh tự chung n khuẩn với trình tự vùng gen 16S rDNA lồi cơng bố từ liệu DDBJ EMBL GenBank với mức độ tương đồH! thể bảng Như chung phải lập thuộc giống Lactobacillus, Baciầ Staphylococcus P.T.K Ngọc n n h /T p chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, So 6S (2014) 703-708 707 Hình Kết điện di gel agarose 1% phân tích sản phẩm PCR khuếch đại vùng trình tự 16S rDNA chủng vi khuẩn phân lập từ mực muối M: thang chuẩn DNA 100 bp, ĐC(-): đối chứng âm Bảng Kết BlastN NCBI Chủng Accession Description VKM NR 075041.1 Laztobacillus plantarum WCFS1 strain WOFS1 16S ribosomal RNA, complete sequence Staphylococcus cohnii subsp urealyticus strain CK27 16S ribosomal RNA gene, partial sequence VKM VKM VKM VKM VKM VKM VKM VKM NR 037046.1 NR 102506.1 NR 074290.1 NR 075005.1 NR 075049.1 NR 118996.1 NR 075016.1 NR 118591.1 Bacillus thuringiensis Bt407 16S ribosomal RNA, complete sequence Bacillus megaterium QM B1551 strain QMB1551 16S ribosomal RNA, complete sequence Bacillus amyloHquefaciens subsp plantarum strain FZB42 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Lactobacillus acidophilus 30SC strain 30SC 16S ribosomal RNA, complete sequence Bacillus licheniformis strain DSM 13 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Bacillus atrophaeus 1942 strain 1942 16S ribosomal RNA, complete sequence Bacillus subtilis subsp spizizenii strain 168 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Max score Total score Query coverage E value Max ident 490 490 92% 100% 527 527 100% 100% 540 540 91% 99% 484 484 100% 99% 499 499 100% 99% 532 532 100% 100% 538 538 100% 99% 412 537 100% 100% 475 475 98% 99% ... Phân lập chủng vi sinh vật lên men laciic Từ mẫu mực muối khảo sát, chung '1 khuẩn khác phân lập tinh môi trường MRS, 37°c 48 Dựa vào hình thái khuẩn lạc tiêu bai nhuộm Gram, chủng vi khuẩn phân. .. thu nhận khuẩn lạc điển hình Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn qua tiêu nhuộm Gram, tiến hành phản ứng sinh hóa nhằm định danh sơ chủng vi sinh vật lên men lactic * Phương pháp định danh dựa... khuẩn lạc rá tả bảng Nhìn chung, khuẩn lạc thu đuợc đềuco điểm đặc trưng thường dùngdỉ nhận dạng dòng vi khuẩn sản sinh acid lactic như: vi khuẩn Gram (+), hình que hình cầu, mơi trường MRS khuẩn