LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: "PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG" potx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH PHÚ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH PHÚ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2009 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh, cô Nguyễn Thị Thu Hằng và chị Nguyễn Hà Giang đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này. Tôi cũng xin cảm ơn đến tất cả quí thầy cô và cán bộ Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ đã chỉ dẫn tận tình và truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quí báo trong thờ i gian học ở trường. Đồng thời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31, tập thể anh em P6C 1 cùng gia đình đã hết lòng giúp đỡ động viên tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu sưu tập và cung cấp dữ liệu về vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá tra bị xuất huyết nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, đồng thời cũng so sánh kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E. Kết quả đề tài đã thu được 5/17 ao cá bị xuất huyết, phân lập được 28 chủng vi khuẩn Aeromonas. Tám chủng vi khu ẩn đại diện gồm SĐ2.1T, SĐ2.2T, CA1.2T, CA1.3TT, TN1.1T, TN2.4TT, TN2.1G và CS2.3T đã được kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa bằng bộ kít API 20E và phương pháp sinh hóa truyền thống dựa theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993). Kết quả định danh của hai phương pháp trong nghiên cứu này không có sự khác biệt lớn, cả 8 chủng vi khuẩn được định danh đều là vi khuẩn A.hydrophila. ii MỤC LỤC TÓM TẮT i LỜI CẢM TẠ ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v PHẦN I GIỚI THIỆU 1 PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 2.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam và Đồng Bằng Sông Cửu Long 2 2.1.1 Ở Việt Nam 2 2.1.2 Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 2 2.2 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 4 2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 6 PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 8 3.2 Vật liệu nghiên cứu 8 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 8 3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 8 3.3 Hóa chất 8 3.3.1 Các hóa chất và môi trường dùng để phân lập vi khuẩn 8 3.3.2 Các hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E 9 3.4 Phương pháp nghiên cứu 9 3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 9 3.4.2 Phân lập vi khuẩn 9 3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn 10 3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 10 3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 10 3.5.2 Đị nh danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E 11 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 4.1 Kết quả 14 4.1.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila 14 4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 15 4.1.3 Định danh vi khuẩn phân lập bằng bộ kít API 20E 20 4.2 Thảo luận 22 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 24 5.1 Kết luận 24 5.2 Đề xuất 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 PHỤ LỤC 29 iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng phương pháp sinh hóa truyền thống. Bảng 3.2 Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng bộ kít API 20E. Bảng 4.1 Kết quả thu mẫu. Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 8 chủng vi khuẩn phân lập. Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kít API 20E. iv DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Cá bị xuất huyết. Hình 4.2 Hình dạng vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 100X. Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên môi trường TSA. Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar. Hình 4.5 Kết quả phản ứng decarboxylase. Hình 4.6 Kết quả phản ứng citrate. Hình 4.7 Các phản ứng sử dụng đường. Hình 4.8 Kết quả định danh bằng bộ kít API 20E. v PHẦN I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất giàu tiềm năng được thiên nhiên ưu đãi có lợi thế rất lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đã có những bước phát triển vượt bậc mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt cá tra đang là đối tượng nuôi chiến lược, thu lại nguồn ngoại tệ rất lớn. Đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá tra, ba sa trên 5.600 ha, so với năm 2000, diện tích này tăng trên 10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007). Tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt mức 4 tỷ USD (VASEP, 2008). Tuy nhiên do sự gia tăng quá mức của phong trào nuôi cá tra trong khi trình độ kỹ thuật của ng ười nuôi chủ yếu chỉ dựa vào kinh nghiệm. Mặt khác do phát triển tự phát thiếu qui hoạch, mật độ thả nuôi cao và công tác quản lý dịch bệnh còn hạn chế nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra gây thiệt hại cho người nuôi. Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản do vi khuẩn chiếm tới 50,9%. Theo điều tra của Nguyễn Thanh Phương và ctv (2007) thì số nông hộ nuôi cá tra ghi nhận b ệnh xuất huyết xuất hiện vào mùa lũ chiếm tới 88%. Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì Aeromonas là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên nhiều loài cá, trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất (Lewis and Plumb, 1979). Đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm sưu tập và cung cấ p dữ liệu về vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết nuôi ở ĐBSCL. Đề tài bao gồm các nội dung: (1) Thu mẫu và phân lập vi khuẩn A. hydrophila từ cá tra bị bệnh xuất huyết; (2) Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá tra bệnh xuất huyết bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E. Trang 1 PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam và ĐBSCL 2.1.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam Trong những năm gần đây ngành nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới đã không ngừng phát triển mạnh mẽ có mức tăng trưởng kinh tế cao trong xuất khẩu thuỷ sản. Theo số liệu của Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạ ch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt mức 4 tỷ USD. Mười tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái (B ộ thủy sản, 2007). Riêng nghề nuôi cá tra cũng có những bước phát triển rất vượt bậc không những ở quy mô diện tích mà còn có sự gia tăng mật độ nuôi ở mức độ thâm canh hóa. Năng suất cá tra nuôi ao ở một số vùng đã tăng đến 350 - 500 tấn/ha/vụ, thậm chí đến 700 tấn/ha/vụ, do mật độ nuôi đã tăng lên đến 40 - 50 con/m 2 (Nguyễn Thanh Phương và ctv, 2007). Mặc dù trong những năm qua nghề nuôi cá tra ở Việt Nam có những bước thăng trầm do giá cả không ổn định, chịu tác động của nhiều vụ kiện bán phá giá, yêu cầu về kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm ngày một khắc khe. Đặc biệt các thị trường lớn như Mỹ, Nhật, EU đòi hỏi rất nghiêm ngặt về chất lượng sản phẩ m. Sản phẩm cá tra thịt trắng có nhu cầu ngày càng cao là những thách thức đặt ra cho các nhà doanh nghiệp chế biến xuất khẩu và người nuôi. Theo Bộ Thủy Sản (2007) sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng từ 720.000 tấn ở năm 2000 lên đến 1.256.938 tấn năm 2004. Năm 2005, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 1.437.355 tấn và giá trị xuất khẩu khoảng 1.627,3 triệu USD. Năm 2006, sản lượng nuôi trồng th ủy sản của cả nước đạt 1.694.271 tấn, trong đó sản lượng cá tra chiếm 825.000 tấn. 2.1.2 Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Đồng Bằng Sông Cửu Long là nơi có tiềm năng nuôi cá tra rất lớn, đã có truyền thống nuôi cá tra từ lâu đời, cùng với lợi thế về diện tích mặt nước, hàng năm vùng không ngừng nâng cao về mặt sản lượng cá tra, basa xuất khẩu. Tính từ năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 Trang 2 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước. Chỉ trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (Quang Hải, 2008). Theo số liệu đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá tra, ba sa trên 5.600 ha. So với năm 2000, diện tích này đã tăng trên 10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007). An Giang là tỉnh có nghề nuôi cá tra phát triển nhất ở ĐBSCL, chiếm 90% tổng kim ngạch xuất khẩu của tỉnh. Sản lượng cá tra nuôi của tỉnh An Giang tăng từ 25 đến 27%/năm và chiếm 70% sản lượng cá tra nuôi của khu vự c Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong quí I/2008, An Giang đạt sản lượng nuôi cá tra trên 90.000 tấn, tăng 63% so cùng kỳ. Chủ tịch Hiệp hội nuôi và chế biến xuất khẩu thủy sản An Giang (AFA) cho biết: sản lượng cá tra nuôi của tỉnh An Giang quí II/2008 lứa đầu thu hoạch khoảng 25.000 tấn. Trong khi cá nguyên liệu cần cho các nhà máy chế biến trong tỉnh trên 100.000 tấn/quí. Hiện nay, sản phẩm cá tra xuất khẩu đang thuận lợi cả về thị trườ ng và giá cả, giá xuất sản phẩm cá tra thịt trắng từ 3,2 đến 3,4 USD/kg (4 tháng đầu năm giá xuất bình quân 2,8 USD/kg) (Huy Bình, 2008). Còn Đồng Tháp tuy vào mùa thu hoạch rộ cá tra cũng đối mặt với nhiều khó khăn như doanh nghiệp không đủ vốn để mua cá nguyên liệu, người nuôi cá tra không đủ tiền mua thức ăn cho cá phải “treo” ao nhưng kim ngạch xuất khẩu thủy sản, mà chủ lực là cá tra, ba sa, vẫn tăng khá. Hiện nay, thủy sản là mặt hàng xuất kh ẩu chính yếu, chiếm gần 70% tổng kim ngạch xuất khẩu toàn tỉnh Đồng Tháp. Từ đầu năm đến nay, các doanh nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp đã chế biến 83.101 tấn thủy sản, đồng thời xuất khẩu trên 62.509 tấn thủy sản, trị giá hơn 179 triệu USD, tăng 61,92% về sản lượng và 47,14% về giá trị (Sở Công Thương Đồ ng Tháp, 2009). Và theo báo cáo của Sở Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn tỉnh Vĩnh Long, mặc dù trong thời gian gần đây giá cá tra nguyên liệu giảm ở mức thấp gây khó khăn cho các hộ nuôi nhưng diện tích ao, hầm nuôi cá tra trên địa bàn tỉnh vẫn duy trì ở mức 334 ha. Sản lượng cá tra trong tháng 8 này ước đạt khoảng 11.030,5 Trang 3 [...]... A hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java - Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80 - 90% (Angka, 1990) Năm 1982 Saitanu và ctv đã tìm thấy vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép (Saitanu et al., 1982) Vi khuẩn này còn gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng giống (Clarias batrachus) và là tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979) Vi khuẩn. .. ao thu được ở Cần Thơ đều bị bệnh xuất huyết do A hydrophila Kết quả này cũng tương đồng với cuộc khảo sát của Huỳnh Văn Quang (2008) rằng bệnh xuất huyết thường xuất hiện và gây thiệt hại nhiều cho người nuôi cá tra ở dọc tuyến sông Hậu cao hơn người nuôi ở dọc tuyến sông Tiền Về kết quả định danh vi khuẩn thì tất cả 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có những đặc tính của giống vi khuẩn Aeromonas là... A.caviae, A.sorbia… (Từ Thanh Dung, 2005) Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu hay bệnh sởi…Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A hydrophila gây ra (theo Bergey 1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005) Trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A hydrophila được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết ở những... Số chủng Aeromonas 4 4 20 28 Cá bị bệnh xuất huyết có dấu hiệu thường gặp nhất là xuất huyết ở gốc các vi, da, nắp mang, miệng hay xuất huyết quanh mắt và phù mắt Cá bệnh nặng có thể có nhiều vết loét trên cơ thể Bên trong cá có thể bị xuất huyết ở thành bụng, nội quan, mở và cơ (Hình 4.1) Xoang bụng thỉnh thoảng chứa nhiều chất dịch có mùi hôi Kết quả phân tích vi sinh ở 5 ao cá bị bệnh xuất huyết đã... chủng vi khuẩn đều là A hydrophila (Bảng 4.2 và Bảng 4.3) Trang 14 Hình 4.1 Cá bị xuất huyết 4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống Trong số 28 chủng vi khuẩn phân lập được dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá bệnh và một số thông tin lúc thu mẫu cũng như trong quá trình phân lập chọn ra 8 chủng vi khuẩn, trong đó có 2 chủng ở Đồng Tháp (SĐ2.1T, SĐ2.2T), 2 chủng ở Vĩnh... cao nhất Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá Nheo nuôi tại châu Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ESC (Enteric septicaemia of catfish) Còn ở Vi t Nam E.ictaluri gây bệnh trên cá tra được gọi bệnh mủ gan Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson và ctv, 2001)... động, đồng thời nước chảy mạnh làm cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm bệnh Ngoài ra, Trương Quốc Phú (2004) còn cho rằng nhiệt độ nước dao động trong khoảng 26 - 28oC là điều kiện tốt cho vi khuẩn E ictaluri phát triển và gây bệnh Bên cạnh đó, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A hydrophila cũng là một loại bệnh phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm trên cá tra và cá basa nuôi bè Bệnh xuất huyết. .. cá nuôi và cá tự nhiên (Lewis and Plumb, 1979) Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A hydrophila có biểu hiện chung là da thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mở xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và. .. Thanh Dung và ctv (2004) vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận Đặc biệt những năm gần đây bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng Cá bị bệnh mủ gan không có dấu hiệu bất thường bên ngoài Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn... huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài là xuất huyết trên gốc các vi và xoang miệng Bên trong thấy xuất huyết ở cơ, ruột, mô mỡ, kèm theo những dấu hiệu khác như trương bụng hay lỡ loét ở gốc vi đuôi và vi hậu môn (Phan Văn Ninh và ctv, 1993) Bệnh xuất huyết gây tổn thất cho người nuôi về sản lượng và chất lượng sản phẩm khi xuất bán Trường hợp cấp tính có thể gây tử vong cao đến . hình nuôi cá tra ở Vi t Nam và Đồng Bằng Sông Cửu Long 2 2.1.1 Ở Vi t Nam 2 2.1.2 Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 2 2.2 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng Bằng Sông. PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG