phân lập và định danh vi khuẩn aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH PHÚ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG S

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRẦN THANH PHÚ

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN

Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRẦN THANH PHÚ

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN

Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2009

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh,

cô Nguyễn Thị Thu Hằng và chị Nguyễn Hà Giang đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này

Tôi cũng xin cảm ơn đến tất cả quí thầy cô và cán bộ Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ đã chỉ dẫn tận tình và truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quí báo trong thời gian học ở trường Đồng thời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31, tập thể anh em P6C1 cùng gia đình đã hết lòng giúp đỡ động viên tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu sưu tập và cung cấp dữ liệu về vi khuẩn

Aeromonas hydrophila trên cá tra bị xuất huyết nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu

Long, đồng thời cũng so sánh kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E Kết quả đề tài đã thu được 5/17 ao cá

bị xuất huyết, phân lập được 28 chủng vi khuẩn Aeromonas Tám chủng vi

khuẩn đại diện gồm SĐ2.1T, SĐ2.2T, CA1.2T, CA1.3TT, TN1.1T, TN2.4TT, TN2.1G và CS2.3T đã được kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa bằng bộ kít API 20E và phương pháp sinh hóa truyền thống dựa theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993) Kết quả định danh của hai phương pháp trong nghiên cứu này không có sự khác biệt lớn, cả 8 chủng vi

khuẩn được định danh đều là vi khuẩn A.hydrophila.

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

LỜI CẢM TẠ ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

PHẦN I GIỚI THIỆU 1

PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam và Đồng Bằng Sông Cửu Long 2

2.1.1 Ở Việt Nam 2

2.1.2 Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 2

2.2 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 4

2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 6

PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 8

3.2 Vật liệu nghiên cứu 8

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 8

3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 8

3.3 Hóa chất 8

3.3.1 Các hóa chất và môi trường dùng để phân lập vi khuẩn 8

3.3.2 Các hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E 9

3.4 Phương pháp nghiên cứu 9

3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 9

3.4.2 Phân lập vi khuẩn 9

3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn 10

3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 10

3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 10

3.5.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E 11

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

4.1 Kết quả 14

4.1.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila 14

4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 15

4.1.3 Định danh vi khuẩn phân lập bằng bộ kít API 20E 20

4.2 Thảo luận 22

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 24

5.1 Kết luận 24

5.2 Đề xuất 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

PHỤ LỤC 29

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Các chỉ tiêu định danh A hydrophila bằng phương pháp sinh

hóa truyền thống

Bảng 3.2 Các chỉ tiêu định danh A hydrophila bằng bộ kít API 20E

Bảng 4.1 Kết quả thu mẫu

Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 8 chủng vi khuẩn phân lập.Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kít API 20E

DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1 Cá bị xuất huyết

Hình 4.2 Hình dạng vi khuẩn A hydrophila ở vật kính 100X

Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn A hydrophila trên môi trường TSA

Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn A hydrophila trên môi trường Aeromonas agar

PHẦN I GIỚI THIỆU

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất giàu tiềm năng được thiên nhiên ưu đãi có lợi thế rất lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đã có những bước phát triển vượt bậc mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt cá tra đang là đối tượng nuôi chiến lược, thu lại nguồn ngoại tệ rất lớn Đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá tra, ba sa trên 5.600 ha, so với năm 2000, diện tích này tăng trên

10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007) Tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt mức 4 tỷ USD (VASEP, 2008)

Tuy nhiên do sự gia tăng quá mức của phong trào nuôi cá tra trong khi trình độ kỹ thuật của người nuôi chủ yếu chỉ dựa vào kinh nghiệm Mặt khác do phát triển tự phát thiếu qui hoạch, mật độ thả nuôi cao và công tác quản lý dịch bệnh còn hạn chế nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra gây thiệt hại cho người nuôi Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản do vi khuẩn

chiếm tới 50,9% Theo điều tra của Nguyễn Thanh Phương và ctv (2007) thì số

nông hộ nuôi cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện vào mùa lũ chiếm tới

88% Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì Aeromonas là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên nhiều loài cá, trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A hydrophila được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất (Lewis

and Plumb, 1979)

Đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Đồng

Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm sưu tập và cung cấp dữ liệu về vi

khuẩn A hydrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết nuôi ở ĐBSCL

Đề tài bao gồm các nội dung: (1) Thu mẫu và phân lập vi khuẩn A hydrophila từ cá tra bị bệnh xuất huyết; (2) Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập từ cá tra bệnh xuất huyết bằng phương

pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E

PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam và ĐBSCL

2.1.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam

Trong những năm gần đây ngành nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới đã không ngừng phát triển mạnh mẽ có mức tăng trưởng kinh tế cao trong xuất khẩu thuỷ sản Theo số liệu của Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của

cả nước đạt mức 4 tỷ USD Mười tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị

so với cùng kỳ năm ngoái (Bộ thủy sản, 2007)

Riêng nghề nuôi cá tra cũng có những bước phát triển rất vượt bậc không những

ở quy mô diện tích mà còn có sự gia tăng mật độ nuôi ở mức độ thâm canh hóa Năng suất cá tra nuôi ao ở một số vùng đã tăng đến 350 - 500 tấn/ha/vụ, thậm chí đến 700 tấn/ha/vụ, do mật độ nuôi đã tăng lên đến 40 - 50 con/m2 (Nguyễn Thanh

Phương và ctv, 2007)

Mặc dù trong những năm qua nghề nuôi cá tra ở Việt Nam có những bước thăng trầm do giá cả không ổn định, chịu tác động của nhiều vụ kiện bán phá giá, yêu cầu về kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm ngày một khắc khe Đặc biệt các thị trường lớn như Mỹ, Nhật, EU đòi hỏi rất nghiêm ngặt về chất lượng sản phẩm Sản phẩm cá tra thịt trắng có nhu cầu ngày càng cao là những thách thức đặt ra cho các nhà doanh nghiệp chế biến xuất khẩu và người nuôi

Theo Bộ Thủy Sản (2007) sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng từ 720.000 tấn ở năm 2000 lên đến 1.256.938 tấn năm 2004 Năm 2005, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 1.437.355 tấn và giá trị xuất khẩu khoảng 1.627,3 triệu USD Năm 2006, sản lượng nuôi trồng thủy sản của cả nước đạt 1.694.271 tấn, trong đó sản lượng

cá tra chiếm 825.000 tấn

2.1.2 Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

Đồng Bằng Sông Cửu Long là nơi có tiềm năng nuôi cá tra rất lớn, đã có truyền thống nuôi cá tra từ lâu đời, cùng với lợi thế về diện tích mặt nước, hàng năm vùng không ngừng nâng cao về mặt sản lượng cá tra, basa xuất khẩu Tính từ năm

2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800

tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước

Chỉ trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (Quang Hải, 2008)

Theo số liệu đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá tra, ba sa trên 5.600 ha So với năm 2000, diện tích này đã tăng trên 10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007)

An Giang là tỉnh có nghề nuôi cá tra phát triển nhất ở ĐBSCL, chiếm 90% tổng kim ngạch xuất khẩu của tỉnh Sản lượng cá tra nuôi của tỉnh An Giang tăng từ 25 đến 27%/năm và chiếm 70% sản lượng cá tra nuôi của khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long

Trong quí I/2008, An Giang đạt sản lượng nuôi cá tra trên 90.000 tấn, tăng 63%

so cùng kỳ Chủ tịch Hiệp hội nuôi và chế biến xuất khẩu thủy sản An Giang (AFA) cho biết: sản lượng cá tra nuôi của tỉnh An Giang quí II/2008 lứa đầu thu hoạch khoảng 25.000 tấn Trong khi cá nguyên liệu cần cho các nhà máy chế biến trong tỉnh trên 100.000 tấn/quí Hiện nay, sản phẩm cá tra xuất khẩu đang thuận lợi cả về thị trường và giá cả, giá xuất sản phẩm cá tra thịt trắng từ 3,2 đến 3,4 USD/kg (4 tháng đầu năm giá xuất bình quân 2,8 USD/kg) (Huy Bình, 2008) Còn Đồng Tháp tuy vào mùa thu hoạch rộ cá tra cũng đối mặt với nhiều khó khăn như doanh nghiệp không đủ vốn để mua cá nguyên liệu, người nuôi cá tra không

đủ tiền mua thức ăn cho cá phải “treo” ao nhưng kim ngạch xuất khẩu thủy sản,

mà chủ lực là cá tra, ba sa, vẫn tăng khá Hiện nay, thủy sản là mặt hàng xuất khẩu chính yếu, chiếm gần 70% tổng kim ngạch xuất khẩu toàn tỉnh Đồng Tháp

Từ đầu năm đến nay, các doanh nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp đã chế biến 83.101 tấn thủy sản, đồng thời xuất khẩu trên 62.509 tấn thủy sản, trị giá hơn 179 triệu USD, tăng 61,92% về sản lượng và 47,14% về giá trị (Sở Công Thương Đồng Tháp, 2009)

Và theo báo cáo của Sở Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn tỉnh Vĩnh Long, mặc dù trong thời gian gần đây giá cá tra nguyên liệu giảm ở mức thấp gây khó khăn cho các hộ nuôi nhưng diện tích ao, hầm nuôi cá tra trên địa bàn tỉnh vẫn duy trì ở mức 334 ha Sản lượng cá tra trong tháng 8 này ước đạt khoảng 11.030,5

tấn, sản lượng từ đầu năm đến hết tháng 8/2008 khoảng 85.030 tấn (tăng gần 11.000 tấn so với cuối tháng 6/2008) Theo dự báo của Sở Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, đến hết năm 2008 sản lượng cá tra công nghiệp ước tính đạt

khoảng 122.000 tấn (Mỹ Trung, 2008)

2.2 Tình hình bệnh trên cá tra ở ĐBSCL

Cá tra, basa cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến, các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng Theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần số xuất hiện bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản là cao nhất với 50,9% Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận, nấm, thối mang Trong đó bệnh mủ gan xảy ra với tần suất cao nhất

Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá Nheo nuôi tại châu Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ESC (Enteric septicaemia of catfish) Còn ở Việt Nam E.ictaluri gây bệnh trên cá tra

được gọi bệnh mủ gan Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở ĐBSCL vào cuối năm

1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson

và ctv, 2001)

Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên

ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận Đặc biệt những năm gần đây bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng Cá bị bệnh mủ gan không có dấu hiệu bất thường bên ngoài Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu không phát hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn Bên trong nội tạng (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1 - 3mm và các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận

Bệnh mủ gan có thể xảy ra trên cá tra nuôi ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có

thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003), tỉ lệ hao hụt ở cá tra giống

có thể từ 10 - 90%, nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất là ở giai đoạn cá có trọng

lượng từ 300 - 500g (Từ Thanh Dung và ctv, 2004)

Đầu năm 2006, bệnh mủ gan đã gây thiệt hại nghiêm trọng với cá tra nuôi thâm canh ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006)

Kết quả điều tra của Từ Thanh Dung (2005) cho biết bệnh mủ gan thường bắt đầu xuất hiện vào tháng 5 và phát triển mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 rồi giảm xuống ở các tháng còn lại Đặc biệt bệnh mủ gan xuất hiện cao nhất vào thời gian lũ về với tỉ lệ 85,4% số hộ nuôi cá ở An Giang bị nhiễm bệnh (Trần Anh Dũng, 2005) Lê Thị Bé Năm (2002) cũng cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ trong năm, nước đục mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, đồng thời nước chảy mạnh làm cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm bệnh Ngoài ra, Trương Quốc Phú (2004) còn cho rằng nhiệt độ nước dao động trong khoảng 26 - 28oC là điều kiện tốt cho vi khuẩn E ictaluri phát triển và gây

bệnh

Bên cạnh đó, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A hydrophila cũng là một loại bệnh

phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm trên cá tra và cá basa nuôi bè Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài là xuất huyết trên gốc các vi và xoang miệng Bên trong thấy xuất huyết ở cơ, ruột, mô mỡ, kèm theo những dấu hiệu khác như trương bụng hay lỡ loét ở gốc vi đuôi và vi hậu

môn (Phan Văn Ninh và ctv, 1993) Bệnh xuất huyết gây tổn thất cho người nuôi

về sản lượng và chất lượng sản phẩm khi xuất bán Trường hợp cấp tính có thể gây tử vong cao đến 80 - 90% những trường hợp mãn tính thịt cá có nhiều điểm xuất huyết màu đỏ và sẽ bị loại bỏ hay hạ phẩm cấp trong quá trình chế biến xuất khẩu (Hứa Thị Phượng Liên, 1998)

Bệnh vàng da trên cá tra là một bệnh mới xuất hiện gần đây cũng gây thiệt hại lớn cho ngành thủy sản Tác nhân gây ra bệnh thì chưa được xác định rõ ràng Phan Thị Hừng (2004) cho biết cá tra vàng da lượng hồng cầu của máu cá chỉ còn 50%

so với cá khỏe Phạm Thanh Hương (2006) cũng có kết luận tương tự khi đưa ra

tỷ lệ giảm hồng cầu của cá tra vàng da là 20% Đồng thời, Lê Thành Cường (2006) cũng nhận xét trên cá tra bị vàng da thì lượng máu cá không có nhiều và máu không có màu đỏ như cá khỏe, quan sát mẫu nhuộm máu thấy hồng cầu bị biến dạng nhiều Ngoài ra, một tác nhân khác cũng được đề cập đến là kí sinh trùng, đặc biệt là giun tròn với đặc tính thích chui vào ống mật làm viêm nhiễm đường mật, tắc ống mật gây vàng da Tuy nhiên, tác giả Lê Thành Cường (2006)

thì cho rằng kí sinh trùng không phải là tác nhân gây bệnh vàng da ở cá tra tại ĐBSCL

2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, Aeromonas là vi khuẩn Gram

âm, di động, hình que, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả

năng lên men, oxidase dương tính, kháng với O/129 bao gồm A hydrophila, A.caviae, A.sorbia… (Từ Thanh Dung, 2005)

Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu hay bệnh

sởi…Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A hydrophila gây ra (theo Bergey

1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005)

Trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A hydrophila được xem là

loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên (Lewis and Plumb, 1979)

Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A hydrophila có biểu hiện chung là da

thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mở xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn treo râu Theo thí nghiệm cảm nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì cá tra sau khi cảm

nhiễm với A hydrophila có biểu hiện xuất huyết trên thận, hậu môn sưng đỏ, các

tia vây xuất huyết,…nhưng không gây chết hàng loạt trong thời gian 7 ngày thí

nghiệm Thu mẫu cá chết phân lập chỉ có một loài duy nhất là A hydrophila

A hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java - Indonesia và gây tỉ lệ chết từ

80 - 90% (Angka, 1990) Năm 1982 Saitanu và ctv đã tìm thấy vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép (Saitanu et al., 1982) Vi khuẩn này còn gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng giống (Clarias batrachus) và là tác nhân

gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979)

Vi khuẩn A hydrophila còn được tìm thấy trên bệnh phẩm cá trê (Clarias sp)

(trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005)

Cũng theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005) vào thời gian lũ rút, các hộ nuôi cá tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện rất cao, với 85.4% hộ đã ghi nhận

Bệnh do A hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa xuân - hè, nhiệt

độ nước khoảng 17 - 22oC, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt

độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993) Bên cạnh đó, Groberg khi gây cảm nhiễm A hydrophila trên cá hồi đã kết luận tỉ lệ chết thường

cao ở 20,5oC và 17oC, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15oC và 12oC, ở 9oC hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không thấy cá chết (trích dẫn bởi Roselynn and Stevenson, 1988)

Trong báo cáo của Rahman et al., (2000) ông cho rằng vi khuẩn A hydrophila có

độc lực cao nhất khi to = 17oC (LD50=106.03 CFU/ml) và 25oC (LD50=106.53

CFU/ml) đối với thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus) Bên cạnh đó, Azad et al., (2001) gây cảm nhiễm vi khuẩn A hydrophila trên cá rô

phi bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn 107 CFU/ml đã gây chết 80% cá thí nghiệm Năm 2001 trong thí nghiệm của mình, Đoàn Nhật Phương tiến hành

gây cảm nhiễm 15 chủng A hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với

mật độ vi khuẩn từ 103 CFU/ml đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có LD50 lần lượt là 3,68x106CFU/ml (chủng A4); 2,64x106 CFU/ml và 4,52x106 CFU/ml (chủng A11); 1,96x106 CFU/ml và 1,45x107 CFU/ml (chủng A13)

PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

- Thu mẫu cá tra từ các ao nuôi thâm canh ở Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ

- Phân tích mẫu tại các phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản

- Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 05 năm 2009

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Ðối tượng nghiên cứu

- Cá tra có dấu hiệu xuất huyết được thu mẫu trong ao nuôi thâm canh ở Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ

3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

- Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, bộ tiểu phẩu, khay nhựa

- Pipet, ống nghiệm, ống đong

- Lame, lamella, đĩa petri, giấy nhôm

- Kính hiển vi, giấy lau kính hiển vi

- Chai nấu môi trường, cá từ, bình tam giác, cốc thủy tinh

- Đầu cole, ống hút, găng tay

- Tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh

- Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng

- Cân điện tử, lò viba, máy lắc

3.3.2 Các hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kít API 20E

- Bộ kít API 20E (bộ test và thuốc thử: TDA, IND, VP)

- Các loại hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh hóa truyền thống

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển

- Dự kiến thu khoảng 90 mẫu ở 15 ao, mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá khỏe

- Cá thu có dấu hiệu bệnh lý và còn sống

- Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thùng mướp có sục khí và được phân tích ngay Chỉ sử dụng những mẫu còn sống

3.4.2 Phân lập vi khuẩn

- Mẫu cá dùng để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống

- Trước khi giải phẩu đặt cá trên khay sạch Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của bệnh

- Cá được tiệt trùng bên ngoài bằng cồn 70o và lau sạch Sau đó, dùng dao kéo

đã tiệt trùng để mổ cá Khi mổ tránh làm vỡ các cơ quan nội tạng

- Hơ que cấy vi sinh trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ và để nguội

- Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bên trong

- Lấy mẫu vi sinh ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng cấy trên môi trường NA

- Ủ đĩa trong tủ ấm 28oC sau 18 - 24 giờ Ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn lạc, tiến hành tách ròng cho đến khi đạt đĩa cấy thuần

Các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng

3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn

- Trước khi nuôi tăng sinh các chỉ tiêu cơ bản gồm nhuộm Gram, tính di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F phải được kiểm tra

- Sau đó chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đã tiệt trùng đặt trên máy lắc (200 vòng/phút) sau 18 - 24 giờ đọc kết quả

3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn

3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống

Các chỉ tiêu sinh hóa được xác định theo phương pháp của Barrow và Feltham (1993) Cách tiến hành, thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở phụ lục 1 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Các chỉ tiêu định danh vi khuẩn A hydrophila bằng phương pháp sinh

7 Phản ứng lên men yếm khí

8 Phản ứng lên men hiếu khí

9 Arginine

10 Lysine

11 Ornithine

12 Mọc trên môi trường Aeromonas

13 Sinh gas từ glucose

14 Thuỷ phân aesculine

20 Thuỷ phân Tween 80

21 Tạo nitrit từ nitrat

22 Mọc ở 0% NaCl

23 Mọc ở 3% NaCl

3.5.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E

- Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux)

- Các chỉ tiêu định danh bằng bộ kít API 20E được trình bày ở bảng 3.2

- Các chỉ tiêu nhuộm Gram, di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F của vi khuẩn được kiểm tra trước khi định danh bằng kít API 20E

Phương pháp thực hiện

- Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều

- Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm

- Dùng pipet với đầu cole tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của

bộ kít Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô ngoại trừ 3 ô CIT,

VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí

- Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm ở 28oC

Bảng 3.2: Các chỉ tiêu định danh A hydrophila bằng bộ kít API 20E

- ONPG: ortho - nitrophenyl galactosidase - GEL: gelatin

- ADH: arginine dihydrolase - GLU: glucose

- LDC: lysine decarboxylase - MAN: mannitol

- ODC: ornithine decarboxylase - INO: inositol

- CIT: citrate - SOR: sorbitol

- H 2S: sinh H 2 S - RHA: rhamnose

- URE: urea - SAC: sucrose

- TDA: tryptophane deaminase - MEL: melibiose

- IND: indole - AMY: amygdaline

- VP: phản ứng Voges - Proskauer - ARA: arabinnose

Đọc kết quả: sau 18 - 24h

- Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết quả dựa vào bảng bên trên

- Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử

9 TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA Một màu đen xuất hiện thì kết quả phản ứng là dương tính (+), màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính (-)

9 IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND Đợi 2 phút Một vòng màu đỏ xuất hiện

là phản ứng dương tính (+), màu vàng là phản ứng âm tính (-)

9 VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1,VP2 Đợi ít nhất

10 phút, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính (+) Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 - 12 phút là phản ứng âm tính (-)

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả

4.1.1 Tình hình bệnh xuất huyết ở các ao nuôi cá tra

Qua kết quả thu mẫu và phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ đề tài đã thu mẫu được tổng số 17 ao ở 3 tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ Trong tổng số

17 ao thu được có 5 ao cá bị bệnh xuất huyết (chiếm 29,41%) Số ao thu được ở Đồng Tháp là 10 ao trong đó có 1 ao bị bệnh xuất huyết (chiếm 10%) Số ao thu ở Vĩnh Long là 4 ao trong đó có 1 ao bệnh xuất huyết (chiếm 25%) và ở Cần Thơ thì cả 3 ao cá đều bị bệnh xuất huyết (Bảng 4.1 và phụ lục 2)

Bảng 4.1 Bảng kết quả thu mẫu

STT Địa điểm Tổng số ao thu Số ao bệnh xuất huyết Số chủng Aeromonas

Kết quả phân tích vi sinh ở 5 ao cá bị bệnh xuất huyết đã phân lập được

tổng số 28 chủng vi khuẩn Aeromonas (Đồng Tháp: 4 chủng; Vĩnh Long: 4

chủng; Cần Thơ: 20 chủng) Dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá lúc phân tích và hình thái khuẩn lạc đã chọn ra 8 chủng vi khuẩn đại diện (Đồng Tháp: 2 chủng; Vĩnh Long: 2 chủng; Cần Thơ: 4 chủng) (Bảng phụ lục 3) để tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E Kết quả định

danh bằng 2 phương pháp cả 8 chủng vi khuẩn đều là A hydrophila (Bảng 4.2 và

Bảng 4.3)

Hình 4.1 Cá bị xuất huyết

4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống

Trong số 28 chủng vi khuẩn phân lập được dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá bệnh

và một số thông tin lúc thu mẫu cũng như trong quá trình phân lập chọn ra 8 chủng vi khuẩn, trong đó có 2 chủng ở Đồng Tháp (SĐ2.1T, SĐ2.2T), 2 chủng ở Vĩnh Long (CA1.2T, CA1.3TT) và 4 chủng ở Cần Thơ (TN1.1T, TN2.4TT, TN2.1G, CS2.3T) để tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa

Kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993) Mỗi chỉ tiêu được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần lặp lại Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn kiểm tra được trình bày ở Bảng 4.2

Theo bảng kết quả kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa (Bảng 4.2) thì toàn bộ 8 chủng vi khuẩn được định danh đều là vi khuẩn gram âm, hình que (Hình 4.2), có khả năng di động nhưng không sinh sắc tố Khuẩn lạc của

vi khuẩn có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và màu trắng đục trên môi trường TSA (Hình 4.3), còn trên môi trường Aeromonas agar thì khuẩn lạc của vi khuẩn cũng có dạng tròn, lồi, nhẵn, nhưng có màu vàng (Hình 4.4)