phân lập và định danh vi khuẩn aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH PHÚ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH PHÚ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts ĐẶNG THỊ HỒNG OANH 2009 LỜI CẢM TẠ Tơi xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hồng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hằng chị Nguyễn Hà Giang tận tình hướng dẫn giúp đỡ thực đề tài nghiên cứu Tôi xin cảm ơn đến tất q thầy cán Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ dẫn tận tình truyền đạt cho tơi kiến thức, kinh nghiệm q báo thời gian học trường Đồng thời cảm ơn đến tất bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31, tập thể anh em P6C1 gia đình hết lịng giúp đỡ động viên tơi vượt qua khó khăn để hoàn thành đề tài nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT Đề tài thực nhằm mục tiêu sưu tập cung cấp liệu vi khuẩn Aeromonas hydrophila cá tra bị xuất huyết nuôi Đồng Bằng Sông Cửu Long, đồng thời so sánh kết định danh vi khuẩn phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E Kết đề tài thu 5/17 ao cá bị xuất huyết, phân lập 28 chủng vi khuẩn Aeromonas Tám chủng vi khuẩn đại diện gồm SĐ2.1T, SĐ2.2T, CA1.2T, CA1.3TT, TN1.1T, TN2.4TT, TN2.1G CS2.3T kiểm tra tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa kít API 20E phương pháp sinh hóa truyền thống dựa theo cẩm nang Cowan Steel (Barrow Feltham, 1993) Kết định danh hai phương pháp nghiên cứu khác biệt lớn, chủng vi khuẩn định danh vi khuẩn A.hydrophila ii MỤC LỤC TÓM TẮT i LỜI CẢM TẠ ii MỤC LỤC .iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v PHẦN I GIỚI THIỆU PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ni cá tra Việt Nam Đồng Bằng Sông Cửu Long 2.1.1 Ở Việt Nam 2.1.2 Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 2.2 Tình hình bệnh cá tra Đồng Bằng Sông Cửu Long 2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2.2 Dụng cụ sử dụng nghiên cứu 3.3 Hóa chất 3.3.1 Các hóa chất môi trường dùng để phân lập vi khuẩn 3.3.2 Các hóa chất mơi trường dùng để định danh vi khuẩn phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Thu mẫu, bảo quản vận chuyển 3.4.2 Phân lập vi khuẩn 3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn 10 3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 10 3.5.1 Định danh vi khuẩn phương pháp sinh hóa truyền thống 10 3.5.2 Định danh vi khuẩn kít API 20E 11 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 4.1 Kết 14 4.1.1 Tình hình bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 14 4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập phương pháp sinh hóa truyền thống 15 4.1.3 Định danh vi khuẩn phân lập kít API 20E 20 4.2 Thảo luận 22 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 24 5.1 Kết luận 24 5.2 Đề xuất 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 PHỤ LỤC 29 iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Các tiêu định danh A hydrophila phương pháp sinh hóa truyền thống Bảng 3.2 Các tiêu định danh A hydrophila kít API 20E Bảng 4.1 Kết thu mẫu Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Bảng 4.3 Kết kiểm tra tiêu sinh hóa kít API 20E iv DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Cá bị xuất huyết Hình 4.2 Hình dạng vi khuẩn A hydrophila vật kính 100X Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn A hydrophila mơi trường TSA Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn A hydrophila mơi trường Aeromonas agar Hình 4.5 Kết phản ứng decarboxylase Hình 4.6 Kết phản ứng citrate Hình 4.7 Các phản ứng sử dụng đường Hình 4.8 Kết định danh kít API 20E v PHẦN I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) vùng đất giàu tiềm thiên nhiên ưu đãi có lợi lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản Trong năm gần ni trồng thủy sản ĐBSCL có bước phát triển vượt bậc mang lại hiệu kinh tế cao, đặc biệt cá tra đối tượng nuôi chiến lược, thu lại nguồn ngoại tệ lớn Đến tháng 08 năm 2007, tồn vùng ĐBSCL có tổng diện tích ni cá tra, ba sa 5.600 ha, so với năm 2000, diện tích tăng 10 lần dự báo tiếp tục tăng nhanh năm tới (Chu Thạch, 2007) Tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất thuỷ sản nước đạt mức tỷ USD (VASEP, 2008) Tuy nhiên gia tăng mức phong trào nuôi cá tra trình độ kỹ thuật người ni chủ yếu dựa vào kinh nghiệm Mặt khác phát triển tự phát thiếu qui hoạch, mật độ thả nuôi cao cơng tác quản lý dịch bệnh cịn hạn chế nên dịch bệnh thường xuyên xảy gây thiệt hại cho người nuôi Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất bệnh động vật thủy sản vi khuẩn chiếm tới 50,9% Theo điều tra Nguyễn Thanh Phương ctv (2007) số nơng hộ ni cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất vào mùa lũ chiếm tới 88% Theo Đỗ Thị Hòa ctv (2004) Aeromonas tác nhân gây bệnh xuất huyết nhiều loài cá, loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas A hydrophila xem lồi gây bệnh cho cá nước quan trọng (Lewis and Plumb, 1979) Đề tài “Phân lập định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi Đồng Bằng Sông Cửu Long” thực nhằm sưu tập cung cấp liệu vi khuẩn A hydrophila cá tra bị bệnh xuất huyết nuôi ĐBSCL Đề tài bao gồm nội dung: (1) Thu mẫu phân lập vi khuẩn A hydrophila từ cá tra bị bệnh xuất huyết; (2) Xác định tiêu sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập từ cá tra bệnh xuất huyết phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E Trang PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ni cá tra Việt Nam ĐBSCL 2.1.1 Tình hình ni cá tra Việt Nam Trong năm gần ngành nuôi trồng thuỷ sản Việt Nam với phát triển ngành nuôi trồng thuỷ sản giới khơng ngừng phát triển mạnh mẽ có mức tăng trưởng kinh tế cao xuất thuỷ sản Theo số liệu Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất thuỷ sản nước đạt mức tỷ USD Mười tháng đầu năm, xuất thuỷ sản nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% lượng 24,4% giá trị so với kỳ năm ngoái (Bộ thủy sản, 2007) Riêng nghề nuôi cá tra có bước phát triển vượt bậc khơng quy mơ diện tích mà cịn có gia tăng mật độ ni mức độ thâm canh hóa Năng suất cá tra nuôi ao số vùng tăng đến 350 - 500 tấn/ha/vụ, chí đến 700 tấn/ha/vụ, mật độ nuôi tăng lên đến 40 - 50 con/m2 (Nguyễn Thanh Phương ctv, 2007) Mặc dù năm qua nghề nuôi cá tra Việt Nam có bước thăng trầm giá không ổn định, chịu tác động nhiều vụ kiện bán phá giá, yêu cầu kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm ngày khắc khe Đặc biệt thị trường lớn Mỹ, Nhật, EU đòi hỏi nghiêm ngặt chất lượng sản phẩm Sản phẩm cá tra thịt trắng có nhu cầu ngày cao thách thức đặt cho nhà doanh nghiệp chế biến xuất người nuôi Theo Bộ Thủy Sản (2007) sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng từ 720.000 năm 2000 lên đến 1.256.938 năm 2004 Năm 2005, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 1.437.355 giá trị xuất khoảng 1.627,3 triệu USD Năm 2006, sản lượng nuôi trồng thủy sản nước đạt 1.694.271 tấn, sản lượng cá tra chiếm 825.000 2.1.2 Tình hình ni cá tra Đồng Bằng Sông Cửu Long Đồng Bằng Sơng Cửu Long nơi có tiềm ni cá tra lớn, có truyền thống ni cá tra từ lâu đời, với lợi diện tích mặt nước, hàng năm vùng không ngừng nâng cao mặt sản lượng cá tra, basa xuất Tính từ năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất 292.800 Trang tấn, thu kim ngạch xuất 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất thủy sản nước Chỉ tháng đầu năm 2007, diện tích ni cá tra toàn vùng ĐBSCL lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số lượng cá tra xuất 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất 462,4 triệu USD, tăng 32% lượng 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (Quang Hải, 2008) Theo số liệu đến tháng 08 năm 2007, tồn vùng ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá tra, ba sa 5.600 So với năm 2000, diện tích tăng 10 lần dự báo tiếp tục tăng nhanh năm tới (Chu Thạch, 2007) An Giang tỉnh có nghề nuôi cá tra phát triển ĐBSCL, chiếm 90% tổng kim ngạch xuất tỉnh Sản lượng cá tra nuôi tỉnh An Giang tăng từ 25 đến 27%/năm chiếm 70% sản lượng cá tra nuôi khu vực Đồng Bằng Sơng Cửu Long Trong q I/2008, An Giang đạt sản lượng nuôi cá tra 90.000 tấn, tăng 63% so kỳ Chủ tịch Hiệp hội nuôi chế biến xuất thủy sản An Giang (AFA) cho biết: sản lượng cá tra nuôi tỉnh An Giang quí II/2008 lứa đầu thu hoạch khoảng 25.000 Trong cá nguyên liệu cần cho nhà máy chế biến tỉnh 100.000 tấn/quí Hiện nay, sản phẩm cá tra xuất thuận lợi thị trường giá cả, giá xuất sản phẩm cá tra thịt trắng từ 3,2 đến 3,4 USD/kg (4 tháng đầu năm giá xuất bình quân 2,8 USD/kg) (Huy Bình, 2008) Cịn Đồng Tháp vào mùa thu hoạch rộ cá tra đối mặt với nhiều khó khăn doanh nghiệp không đủ vốn để mua cá nguyên liệu, người nuôi cá tra không đủ tiền mua thức ăn cho cá phải “treo” ao kim ngạch xuất thủy sản, mà chủ lực cá tra, ba sa, tăng Hiện nay, thủy sản mặt hàng xuất yếu, chiếm gần 70% tổng kim ngạch xuất toàn tỉnh Đồng Tháp Từ đầu năm đến nay, doanh nghiệp chế biến thủy sản xuất địa bàn tỉnh Đồng Tháp chế biến 83.101 thủy sản, đồng thời xuất 62.509 thủy sản, trị giá 179 triệu USD, tăng 61,92% sản lượng 47,14% giá trị (Sở Công Thương Đồng Tháp, 2009) Và theo báo cáo Sở Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn tỉnh Vĩnh Long, thời gian gần giá cá tra nguyên liệu giảm mức thấp gây khó khăn cho hộ ni diện tích ao, hầm nuôi cá tra địa bàn tỉnh trì mức 334 Sản lượng cá tra tháng ước đạt khoảng 11.030,5 Trang Tuấn Anh (2005) cho phản ứng citrate dương tính giúp phân biệt A hydrophila với A sorbia Nhìn chung, chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập nghiên cứu ngoại trừ tiêu VP thủy phân Tween 80 âm tính, khác với nghiên cứu trước có dao động phản ứng indole hai phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E tất tiêu lại phù hợp với nghiên cứu nhiều tác giả trước Đặng Thị Hoàng Oanh (2006), Buller (2004), Đoàn Nhật Phương (2001), Cao Tuấn Anh (2005) Nguyễn Hà Giang (2008) Việc có dao động kết hai phương pháp giải thích áp dụng phương pháp khác sai sót thao tác q trình định danh Cịn việc vi khuẩn A hydrophila phân lập đề tài có sai khác với nghiên cứu trước nguồn gốc vi khuẩn khác dẫn đến sai khác đặc điểm sinh hóa nghiên cứu Trang 23 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Sưu tập chủng vi khuẩn A hydrophila (SĐ2.1T, SĐ2.2T, CA1.2T, CA1.3TT, TN1.1T, TN2.4TT, TN2.1G CS2.3T) - Khơng có khác biệt lớn kết kiểm tra hai phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E 5.2 Đề xuất - Nên tiến hành thu mẫu định kỳ thời gian dài hơn, để kết khảo sát tình hình bệnh xuất huyết A hydrophila có tính thuyết phục - Cần khẳng định kết định danh vi khuẩn phản ứng PCR Trang 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abbott, S.L., K.W.C Wendy and J Michel Janda, 2003 The Genus Aeromonas: Biochemical Charateristics, Atypical Reaction, and Phenotypic Indentification Schemes J of Clin Micro., p 2348 - 2357 Vol 41, No Angka, S.L., 1990.The Pathology of the Walking catfish Clarias batrachus (L), infected intraperitoneally with Aeromonas hydrophila Asian Fish Sei 3: 343 - 351.In Asian Fish Health Bibliography and Abtracts I: Southeast Asia Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992 Azad A.K., D.R Stanford, S Sarkar, A.K Hopper, 2001 Role of the nuclear pools of aminoacyl - tRNA synthetases in tRNA nuclear export Mol Biol Cell 12: 1381–1392 Barrow and Felltham, 1993 Manual for the Indentification of Medica Bacteria, 262pages Bộ Tài Nguyên Môi Trường Việt Nam, 2006 http://www.monre.gov.vn Bộ thủy sản, 2007 http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1015068&News_ID=6338328 Buller, N B .2004.Bacteria from fish and other aquatic animal: A practical indentification manual.CABI publishing 353 pp Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thủy sản.Đai Học Thủy Sản Nha Trang Cao Tuấn Anh, 2005.Thành phần giống loài vi khuẩn ký sinh trùng cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) huyện Tân Châu tỉnh An Giang.LVTN Khoa Thủy Sản - ĐHCT 10 Chu Thạch, 2007 Giải pháp để cá không phá mơi trường 11 Đặng Thị Hồng Oanh, 2006 Đặc điểm sinh hóa kiểu ARN ribosom vi khuẩn A hydrophila phân lập từ bệnh phẩm thủy sản nuôi ĐBSCL Tạp chí nghiên cứu khoa học 2006:5 Trang 85 - 94 12 Đoàn Nhật Phương, 2001 Xác định LD50 thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) cá chép (Cyprinus carpio).LVTN.Khoa Thủy Sản - ĐHCT 13 Đỗ Thị Hòa Nguyễn Thị Muội, 2004 Giáo trình bệnh thủy sản NXB Nha Trang 14 Esteve, C., E.G Biosca and C Amaro, 1993 Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguila reared in fresh water In Diseases of Aquatic organisms Vol 16: 15 20 15 Ferguson H.W., J.F Turnbull, A Shinn, K Thompson, T.T Dung and M Crumlish, 2001 Bacillary nercrosis in farmed Pangasius hypopthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Viet Nam Journal of Fish Diseases 2001,24,509 - 513 16 Hawke J.P., 1979 A bacterium associated with diseases of pond cultured channel catfish Journal of Fisheries Research Board of Canada 36: 1508 1512 Trang 25 17 Huỳnh Văn Quang 2008 Khảo sát tình hình nghề ni cá tra (Pangasius hypophthalmus) ao tỉnh Vĩnh Long LVTN Khoa Thủy Sản - ĐHCT 18 Huy Bình, 2008.http://www.agro.gov.vn/news/newsDetail.asp?targetID=8663 19 Huys, G., P Kampfer, 1997 Aeromonas popoffii sp.nov., a mesophilic bacterium isolated from drinking water production plants and reservoirs Int J of Syst.Bact.47: 1165 - 1171 20 Hứa Thị Phượng Liên, 1998 Nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá basa, cá tra An Giang biện pháp phòng trị Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, 71 trang Sở khoa học công nghệ môi trường An Giang 21 Lê Phú Khởi, 2006 Đánh giá thông tin liên quan đến quản lý sức khỏe cá tra (Pangasius hypophthalmus) tỉnh An Giang LVTN, Khoa Thủy Sản - Đại Học Cần Thơ 22 Lê Thành Cường, 2006 Khảo sát nội ký sinh cá tra (Pangasius hypophthalmus) bệnh vàng da ao nuôi thâm canh LVTN, Khoa Thủy Sản - ĐHCT 23 Lê Thị Bé Năm, 2002 Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng cá tra (Pangasius hypopthalmus).LVTN.Khoa Thủy Sản - ĐHCT 24 Lewis, D.H and J.A Plumb, 1979 Bacterial diseases p.15 - 24 In Principal diseases of farm raised catfish Southern Cooperative Ser 225 Auburn University Alabama 25 Lý Thị Thanh Loan, 2008 Hiện trạng môi trường bệnh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ĐBSCL – Giải pháp khắc phục Báo cáo tham luận hội nghị Giải pháp phát triển bền vững nghề nuôi chế biến cá tra ĐBSCL 26 Mỹ Trung, 2008 Năm 2008: Sản lượng cá tra cơng nghiệp có khả đạt 122.000 tấn.http://www.vtipvn.com/content/view/519/43/ 27 Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung, Ferguson H.W, 2003 Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh trắng gan Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, chuyên ngành thủy sản, 2004, 120 - 125 28 Nguyễn Hà Giang 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định tiêu sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila Khoa Thủy Sản LVTN Khoa Thủy Sản - ĐHCT 29 Nguyễn Thanh Phương, T.T.T Hoa, V.N Út, H.T Giang, C.T Anh, N.T.T.Hằng, P.T.N Thảo, Đ.T.M Thy, N.T.T Thảo, Đ.T.H Oanh, N.M Hậu, N.Q Thịnh, Đ.N Phương, 2007.Quan trắc môi trường xác định tác nhân gây bệnh cá da trơn (tra –Pangasianodon hypopthalmus Basa – Pangasius bocourti) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) tỉnh An Giang Trang 26 30 Phạm Thanh Hương, 2006 Xác định số yếu tố huyết học cá tra (Pangasiu hypophthalmus) bệnh vàng da tỉnh Cần Thơ LVTN, Khoa Thủy Sản - ĐHCT 31 Phan Thị Hừng, 2004 Nghiên cứu cấu trúc mô biến động số lượng tế bào hồng cầu cá tra (Pangasiu hypophthalmus) bệnh vàng da LVTN, Khoa Thủy Sản - ĐHCT 32 Phan Văn Ninh, Nguyễn Thị Phi Phượng, Phạm Thị Thu Hồng, Trần Châu Phương Tuấn, 1993 Điều tra vi sinh vật gây bệnh cá nuôi bè, nghiên cứu biện pháp phòng trị Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, 32 trang Sở Nông Nghiệp An Giang 33 Popoff, M 1984 Genus III Aeromonas In Bergey,s Mannual of Determinative Bacteriology, vol ed Krieg, N.R and Holt, J.G pp 545 548 Baltimore 34 Quang Hải, 2008 http://www.vietlinh.com.vn/ktcbxnk/vlktcbxnkShowContent.asp?ID=1029 35 Rahman, M.H., S Suzuki and K Kawai, 2000 The effect of temperature on Aeromonas hydrophila infection in goldfish Carassius auratus 36 Roselynn, M and W Stevenson, 1988 Vaccination against Aeromonas hydrophila In Fish Vaccination 9:112 - 123 37 Saitanu, K.S., Wongsawang and K Poonsuk, 1982 Red sore diseases in carp (Cyprinus carpio L) J Aquat Animal Dis.3: 79 - 86 (In Thai) In Asian Fish Health Bibliography and Abtracts I: Southeast Asia Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992 38 Sở Công Thương Đồng Tháp, 2009 http://www.dongthap.gov.vn/wps/portal/vn 39 Tanasomwang, V and K Saitanu, 1979 Ulcer diseases in striped catfish (Pangasius pangasius) J Aquat Animal Dis 2: 131 - 133 In Asian Fish Health Bibliography and Abtracts I: Southeast Asia Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992 40 Trần Anh Dũng, 2005 Khảo sát tác nhân gây bệnh ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) thâm canh tỉnh Ang Giang LVCH Khoa Thủy Sản - ĐHCT 41 Trương Quốc Phú, 2004 Bài giảng quản lý môi trường ao nuôi Khoa Thủy Sản - ĐHCT 42 Từ Thanh Dung, 2005 Bài giảng bệnh học thủy sản.Khoa Thủy Sản - Đại Học Cần Thơ 43 Từ Thanh Dung, M Crumlish, N.T.N Ngọc, N.Q Thịnh Đ.T.M Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng gan cá tra (Pangasius hypopthalmus), Tạp chí Khoa học Đại Học Cần Thơ chuyên ngành Thủy Sản 44 VASEP, 2008 Xuất thủy sản chạm ngưỡng tỉ USD.http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1015068&News_ID=191 175068 Trang 27 45 West, P.A., P.R Brayton, T.N Bryant & R.R Colwell, 1986 Numerical taxonomy of Vibrios isolated from aquatic enviroments Int J of Syst Bact 36 (4): 531 – 534 Trang 28 PHỤ LỤC Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ giọt nước cất lên lam kính, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trải lên giọt nước cất Để khô nhiệt độ phịng sau hơ lướt lam lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn lam Các bước thực hiện: Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I ) lên lam Để phút Rửa nước cho hết màu tím lam (khoảng giây), để khô Nhỏ dung dịch Iodine (dung dịch II) lên lam, để khoảng phút Lật nghiêng lam kính cho hết dung dịch Iodine lam Dùng dung dịch cồn: aceton (dung dịch III) để tẩy màu cách nghiêng lam kính nhỏ từ từ dung dịch III giọt nước cuối lam khơng cịn màu tím Rửa để khơ Nhỏ dung dịch Safranin (dung dich IV) lên lam, để khoảng phút Rửa để khơ nhiệt độ phịng Quan sát vật kính 100X Đọc kết Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh Vi khuẩn Gram âm (G - ) có màu hồng đỏ Quan sát tính di động Sự di động vi khuẩn quan sát phương pháp giọt nước treo vật kính 40X Các bước thực sau: Cho vaseline lên góc lamelle đặt ngửa lamelle bàn Cho giọt nước lên lamelle Tiệt trùng que cấy, lấy vi khuẩn cho lên lamelle hòa vào nước Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn lamelle Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle Đặt lam lên kính hiển vi quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X Phản ứng Oxidase Dùng que cấy phết vi khuẩn lên giấy lọc tẩm dung dịch oxidase Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) làm giấy lọc chuyển sang màu xanh vòng 10 giây ngược lại khơng chuyển màu ( - ) Phản ứng Catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 100ml nước cất) Nhỏ lên vi khuẩn giọt 3% H2O2 2.Dùng que cấy nhặt vi khuẩn để lên lam Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) gây tượng sủi bọt Trang 29 dung dịch 3% H2O2 ngược lại khơng sủi bọt ( - ) Khả lên men oxy hóa đường glucose (O/F) Các bước thực hiện: Đun khấy cho tan hoàn tồn mơi trường O/F Tiệt trùng 1210C 15 phút, để nguội 450C Thêm 1% glucose tiệt trùng Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa mơi trường O/F Sau phủ 0.5 - 1ml dầu parafin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí ống nghiệm Để tủ ấm 280C Theo dõi đọc kết sau từ đến ngày Lên men (F) ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng Oxidation (O) ống khơng có phủ parafin chuyển sang màu vàng Không đổi (N) hai ống có màu xanh xanh lơ Phản ứng Decarboxylase (Arginine, Lysine, Ornithine) Các bước thực hiện: Pha môi trường Decarboxylase (công thức nhãn) + 0.5% yeast extract Thêm 1% amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) cho phản ứng Môi trường làm đối chứng khơng có amino acid Cho 3ml mơi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm sau phủ lên ống 0.5ml parafin tiệt trùng, để tủ ấm 280C Đọc kết từ - ngày Phản ứng (+) ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu ống đối chứng ngược lại phản ứng ( - ) Khả sử dụng Citrate Pha môi trường Simmon’s Citrate agar (công thức pha chế nhãn) Đun sôi khuấy cho tan Cho khoảng 6ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng ống nghiệm để nguội Cấy vi khuẩn bề mặt nghiêng ống nghiệm Ủ 280C Sau - ngày, vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ môi trường Simmon’s Citrate agar cho kết (+) ngược lại cho phản ứng ( - ) Khả sinh H2S Các bước thực hiện: Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất) Đun khuấy cho tan hoàn toàn Trang 30 Tiệt trùng 1210C 15 phút Để nguội 450C Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm Để nghiêng ống nghiệm tạo mặt phẳng nghiêng Cấy vi khuẩn bề mặt nghiêng mặt đứng ống nghiệm Ủ 280C Đọc kết sau 14 - 28 Vi khuẩn lên men đường Glucose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Glucose Lactose Sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Lactose Sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)) Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose Sucrose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)) Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen ống nghiệm Khả sử dụng Urea Các bước thực hiện: Pha 0.1% Pepton + 0.2% KH2PO4 + 0.0012% Phenol Red + 0.1% Glucose Thêm 2% ure cho phản ứng Môi trường làm đối chứng khơng có urea Cho khoảng 3ml mơi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C Đọc kết vòng ngày Phản ứng (+) ống nghiệm có urea chuyển sang màu hồng Khả sinh Indole Các bước thực hiện: Cho khoảng 3ml môi trường Nutrient broth vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C Sau 48 nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole cho phản ứng (+) với vòng màu hồng đến đỏ sậm bề mặt môi trường ngược lại Phản ứng Voges - Proskauer (VP) Các bước thực hiện: Cho khoảng 3ml môi trường MR – VP broth vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút, để nguội Thuốc thử: A : Hòa tan 5g alpha naphthol 100ml ethyl alcohol Trang 31 B: Hòa tan 40g KOH 100ml nước cất Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 280C Sau 48 nhỏ 0.6ml thuốc thử A 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm, lắc để nghiêng ống nghiệm 30 phút Kết quả: Sự chuyển màu hồng môi trường cho phản ứng (+) ngược lại Khả sử dụng nguồn cacbohydrate Các bước thực hiện: Môi trường Nutrient broth (công thức pha chế nhãn) + 0.4% Bromothymol blue (1.6%) Thêm 1% đường (glucose, arabinose, cellobiose…) Chỉnh pH = 6.8 Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 280C Đọc kết vịng - ngày Nếu mơi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) ngược lại β - galactosidase Cho vi khuẩn vào môi trường NB, thêm vào 0.2ml 1.5% NaCl Ủ qua đêm Sau 48 cho đĩa ONPG vào, giữ 20 phút đọc kết quả: dương tính cho màu vàng vịng giờ, ngược lại âm tính Thuỷ phân amylase (Khả thủy phân Starch) Môi trường NA (xem công thức pha chế nhãn) + 0.5% starch Thanh trùng 121oC 15 phút Để nguội khoảng 45oC, đổ môi trường đĩa petri Thuốc thử Lugol's Iodine: 5g Iodine, 10g KI 100 ml nước cất - Cách pha: hòa tan KI Iodine 10ml nước cất thêm tiếp cho đủ 100ml nước cất Cấy vi khuẩn đĩa petri ủ 28oC Sau 48 nhỏ thuốc thử Lugol's Iodine bề mặt khuẩn lạc Trong vòng 30 phút, xuất vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho kết (+), ngược lại ( - ) Khả sinh gas từ glucose Môi trường Nutrient broth (công thức pha chế nhãn) + 0.4% Bromothymol blue (1.6%) Chuẩn độ pH 6.8 Thanh trùng 121oC 15 phút Để nguội cho thêm 1% đường glucose vào Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm tiệt trùng có chứa sẵn chng tiệt trùng Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 28oC Trang 32 Đọc kết vòng - ngày Nếu môi trường chuyển sang màu vàng chuông lên mặt môi trường cho phản ứng (+) ngược lại ( - ) Kháng với hợp chất O/129 Sử dụng môi trường Muller Hinton Agar (MHA), giấy tẩm O/129 ống nghiệm chứa 5ml 0.9% NaCl tiệt trùng Dùng que cấy tiệt trùng nhặt vi khuẩn ròng cho vào ống nghiệm chứa 5ml 0.9% NaCl tiệt trùng lắc So sánh màu dung dịch vi khuẩn với ống Mc Farland 0.5 Dùng pipet tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho lên đĩa MHA Nghiêng nhẹ để trãi dung dịch vi khuẩn khắp bề mặt agar hút bỏ phần dung dịch thừa Dùng kẹp đặt giấy tẩm O/129 lên mặt đĩa agar Để đĩa tủ ấm 28oC Đọc kết sau 24 Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên vịng trịn vơ trùng ≥ 15mm xung quanh đĩa tẩm O/129 Trang 33 PHỤ LỤC Bảng kết thu mẫu phân tích mẫu Địa điểm Đồng Tháp Kí hiệu ao Tên hộ ni Bệnh MX2 Nguyễn Văn Hải Mủ gan MX3 Nguyễn Văn Hải Mủ gan MX4 Nguyễn Văn Hải Mủ gan MX5 Nguyễn Văn Hải Mủ gan MX13 Nguyễn Văn Hải Mủ gan TT1 Nguyễn Văn Thuận Mủ gan Dấu hiệu bệnh lý Xuất huyết nhẹ da, vây Gan, thận trước, thận sau, tỳ tạng có đốm trắng li ti Xuất huyết da, vây hậu môn Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm mủ trắng nhỏ Xuất huyết nhẹ da,vây hậu mơn Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm mủ trắng nhỏ Bóng trương to Xuất huyết nhẹ da, vây nắp mang Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm mủ trắng nhỏ Bóng trương to Bị ăn mòn vây, lồi xương Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm mủ trắng nhỏ Gan có màu nhạt ên ngồi bình thường Xoang bụng có dịch vàng, gan màu không đồng Gan, thận, có nhiều đốm mủ trắng Trang 34 Tổng Số mẫu số bệnh mẫu (con/ao) thu 6 6 6 TT2 Mủ gan SĐ1 Đặng Minh Quang Mủ gan SĐ2 Phan Văn Điền Xuất huyết 10 SĐ3 Nguyễn Văn Huệ Mủ gan CA1 Huỳnh Văn Khuê Xuất huyết CA2 Vĩnh Long Nguyễn Trí Uyên Phạm Minh Tiến Mủ gan CA3 Trần Hỷ Ngàn Mủ gan CA4 Phạm Văn Tú Mủ gan Xuất huyết nắp mang, vây phù mắt Gan nhạt màu có đốm mủ trắng thận Dấu hiệu bên ngồi bình thường Gan tái nhạt, thận trước bị nhũn, tỳ tạng có đốm trắng Xoang bụng có dịch màu hồng Sưng hầu, phù mắt Xuất huyết nội quan Xoang bụng có chứa chất dịch màu hồng Bị ăn mịn đi, mang tái nhạt Gan, thận nhạt màu Gan có màu vàng, dịch xoang bụng có mùi Thành bụng xuất huyết Dấu hiệu bên ngồi bình thường Gan, thận có đốm mủ trắng Gan màu không đồng Mang, vây trắng nhạt Gan màu khơng đồng Thận có đốm mủ trắng Gan có màu vàng có đốm mủ trắng Bóng trương to Thận bị nhũn Trang 35 6 6 6 6 CS2 Cần Thơ Nguyễn Thị Hoà Xuất huyết TN1 Lê Thành Nhân Xuất huyết TN2 Lê Thành Nhân Xuất huyết Cơ bị loét, vây trắng nhạt xuất huyết Xuất huyết mặt thành bụng, nội quan Xoang bụng chứa chất dịch có mùi Phù mắt, xuất huyết hầu, xuất huyết vi Xuất huyết bụng Gan có màu vàng Xuất huyết vi, hậu môn, hầu Xuất huyết thành bụng nội quan Xoang bụng chứa chất dịch có màu vàng mùi Trang 36 4 6 PHỤ LỤC Bảng chủng vi khuẩn Aeromonas phân lập từ bệnh phẩm Địa điểm Đồng Tháp Vĩnh Long Kí hiệu ao SĐ2 CA1 CS2 Tên hộ nuôi Phan Văn Điền Huỳnh Văn Khuê Nguyễn Thị Hoà Bệnh Xuất huyết Xuất huyết Xuất huyết TN1 Lê Thành Nhân Xuất huyết TN2 Lê Thành Nhân Xuất huyết Cần Thơ Trang 37 Dấu hiệu bệnh lý Sưng hầu, phù mắt Xuất huyết nội quan Xoang bụng có chứa chất dịch màu hồng Gan có màu vàng, dịch xoang bụng có mùi Thành bụng xuất huyết Cơ bị loét, vây trắng nhạt xuất huyết Xuất huyết mặt thành bụng, nội quan Xoang bụng chứa chất dịch có mùi Phù mắt, xuất huyết hầu, xuất huyết vi Xuất huyết bụng Gan có màu vàng Chủng vi khuẩn SĐ2.1G SĐ2.1T SĐ 2.2G SĐ2.2T CA1.2G CA1.2T CA1.3G CA1.3TT CS2.1T CS2.1TT CS2.2T CS2.2TT CS2.3G CS2.3T TN1.1G TN1.1T TN1.1TT TN1.2T TN1.2G TN2.1G TN2.1T Xuất huyết vi, hậu TN2.1TT môn, hầu Xuất TN2.3G huyết thành bụng TN2.3T nội quan Xoang TN2.3TT bụng chứa chất dịch TN2.4G có màu vàng mùi TN2.4T TN2.4TT ... THANH PHÚ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC... loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas A hydrophila xem loài gây bệnh cho cá nước quan trọng (Lewis and Plumb, 1979) Đề tài ? ?Phân lập định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra. .. dung: (1) Thu mẫu phân lập vi khuẩn A hydrophila từ cá tra bị bệnh xuất huyết; (2) Xác định tiêu sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập từ cá tra bệnh xuất huyết phương pháp sinh