Phân lập, tuyển chọn và khảo nghiệm các dòng vi khuẩn Azospirillum nội sinh trên sinh trưởng và năng suất của lúa cao sản trồng trên đất phù sa ngọt tại tỉnh An Giang (tóm tắt)

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Lúa (Oryza sativa L.) là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho hơn 40% dân số thế giới, điều này làm cho cây lúa trở thành một trong những cây lương thực quan trọng nhất được sản xuất hàng năm (Hossain và Fischer, 1995). Theo Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế – IRRI (2013), tổng diện tích trồng lúa trên toàn thế giới trong năm 2013 là khoảng 220,86 triệu ha với sản lượng khoảng 705,38 triệu tấn (http://www.irri.org). Tỉnh An Giang có tổng diện tích đất tự nhiên là 353.551 ha, trong đó diện tích đất trồng lúa là 264.284,61 ha chiếm 74,75% tổng điện tích, năng suất lúa trung bình khoảng 5,5-6,0 tấn/ha. Các giống lúa cho năng suất cao được nông dân trồng phổ biến tại An Giang là OM 6976, OM 4218, OM 2514, OM 2517, OM 2718, OM 3393, OM 4655, OM 1490, OM 4926,…(http://www.angiang.gov.vn). Để đạt năng suất cao trong mùa vụ, nông dân thường có thói quen sử dụng lượng phân đạm vô cơ rất cao để bón cho cây lúa (100kgN/ha) Mục tiêu của Luận án: - Phân lập các dòng Azospirillum từ lúa hoang và lúa cao sản trồng tại tỉnh An Giang. - Xác định đặc tính hình thái và định danh các dòng Azospirillum bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. - Tuyển chọn các dòng Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở điều kiện phòng thí nghiệm. 1 - Trắc nghiệm độ hữu hiệu của các dòng Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở điều kiện nhà lưới. - Trắc nghiệm độ hữu hiệu của các dòng Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở điều kiện đồng ruộng tại tỉnh An Giang. Điểm mới của Luận án: - Kết quả của Luận án cho thấy vi khuẩn cố định đạm sinh học Azospirillum hiện diện ở các mẫu lúa hoang và lúa cao sản trồng tại tỉnh An Giang. - Có 60 dòng vi khuẩn Azospirillum bản địa được phân lập từ lúa hoang và lúa cao sản trồng tại tỉnh An Giang. - Nhận diện và định danh được 04/60 dòng vi khuẩn, 02 dòng vi khuẩn Azospirillum sp. 6T1 và Azospirillum sp. T7 thuộc loài Azospirillum lipoferum và 02 dòng vi khuẩn Azospirillum sp. 25HR và Azospirillum sp. 7R thuộc loài Azospirillum brasilense có khả năng cố định đạm sinh học cho lúa cao sản trồng tại tỉnh An Giang. - Xác định được độ hữu hiệu của 04 dòng Azospirillum sp. 6T1 và Azospirillum sp. T7, Azospirillum sp. 7R và Azospirillum sp. 25HR trên lúa cao sản OM 6976 và OM 4218 trồng ở điều kiện nhà lưới tại tỉnh An Giang. - Khi chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum sp. 6T1 và Azospirillum sp. 25HR cho lúa cao sản OM 6976 và OM 4218 đã giúp lúa gia tăng năng suất khi trồng ở đồng ruộng tại tỉnh An Giang. 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU An Giang là tỉnh thuần về nông nghiệp thuộc khu vực Đồng bằng sông Cửu Long với chủ lực là cây lúa và thủy sản. An Giang có tổng diện tích đất tự nhiên trong toàn tỉnh là 353.675,89 ha, trong đó tổng diện tích đất nông, lâm nghiệp và thủy sản khoảng 297.872,11 ha. Đất sản xuất nông nghiệp chiếm khoảng 279.966,24 ha, trong đó đất chuyên canh trồng lúa là 262.286,21 ha chiếm tỷ lệ 88,05% (http://www.angiang.gov.vn). 2.1 Phân loại vi khuẩn Azospirillum Vi khuẩn Azospirillum spp. được phân loại như sau: Lớp (Class): Alphaproteobacteria. Bộ (Ordo): Rhodospirillales. Họ (Familia): Rhodospirillaceae. Chi (Genus):.Azospirillum. Loài (Species): A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A. halopraeferens, A. irakense, A. largomobile, A. doebereinerae, A. canadense, A. oryzae, A. melinis, A. zeae, A. rugosum, A. picis, A. thiophilum và A. formosense, A. fermentarium, A. humicireducens (Brenner et al., 2005). Vi khuẩn Azospirillum (A) có hình que thẳng hay hơi cong, Gram âm, kích thước tế bào rộng 0,6-1,7µm và dài 2,1-3,8µm, sống tự do trong đất hay nội sinh với rễ, thân, lá và hạt một số loại ngũ cốc, rau, trái cây, cây có củ, có thể chuyển động trong môi trường lỏng nhờ có một chiên mao ở đầu tế bào. Azospirillum có khả năng cố định đạm 3 trong môi trường không có chứa đạm ở điều kiện vi hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu để Azospirillum phát triển từ 33-41 o C và pH từ 5,5-7,5. Đặc biệt, là chúng phát triển tốt trong môi trường có muối của các acid hữu cơ như malate, succinate, lactate,… Cho đến nay, có 17 loài Azospirillum đã được tìm thấy và định danh. 2.2 Những nghiên cứu về Azospirillum trên thế giới và Việt Nam Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện được các nhóm Azospirillum có khả năng cố định đạm cho lúa và giúp gia tăng năng suất từ 15-54%. Một số nước trên thế giới đã sử dụng phân bón của Azospirillum: Ai Cập, Ấn Độ, Israel, Ý, Brazin, Mexico, Uruguay, Argentina, Việt Nam,… Ở Ai Cập, khi chủng A. brasilense N040 làm gia tăng sản lượng cho lúa từ 15-20% (Oma et al., 1989). Ở Ấn Độ, khi chủng A. brasilense giúp tăng năng suất 15% so với không chủng (Rao, 1986). Theo Wani (1990), trong 10 năm gần đây khi chủng Azospirillum thì năng suất tăng 60%. Ở Israel, khi chủng A. brasilense Cd với tỉ lệ 1.10 8 CFU/cây hay 1.10 7 CFU/hạt cho bắp, lúa mì, lúa miến, cỏ, hạt ngũ cốc và đậu giúp cây tăng năng suất từ 15-20%. (Okon et al., 1988). Ở Ý, khi chủng Azospirillum đều nhận thấy năng suất gia tăng đáng kể từ 3-54% so với không chủng vi khuẩn (Favilli et al., 1987). Ở Brazin, khi chủng A. brasilense giống Sp-245 và Sp-107 giúp gia tăng trọng lượng khô và nồng độ đạm cho cây trồng (Baldani et al., 1987). 4 Ở Mexico, khi chủng Azospirillum cho lúa mì thì thấy năng suất gia tăng từ 23-63% (năm 1986) và từ 24-43% (năm 1987) (Caballero- Mellado et al., 1992; Paredes-Cardona et al., 1988). Ở Uruguay, khi chủng A. brasilense cd vào hạt lúa miến (1.10 7 cfu/hạt) giusp gia tăng năng suất từ 10-15% (Okon và Labandera- Gonzalez, 1994). Ở Argentina, khi chủng A. brasilense làm tăng năng suất lúa mì 33% so với không chủng vi khuẩn (Barrios et al., 1986). Ở Việt Nam, bước đầu nghiên cứu trên lúa hoang, lúa trồng và một số loại cỏ họ hòa bản ở Đồng bằng sông Cửu Long, người ta đã phân lập và nhận diện được một số dòng A. lipoferum và A. brasilense (Đào Thanh Hoàng, 2005; Nguyễn Khắc Minh Loan, 2005). Tuy nhiên, cho đến nay tại An Giang thì chưa có nghiên cứu nào về tác dụng của Azospirillum trên cây lúa cao sản. 5 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu thí nghiệm Lúa cao sản và lúa hoang được thu hoạch tại các ruộng lúa t11 huyện, thị, thành phố trong tỉnh An Giang. Giống lúa cao sản OM6976 và OM 4218. Các dòng Azospirillum đối chứng dương A. brasilense và A. lipoferum do Đại học Florence, Ý cung cấp. 3.2 Phân lập, khảo sát đặc tính hình thái và định danh Azospirillum Các mẫu lúa cao sản và lúa hoang được phân lập theo mô tả của Stoltzfus et al. (1997). Khảo sát đặc tính khẩn lạc, tế bào, chuyển động, kích thước tế bào và định danh bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi chuyên biệt của A. brasilense và A. lipoferum. 3.3 Tuyển chọn Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở điều kiện phòng thí nghiệm Trồng lúa cao sản và tưới bằng dung dịch trồng cây không đạm. Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức (NT), 4 lần lặp lại. Sau 5 tuần, thu hoạch lúa và phân tích các chỉ tiêu nông học. - NT1: Đối chứng (không chủng Azospirillum và không bón N). - NT2: Chủng Azospirillum 1 và không bón N. - NT3: Chủng Azospirillum 2 và không bón N. - NT4: Chủng Azospirillum 3 và không bón N. - NT5: Chủng Azospirillum 4 và không bón N. - NT6: Chủng Azospirillum 5 và không bón N. 6 3.4 Trắc nghiệm độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa cao sản trồng trong nhà lưới Đất trồng lúa được lấy từ các ruộng lúa tại huyện Châu Phú, tỉnh An Giang và sử dụng giống lúa cao sản OM 6976 và OM4218. Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức (NT), 4 lần lặp lại. Thu hoạch lúa và phân tích các chỉ tiêu nông học. - NT1: Đối chứng (không chủng Azospirillum và không bón N). - NT2: Đối chứng không chủng Azospirillum và bón 20N. - NT3: Đối chứng không chủng Azospirillum và bón 40N. - NT4: Đối chứng không chủng Azospirillum và bón 60N. - NT5: Đối chứng không chủng Azospirillum và bón 120N. - NT6: Chủng Azospirillum 6 và không bón N. - NT7: Chủng Azospirillum 7 và không bón N. - NT8: Chủng Azospirillum 8 và không bón N. - NT9: Chủng Azospirillum 9 và không bón N. 3.5 Trắc nghiệm độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa cao sản trồng ngoài đồng ruộng Giống lúa cao sản: OM 6976 và OM 4218. Địa điểm thí nghiệm tại Ấp Vĩnh Bình, xã Vĩnh Thạnh Trung, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức (NT), 4 lần lặp lại và diện tích mỗi lô thí nghiệm là 50m 2 . Thu hoạch lúa và phân tích các chỉ tiêu nông học. - NT1: Đối chứng (không chủng Azospirillum và không bón N). - NT2: Đối chứng không chủng Azospirillum và bón 100N. - NT3: Chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum và không bón N. - NT4: Chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum và bón 50N. - NT5: Chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum và bón 25N. 7 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập, khảo sát đặc tính hình thái và định danh Azospirillum Vi khuẩn Azospirillum được phân lập theo các bước sau: 5 Lúa cao sản (lúa hoang) 6 ↓ 7 Rửa sạch 8 ↓ 9 Cắt nhỏ 2-3 cm 10 ↓ 11 Khử trùng 12 [Clorox 30% (10 phút), cồn 80% (5 phút) 13 và H 2 O 2 8% (3 phút)] 14 ↓ 15 Rửa nước cất khử trùng (6 lần) 16 ↓ 17 Nghiền mịn trong 1mL nước cất khử trùng 18 ↓ 19 Chuyển 10-20μL dịch trích vào ống nghiệm 20 (chứa NFb bán đặc, không đạm) 21 ↓ 22 Ủ 30 o C (1-3 ngày) 23 ↓ 24 Cấy chuyển 5-10μL vào đĩa petri (chứa NFb đặc, không đạm) 25 ↓ 26 Tách ròng 27 ↓ 28 Trữ mẫu và danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Hình 4.1. Quy trình phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa 8 Các dòng Azospirillum khi phát triển tạo lớp màng mỏng trắng đục cách bề mặt môi trường 3-6mm. Khuẩn lạc có dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi cao; tròn, bìa nguyên, độ nổi lài; tròn, bìa nguyên, nhầy, độ nổi cao; tròn, bìa nguyên, nhầy, độ nổi lài, có màu trắng hay vàng nhạt. Đường kính khuẩn lạc biến thiên từ 0,60-2,10mm, đường kính trung bình 1,11mm. Tế bào có dạng hình que ngắn, Gram âm và chuyển động được (Hình 4.2). Hình 4.2: Khuẩn lạc Azospirillum dòng 15T1 (B) được phân lập từ thân lúa OM 4218, dòng 4R (C) từ rễ lúa OM 4218 và được nuôi cấy trên môi trường NFb đặc (A) làm môi trường thay đổi màu từ xanh lá sang xanh (B và C). Kết quả định danh cho thấy 02 dòng Azospirillum sp. 6T1 và Azospirillum sp. T7 thuộc loài A. lipoferum; 02 dòng Azospirillum sp. 25HR và Azospirillum sp. 7R thuộc loài A. brasilene. Những dòng còn lại không thuộc 02 loài A. lipoferum và A. brasilense (Hình 4.3 và Hình 4.4). Chú thích: Giếng 5: Thang chuẩn 100bp. Giếng 4: Đối chứng dương A. lipoferum. Giếng 3: Đối chứng âm. Giếng 2: Dòng 6T1. Giếng 1: Dòng T7. Hình 4.3: Phổ diện điện di các dòng vi khuẩn Azospirillum bằng cặp mồi chuyên biệt A. lipoferum 9 Khuẩn lạc Azospirillum Khuẩn lạc Azospirillum 400bp 1 2 3 4 5 Chú thích: Giếng 1: Đối chứng âm. Giếng 2: Đối chứng dương A. brasilene. Giếng 3 và 12: Dòng H1R10. Giếng 4 và 13: Dòng 25HR. Giếng 5 và 14: Dòng H1T10. Giếng 6 và 15: Dòng 7R. Giếng 7 và 16: Dòng 4R. Giếng 8 và 17: Dòng 30T. Giếng 9: Dòng CT10. Giếng 10: Thang chuẩn 100bp. Giếng 11: Đối chứng dương A. lipoferum. Hình 4.4: Phổ diện điện di các dòng Azospirillum bằng cặp mồi chuyên biệt A. brasilense. 4.2 Tuyển chọn Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở điều kiện phòng thí nghiệm a) Chiều cao cây: Cây chủng Azospirillum sp. 7R và không bón N có chiều cao cây khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (20,65cm). Cây chủng Azospirillum sp. H1R8 và không bón đạm có chiều cao cây khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (20,65cm). Mặt khác, ở những cây còn lại, khi được chủng Azospirillum sp. 25HR, 6T1, 7R và T7 đều có chiều cao cây (24,5cm, 25,775cm, 22,075cm và 23,8cm) cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. b) Chiều dài rễ: Ở cây chủng Azospirillum sp. 6T1 và không bón N có chiều dài rễ dài nhất (10,9cm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (5,45cm). Cây chủng Azospirillum sp. 25HR và không bón N có chiều dài rễ ngắn nhất (8,275cm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 10 650bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 17 [...]... Qua phân tích các kết quả thí nghiệm phân lập và định danh vi khuẩn Azospirillum, thí nghiệm trồng lúa cao sản trong phòng thí nghiệm, thí nghiệm trồng lúa cao sản OM 6976, OM 4218 trong nhà lưới, thí nghiệm trồng lúa cao sản OM 6976, OM 4218 trồng lúa ngoài đồng ruộng cho thấy vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ lúa cao sản tại các vùng sinh thái khác nhau trong tỉnh An Giang và dùng kết hợp các dòng. .. được xác định trên lúa cao sản OM 6976 (55,43%, 36,11%, 146,41 và 156,17) và trên lúa cao sản OM 4218 (83,5%, 90,6%, 92,9% và 91,3%) trồng ở điều kiện nhà lưới tại tỉnh An Giang - Chủng kết hợp 02 dòng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1 và Azospirillum sp 25HR cho lúa cao sản OM 6976 và OM 4218 đã giúp lúa gia tăng năng suất (55,0-55,2% và 55,5-55,7%) khi trồng ở đồng ruộng tại tỉnh An Giang DANH MỤC CÔNG... BỐ CỦA TÁC GIẢ 1 Nguyễn Hữu Hiệp và Đào Thanh Hoàng, 2013 Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm trên lúa cao sản OM 6976 được trồng ở huyện Châu Phú, tỉnh An Giang Hội nghị Công nghệ sinh học Toàn quốc 2013 tại Hà Nội Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, quyển 2: 205-208 2 Đào Thanh Hoàng và Nguyễn Hữu Hiệp, 2013 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở nhà lưới tại. .. mươi dòng vi khuẩn được phân lập từ cây lúa hoang và lúa cao sản trồng tại An Giang - Các dòng Azospirillum này có những đặc tính giống các vi khuẩn Azospirillum đã được các tác giả trước đây mô tả Khuẩn lạc có dạng tròn, nhầy (hay ít nhầy), bìa nguyên, độ nổi lài (hay cao) , màu trắng hay vàng nhạt, Gram âm, đường kính trung bình của các khuẩn lạc là 1,11mm Tế bào các vi khuẩn có hình que ngắn và có... huyện Châu Phú, tỉnh An Giang Hội nghị Công nghệ sinh học Toàn quốc 2013 tại Hà Nội Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, quyển 2: 237-241 3 Đào Thanh Hoàng và Nguyễn Hữu Hiệp, 2013 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Azospirillum trên giống lúa OM 4218 trồng trong 24 nhà lưới tại huyện Châu Phú, tỉnh An Giang Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 29b(2013): 1-8 4 Đào Thanh Hoàng và Nguyễn Hữu... Azospirillum sp 7R và không bón N 0,592 4 Chủng Azospirillum sp 6T1 và không bón N 0,856 5 Chủng Azospirillum sp H1R8 và không bón N 0,530 6 Chủng Azospirillum sp T7 và không bón N 0,532 4.3 Độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa cao sản OM 6976 và OM4218 trồng trong nhà lưới 4.3.1 Độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa cao sản OM 6976 a) Chiều cao cây lúa lúc thu hoạch: Ở cây chủng một trong bốn dòng Azospirillum. .. dòng vi khuẩn Azospirillum bản địa này (Azospirillum sp 6T1 và Azospirillum sp 25HR) để chủng lại cho lúa nhận thấy vi khuẩn Azospirillum đã cố định đạm sinh học cho lúa và giúp lúa gia tăng năng suất so với phương pháp canh tác truyền thống không chủng vi khuẩn Azospirillum và bón lượng phân đạm hóa học rất cao (100kgN/ha) nhằm hướng đến sản xuất nông nghiệp theo hướng hạn chế ô nhiễm môi trường và. .. có khả năng chuyển động, chiều dài trung bình của các tế bào là 1,06µm, chiều rộng trung bình là 0,65µm - Có 04/60 dòng vi khuẩn đã được nhận diện và định danh là Azospirillum sp 6T1 và Azospirillum sp T7 thuộc loài A lipoferum và Azospirillum sp 25HR và Azospirillum sp 7R thuộc loài A brasilene 23 - Độ hữu hiệu của 04 dòng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp T7, Azospirillum sp 7R và Azospirillum. .. 02 dòng Azospirillum cho lúa cao sản OM 6976 đã giúp cây gia tăng năng suất từ 55,0-55,2% (Bảng 4.10) Bảng 4.10: Năng suất lúa lúc thu hoạch (tấn/ha) TT Nghiệm thức Năng suất 1 Đối chứng (không chủng Azospirillum và không bón N) 4,13a 2 Bón phân đạm theo cách của nông dân sử dụng (100N) 6,37b 3 Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 25HR và không bón N 6,41b 4 Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 25HR và. .. trên lúa cao sản OM 6976 và OM 4218 trồng ngoài đồng ruộng 4.4.1Độ hữu hiệu của Azospirillum trên lúa cao sản OM 6976 a) Chiều cao cây: Lúa chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 25HR và không bón N hoặc bón 25N có chiều cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với cây đối chứng Ở cây không chủng Azospirillum và bón 100N có chiều cao lớn nhất trong các cây (Bảng 4.8) Chủng 02 dòng Azospirillum đã giúp lúa gia . và lúa cao sản trồng tại tỉnh An Giang. - Có 60 dòng vi khuẩn Azospirillum bản địa được phân lập từ lúa hoang và lúa cao sản trồng tại tỉnh An Giang. - Nhận diện và định danh được 04/60 dòng. hoang và lúa cao sản trồng tại tỉnh An Giang. - Xác định đặc tính hình thái và định danh các dòng Azospirillum bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. - Tuyển chọn các dòng Azospirillum trên lúa cao. Azospirillum trên lúa cao sản trồng ở điều kiện đồng ruộng tại tỉnh An Giang. Điểm mới của Luận án: - Kết quả của Luận án cho thấy vi khuẩn cố định đạm sinh học Azospirillum hiện diện ở các mẫu lúa hoang