phân lập các dõng vi khuẩn sống nội sinh trong cây xuyên tâm liên (andrographis paniculata nees) mọc hoang ở tỉnh an giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP CÁC DÕNG VI KHUẨN SỐNG NỘI SINH TRONG CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata Nees) MỌC HOANG Ở TỈNH AN GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN THỦY TIÊN MSSV: 1097158 LỚP: CÔNG NGHỆ SINH HỌC K35 Cần Thơ, tháng 05/2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP CÁC DÕNG VI KHUẨN SỐNG NỘI SINH TRONG CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata Nees) MỌC HOANG Ở TỈNH AN GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN THỦY TIÊN MSSV: 1097158 LỚP: CÔNG NGHỆ SINH HỌC K35 Cần Thơ, tháng 05/2015 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Thủy Tiên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, nhận nhiều quan tâm từ gia đình, hướng dẫn dạy tận tình quý Thầy, Cô giúp đỡ nhiệt tình bạn Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực thí nghiệm hoàn thành luận văn Cán quản lý phòng thí nghiệm vi sinh vật giúp đỡ, động viên chia sẻ khó khăn giúp hoàn thành tốt luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến ba mẹ ủng hộ phương diện, sức mạnh tinh thần giúp vươn lên sống Xin kính chúc quý Thầy, Cô bạn sinh viên dồi sức khỏe thành công Cần Thơ, ngày 10 tháng 05 năm 2015 Nguyễn Thủy Tiên Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đai Học Cần Thơ TÓM TẮT Từ xưa thuốc kháng sinh sử dụng để điều trị bệnh vi khuẩn gây bệnh người Tuy nhiên, chất kháng sinh tổng hợp sử dụng thường gặp trở ngại tính kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh Nhưng nhiều dược liệu lại không gặp phải bất lợi Xuyên tâm liên có tính kháng khuẩn Vì vậy, việc phân lập dòng vi khuẩn nội sinh Xuyên tâm liên thực nhằm tìm số dòng vi khuẩn có tính kháng khuẩn góp phần thay kháng sinh tổng hợp Kết có mười tám dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ phận rễ, thân Xuyên tâm liên Đa số dòng vi khuẩn có dạng hình que, gram âm có khả chuyển động Chúng có khả cố định đạm, tổng hợp IAA có khả hòa tan lân khó tan Dòng TR7 dòng tổng hợp lượng ammonium cao (1,37 μg/ml) Lượng IAA tổng hợp nhiều 83,73 μg/ml dòng TR1 tổng hợp Có mười dòng có khả hòa tan lân, dòng có hiệu tốt TT4 (47,62%), TR2 (60,19%) TT2 (94,44%) Kết khảo sát khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn Escherichia coli, Aeromonas hydrophila Staphylococcus aureus cho thấy có dòng có khả kháng Escherichia coli, dòng có tính kháng Aeromonas hydrophila dòng có khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus Trong có dòng có khả kháng hai dòng vi khuẩn Escherichia coli Aeromonas hydrophila, dòng có khả kháng hai dòng vi khuẩn Escherichia coli Staphylococcus aureus Hai dòng vi khuẩn TR1 TL3 nhận diện Enterobacter ludwigii dòng CSR19B với tỷ lệ tương đồng 96% Kosakonia radicincitans dòng DSM 16656 với tỷ lệ tương đồng 95% Từ khóa: Enterobacter ludwigii, kháng khuẩn, Kosakonia radicincitans, vi khuẩn nội sinh, Xuyên tâm liên Ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đai Học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Tỉnh An Giang 2.2 Giới thiệu Xuyên Tâm Liên 2.3 Tác dụng Xuyên tâm liên y học 2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh 2.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣờng gặp 2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas 2.5.2 Vi khuẩn Bacillus 2.5.3 Vi khuẩn Enterobacter 12 2.6 Một số đặc tính vi khuẩn nội sinh 13 2.6.1 Phân hủy sinh học 13 2.6.2 Khả cố định đạm 14 2.6.3 Khả hòa tan lân khó tan 14 2.6.4 Khả tổng hợp Auxin Indole-3-acetic acid (IAA) 15 2.6.5 Đối kháng sinh học 16 2.6.6 Sản phẩm từ vi khuẩn nội sinh 16 2.7 Một số vi khuẩn gây bệnh sử dụng nghiên cứu 16 2.7.1 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 16 2.7.2 Vi khuẩn Escherichia coli 18 Ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 2.7.3 Trường Đai Học Cần Thơ Vi khuẩn Staphylococcus aureus 18 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 21 3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực 21 3.1.2 Dụng cụ - thiết bị 21 3.1.3 Vật liệu 21 3.1.4 Hóa chất 22 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.2.1 Phương pháp xử lý mẫu phân lập dòng vi khuẩn nội sinh 23 3.2.2 Quan sát hình dạng khả chuyển động vi khuẩn 25 3.2.3 Đo kích thước tế bào vi khuẩn 26 3.2.4 Nhuộm Gram vi khuẩn 27 3.2.5 Khảo sát khả cố định đạm số dòng vi khuẩn phân lập 28 3.2.6 Khảo sát khả tổng hợp IAA số dòng vi khuẩn phân lập 30 3.2.7 Đánh giá khả hòa tan lân khó tan 31 3.2.8 Thử nghiệm khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn phân lập 31 3.2.9 Nhận diện định danh vài dòng vi khuẩn tiêu biểu 32 3.3 Xử lý thống kê 35 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết phân lập đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn 36 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn 36 4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc 37 4.1.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn 39 4.2 Kết khảo sát khả hòa tan lân khó tan dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 41 4.3 Kết khảo sát khả tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) dòng vi khuẩn đƣợc phân lập 44 4.3.1 So sánh khả tổng hợp IAA dòng vi khuẩn phân lập từ rễ (nhóm 1) 45 Ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 4.3.2 Trường Đai Học Cần Thơ So sánh khả tổng hợp IAA dòng vi khuẩn phân lập từ thân (nhóm 2) 46 4.3.3 4.4 Nhận xét 47 Kết khảo sát khả cố định đạm dòng vi khuẩn đƣợc phân lập 48 4.4.1 So sánh khả cố định đạm dòng vi khuẩn phân lập từ rễ (nhóm 1) 50 4.4.2 So sánh khả cố định đạm dòng vi khuẩn phân lập từ thân (nhóm 2) 51 4.4.3 4.5 Nhận xét 52 Khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 53 4.5.1 Khả kháng vi khuẩn Escherichia coli 54 4.5.2 Khả kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila 55 4.5.3 Khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 57 4.5.4 Nhận xét 58 4.6 Kết nhận diện số dòng vi khuẩn kỹ thuật PCR 59 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 5.1 Kết luận 62 5.2 Đề nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC Ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đai Học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng Công thức môi trường PDA 21 Bảng Môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) 22 Bảng Thành phần môi trường Nfb (Krieg el al., 1984) 22 Bảng Thành phần chất phản ứng PCR 32 Bảng Kết phân lập dòng vi khuẩn nội sinh Xuyên tâm liên 36 Bảng Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập môi trường PDA 38 Bảng Đặc tính vi khuẩn phân lập môt trường PDA 39 Bảng Hiệu hòa tan lân (%) dòng vi khuẩn nội sinh Xuyên tâm liên hủng môi trường NBRIP đặc 41 Bảng Lượng IAA (μg/ml) dòng vi khuẩn rễ 44 Bảng 10 Khả tạo ammonium (μg/ml) dòng vi khuẩn rễ 50 Bảng 11 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn E coli 54 Bảng 12 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn A hydrophila 55 Bảng 13 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 56 Bảng 14 Kết nhận diện dòng vi khuẩn triển vọng phân lập từ Xuyên tâm liên 59 Bảng 15 Hiệu suất hòa tan lân dòng vi khuẩn phân lập tổng hợp Bảng 16 Đường chuẩn hàm lượng IAA Bảng 17 Hàm lượng IAA dòng vi khuẩn phân lập tổng hợp Bảng 18 Hàm lượng IAA (µg/ml) dòng vi khuẩn phân lập từ thân Bảng 19 Đường chuẩn hàm lượng NH4+ Bảng 20 Hàm ượng ammonium (μg/ml) dòng vi khuẩn phân lập tổng hợp Bảng 21 Khả tạo ammonium (μg/ml) dòng vi khuẩn phân lập thân Bảng 22 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn E coli Bảng 23 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila Bảng 24 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus Ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đai Học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình Xuyên Tâm Liên (Adrographis paniculata Nees) Hình Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Hình Vi khuẩn Bacillus subtilis dòng 168 10 Hình Vi khuẩn Staphylococcus aureus 20 Hình Vòng pellicle tạo sau 48h ủ phận rễ, thân, 24 Hình Dung dịch xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ 28 Hình Dung dịch xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA 30 Hình Vi khuẩn phát triển tạo thành vòng pellicle môi trường Nfb 35 Hình Một số khuẩn lạc vi khuẩn phân lập môi trường PDA 37 Hình 10 Vi khuẩn Gram âm (TT4) vi khuẩn Gram dương (TT2) 40 Hình 11 Vòng halo dòng vi khuẩn tạo chủng vào môi trường NBRIP đặc 41 Hình12 Hàm lượng IAA (μg/ml) dòng vi khuẩn nội sinh tổng hợp qua ngày 2, 4, sau chủng 43 Hình 13 Lượng IAA dòng vi khuẩn thân tạo 46 Hình 14 Hàm lượng ammonium (μg/ml) dòng vi khuẩn nội sinh tổng hợp qua ngày 2, 4, sau chủng 49 Hình 15 Lượng ammonium (μg/ml) dòng vi khuẩn phân lập từ thân tổng hợp 52 Hình 16 Các dòng vi khuẩn TR1, TL2 tạo vòng sáng quanh khuẩn lạc sau ủ ngày 55 Ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 TR4 TR3 TT4 TR9 TL1 TR8 TT3 TT5 TL2 TR5 TL3 TT1 TR7 TR6 TT2 3 3 3 3 3 3 3 Trường Đại Học Cần Thơ 0.234 0.235333 0.249667 0.251 0.260333 0.262667 0.283667 0.289333 0.306333 0.334 0.354 0.368667 0.803667 0.831333 1.18467 KJ KJ JI JI I IH HG GF F E ED D C B A 3.2.3 Kết khảo sát hàm lượng ammonium tạo dòng vi khuẩn phân lập theo phận Xuyên tâm liên 3.2.3.1 Hàm lượng ammonium tổng hợp từ dòng vi khuẩn phân lập từ rễ  Ngày ANOVA Table for Ham luong Dam by Dong Vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 5.41456 0.0186607 5.43322 Df 18 26 Mean Square F-Ratio 0.67682 652.86 0.0010367 P-Value 0.0000 CV = 5,452% Multiple Range Tests for Ham luong Dam by Dong Vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong Vi khuan TR1 TR2 TR8 TR3 TR9 TR5 TR6 TR4 TR7  Count 3 3 3 3 Mean 0.198 0.208667 0.235 0.254667 0.283667 0.526 1.11267 1.125 1.371 Homogeneous Groups F FE FED ED D C B B A Ngày Summary Statistics for Ham luong Dam Dong Vi khuan TR1 TR2 Ngành Công nghệ sinh học Count 3 Average 0.181 0.181333 Standard deviation 0.00556776 0.0023094 Coeff of variation 3.07611% 1.27357% Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 Total 3 3 3 27 Trường Đại Học Cần Thơ 0.200333 0.288 0.231667 0.747333 0.920333 0.332667 0.206333 0.365444 0.00568624 0.011 0.0215948 0.0380175 0.0051316 0.00568624 0.0051316 0.263262 2.83839% 3.81944% 9.32148% 5.08709% 0.557581% 1.70929% 2.48704% 72.039% ANOVA Table for Ham luong Dam by Dong Vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1.79761 0.00437267 1.80198 Df 18 26 Mean Square 0.224702 0.000242926 F-Ratio 924.98 P-Value 0.0000 CV = 4,265% Multiple Range Tests for Ham luong Dam by Dong Vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong Vi khuan TR1 TR2 TR3 TR9 TR5 TR4 TR8 TR6 TR7  Count 3 3 3 3 Mean 0.181 0.181333 0.200333 0.206333 0.231667 0.288 0.332667 0.747333 0.920333 Homogeneous Groups F F F FE E D C B A Ngày Summary Statistics for Ham luong Dam Dong Vi khuan TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 Total Count 3 3 3 3 27 Average 0.204 0.222 0.235333 0.234 0.334 0.831333 0.803667 0.262667 0.251 0.375333 Standard deviation 0.00173205 0.00173205 0.0023094 0.004 0.0305123 0.0241316 0.0316596 0.0057735 0.00556776 0.243874 Coeff of variation 0.849045% 0.780203% 0.981332% 1.7094% 9.13542% 2.90276% 3.9394% 2.19803% 2.21823% 64.9753% ANOVA Table for Ham luong Dam by Dong Vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1.54112 0.00521467 1.54634 Df 18 26 Mean Square 0.19264 0.000289704 F-Ratio 664.96 P-Value 0.0000 CV = 4,535% Ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đại Học Cần Thơ Multiple Range Tests for Ham luong Dam by Dong Vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong Vi khuan TR1 TR2 TR4 TR3 TR9 TR8 TR5 TR7 TR6 Count 3 3 3 3 Mean 0.204 0.222 0.234 0.235333 0.251 0.262667 0.334 0.803667 0.831333 Homogeneous Groups E ED DC DC DC C B A A Hàm lượng ammonium tổng hợp từ dòng vi khuẩn phân lập 3.2.3.2 từ thân Bảng 21 Khả tạo ammonium (μg/ml) dòng vi khuẩn phân lập đƣợc thân Hàm lƣợng ammonium trung bình (µg/ml) Dòng vi khuẩn Ngày 0,269 1,32167 0,227 0,21 0,27 0,193333 0,206333 0,24 0,229333 3,192 TT1 TT2 TT3 TT4 TT5 TT6 TL1 TL2 TL3 CV %  Ngày 0,243667 0,705 0,219667 0,198 0,206333 0,189667 0,201667 0,134333 0,202667 3,675 Ngày 0,368667 1,18467 0,283667 0,249667 0,289333 0,231667 0,260333 0,306333 0,354 1,729 Ngày ANOVA Table for Luong Dam by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 3.19092 0.00227067 3.19319 Df 18 26 Mean Square 0.398865 0.000126148 F-Ratio 3161.88 P-Value 0.0000 CV = 3,192% Multiple Range Tests for Luong Dam by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK TT6 Count Ngành Công nghệ sinh học Mean 0.193333 Homogeneous Groups E Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 TL1 TT4 TT3 TL3 TL2 TT1 TT5 TT2 3 3 3 3  Trường Đại Học Cần Thơ 0.206333 0.21 0.227 0.229333 0.24 0.269 0.27 1.32167 E ED DC C C B B A Ngày ANOVA Table for Luong Dam by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0.701707 0.00158867 0.703296 Df 18 26 Mean Square 0.0877134 0.0000882593 F-Ratio 993.82 P-Value 0.0000 CV = 3,675% Multiple Range Tests for Luong Dam by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK TL2 TT6 TT4 TL1 TL3 TT5 TT3 TT1 TT2  Count 3 3 3 3 Mean 0.134333 0.189667 0.198 0.201667 0.202667 0.206333 0.219667 0.243667 0.705 Homogeneous Groups F E ED ED ED DC C B A Ngày ANOVA Table for Luong Dam by Dong VK Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 2.16968 0.000827333 2.1705 Df 18 26 Mean Square 0.27121 0.000045963 F-Ratio 5900.61 P-Value 0.0000 CV = 1,729% Multiple Range Tests for Luong Dam by Dong VK Method: 95.0 percent LSD Dong VK TT6 TT4 TL1 TT3 TT5 TL2 TL3 Count 3 3 3 Ngành Công nghệ sinh học Mean 0.231667 0.249667 0.260333 0.283667 0.289333 0.306333 0.354 Homogeneous Groups F E E D D D C Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 TT1 TT2 3 Ngành Công nghệ sinh học 0.368667 1.18467 Trường Đại Học Cần Thơ B A Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đại Học Cần Thơ Phụ lục Kết khảo sát khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 4.1 Kết khảo sát khả kháng lại vi khuẩn E coli dòng vi khuẩn nội sinh Xuyên tâm liên a Kết thí nghiệm Bảng 22 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn E coli Dòng TR1 TR4 TR9 TT1 TT3 TL2 d (mm) Ngày D (mm) D-d (mm) d (mm) Ngày D (mm) D-d (mm) d (mm) Ngày D (mm) D-d (mm) 10 11 10 10 10 10 10 9.5 9 8 8 9 14 14 14 17 17 16 12 11 12 12 11,5 11,5 9 9.5 19 19 18 4 7 2 2,5 2,5 2,5 1 1,5 11 10 10 11 10 10 10 10 10 10 9 10 10 14 13 13 18 18 16 12 11 11 12 11 11 9,5 10 19 18 18 1 2 1,5 1 9 10 12 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 10 10 12 14 12 13 13 12 12 12 11 11 12 11 11 9,5 10 12 14 14 2 3 2 1 1 0,5 4 b Kết thống kê  Ngày Summary Statistics for Khang Khuan Ngay Dong Vi Khuan TL2 TR1 TR4 TR9 TT1 TT3 Total Count 3 3 3 18 Average 10.0 3.66667 7.33333 1.66667 2.5 1.16667 4.38889 Standard deviation 1.0 0.57735 0.57735 0.57735 0.288675 3.34557 Coeff of variation 10.0% 15.7459% 7.87296% 34.641% 0% 24.7436% 76.2281% ANOVA Table for Khang Khuan N1 by Dong Vi Khuan Source Sum of Squares Df Ngành Công nghệ sinh học Mean Square F-Ratio P-Value Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Between groups Within groups Total (Corr.) 186.111 4.16667 190.278 Trường Đại Học Cần Thơ 12 17 37.2222 0.347222 107.20 0.0000 CV = 13,426% Multiple Range Tests for Khang Khuan Ngay by Dong Vi Khuan Method: 95.0 percent LSD Dong Vi Khuan TT3 TR9 TT1 TR1 TR4 TL2 Count 3 3 3 Mean 1.16667 1.66667 2.5 3.66667 7.33333 10.0 Homogeneous Groups E ED D C B A  Ngày Summary Statistics for Khang Khuan Ngay Dong Vi Khuan TL2 TR1 TR4 TR9 TT1 TT3 Total Count 3 3 3 18 Average 8.66667 3.0 8.0 1.33333 2.0 1.16667 4.02778 Standard deviation 0.57735 1.0 1.0 0.57735 0.288675 3.24704 Coeff of variation 6.66173% 33.3333% 12.5% 43.3013% 0% 24.7436% 80.6163% ANOVA Table for Khang Khuan Ngay by Dong Vi Khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 173.736 5.5 179.236 Df 12 17 Mean Square 34.7472 0.458333 F-Ratio 75.81 P-Value 0.0000 CV = 16,808% Multiple Range Tests for Khang Khuan Ngay by Dong Vi Khuan Method: 95.0 percent LSD Dong Vi Khuan TT3 TR9 TT1 TR1 TR4 TL2 Count 3 3 3 Mean 1.16667 1.33333 2.0 3.0 8.0 8.66667 Homogeneous Groups C C C B B A A  Ngày Summary Statistics for Khang Khuan Ngay Dong Vi Khuan TL2 TR1 TR4 Count 3 Ngành Công nghệ sinh học Average 3.66667 2.0 3.0 Standard deviation 0.57735 0 Coeff of variation 15.7459% 0% 0% Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 TR9 TT1 TT3 Total 3 18 Trường Đại Học Cần Thơ 1.66667 1.33333 0.833333 2.08333 0.57735 0.57735 0.288675 1.06066 34.641% 43.3013% 34.641% 50.9117% ANOVA Table for Khang Khuan Ngay by Dong Vi Khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 16.9583 2.16667 19.125 Df 12 17 Mean Square 3.39167 0.180556 F-Ratio 18.78 P-Value 0.0000 CV = 20,396% Multiple Range Tests for Khang Khuan Ngay by Dong Vi Khuan Method: 95.0 percent LSD Dong Vi Khuan TT3 TT1 TR9 TR1 TR4 TL2 4.2 Count 3 3 3 Mean 0.833333 1.33333 1.66667 2.0 3.0 3.66667 Homogeneous Groups C CB B B A A Kết khảo sát khả kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila dòng vi khuẩn nội sinh Xuyên tâm liên a Kết thí nghiệm Bảng 23 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila Dòng TR1 TR2 TL2 TL3 d (mm) Ngày D (mm) D-d (mm) 10 10 10 9 10 11 10 10 15 15 14 11 12 12 14 14 13 11 12 11 5 3 3 2 d (mm) Ngày D (mm) D–d (mm) 12 12 11 10 11 11 11 10 11 10 15 14 14 11 11 10 15 14 15 14 14 13 3 1 4 3 d (mm) Ngày D (mm) D-d (mm) 12 13 12 10 11 11 11 10 11 10 15 15 15 12 12 11 14 13 14 15 15 14 3 2 3 4 b Kết thống kê  Ngày Summary Statistics for Khang khuan Ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Dong vi khuan TL2 TL3 TR1 TR2 Total Count 3 3 12 Trường Đại Học Cần Thơ Average 3.33333 2.0 4.66667 3.0 3.25 Standard deviation 0.57735 0.57735 1.05529 Coeff of variation 17.3205% 0% 12.3718% 0% 32.4705% ANOVA Table for Khang khuan by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 10.9167 1.33333 12.25 Df 11 Mean Square 3.63889 0.166667 F-Ratio 21.83 P-Value 0.0003 CV= 12,561% Multiple Range Tests for Khang khuan by Dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong vi khuan TL3 TR2 TL2 TR1 Count 3 3 Mean 2.0 3.0 3.33333 4.66667 Homogeneous Groups C B B A  Ngày Summary Statistics for Khang khuan Dong vi khuan TL2 TL3 TR1 TR2 Total Count 3 3 12 Average 3.66667 3.33333 2.66667 1.33333 2.75 Standard deviation 0.57735 0.57735 0.57735 0.57735 1.05529 Coeff of variation 15.7459% 17.3205% 21.6506% 43.3013% 38.3742% ANOVA Table for Khang khuan by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 9.58333 2.66667 12.25 Df 11 Mean Square 3.19444 0.333333 F-Ratio 9.58 P-Value 0.0050 CV= 20,994% Multiple Range Tests for Khang khuan by Dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong vi khuan TR2 TR1 TL3 TL2 Count 3 3 Mean 1.33333 2.66667 3.33333 3.66667 Homogeneous Groups B A A A  Ngày Summary Statistics for Khang khuan Ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Dong vi khuan TL2 TL3 TR1 TR2 Total Count 3 3 12 Trường Đại Học Cần Thơ Average 2.66667 4.33333 2.66667 2.33333 3.0 Standard deviation 0.57735 0.57735 0.57735 0.57735 0.953463 Coeff of variation 21.6506% 13.3235% 21.6506% 24.7436% 31.7821% ANOVA Table for Khang khuan by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 7.33333 2.66667 10.0 Df 11 Mean Square 2.44444 0.333333 F-Ratio 7.33 P-Value 0.0110 CV = 19,245% Multiple Range Tests for Khang khuan by Dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong vi khuan TR2 TR1 TL2 TL3 4.3 Count 3 3 Mean 2.33333 2.66667 2.66667 4.33333 Homogeneous Groups B B B A Kết khảo sát khả kháng lại vi khuẩn Staphylococcus aureus dòng vi khuẩn nội sinh Xuyên tâm liên a Kết thí nghiệm Bảng 24 Kết khảo sát khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus Dòng TR4 TR6 TT1 d (mm) Ngày D (mm) D-d (mm) 10 11 11 8 10 11 10 12 14 13 13 13 13 13 13 13 5 3 d (mm) Ngày D (mm) D-d (mm) 11 11 12 11 10 10 12 12 13 10 13 13 12 1 1 1 d (mm) Ngày D (mm) D-d (mm) 11 11 12 9 11 11 11 11,5 12 12,5 10 10 13 13 12,5 0,5 0,5 1 2 1,5 b Kết thống kê  Ngày Summary Statistics for Khang khuan Dong vi khuan TR4 Count Ngành Công nghệ sinh học Average 2.33333 Standard deviation Coeff of variation 0.57735 24.7436% Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 TR6 TT1 Total 3 Trường Đại Học Cần Thơ 4.66667 2.66667 3.22222 0.57735 0.57735 1.20185 12.3718% 21.6506% 37.2988% ANOVA Table for Khang khuan by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 9.55556 2.0 11.5556 Df Mean Square 4.77778 0.333333 F-Ratio 14.33 P-Value 0.0052 CV = 17,918% Multiple Range Tests for Khang khuan by Dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong vi khuan Count Mean TR4 2.33333 TT1 2.66667 TR6 4.66667 Homogeneous Groups B B A  Ngày Summary Statistics for Khang khuan Dong vi khuan TR4 TR6 TT1 Total Count 3 Average 1.0 1.0 2.33333 1.44444 Standard deviation 0 0.57735 0.726483 Coeff of variation 0% 0% 24.7436% 50.295% ANOVA Table for Khang khuan by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 3.55556 0.666667 4.22222 Df Mean Square 1.77778 0.111111 F-Ratio 16.00 P-Value 0.0039 CV = 23,077% Multiple Range Tests for Khang khuan by Dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong vi khuan TR6 TR4 TT1 Count 3 Mean 1.0 1.0 2.33333 Homogeneous Groups B B A  Ngày Summary Statistics for Khang khuan Dong vi khuan TR4 TR6 TT1 Count 3 Ngành Công nghệ sinh học Average 0.666667 1.0 1.83333 Standard deviation 0.288675 0.288675 Coeff of variation 43.3013% 0% 15.7459% Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Total Trường Đại Học Cần Thơ 1.16667 0.559017 47.9157% ANOVA Table for Khang khuan by Dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 2.16667 0.333333 2.5 Df Mean Square 1.08333 0.0555556 F-Ratio 19.50 P-Value 0.0024 CV = 20,203% Multiple Range Tests for Khang khuan by Dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD Dong vi khuan TR4 TR6 TT1 Ngành Công nghệ sinh học Count 3 Mean 0.666667 1.0 1.83333 Homogeneous Groups B B A Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đại Học Cần Thơ Phụ lục Kết nhận diện số dòng vi khuẩn kỹ thuật PCR 5.1 Trình tự gene mã hóa 16S-rRNA dòng TR1 GGGCATGGCGCANGNCTACACATGCAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTT GCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCC TGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTC GCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCA GATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCC TAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCC TGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACT TTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTAC CCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG AGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCCTTCG AAACTGGCAGGCTACGGTCTTGTAGAGGGGGGTACAATTCCGGGTGTAGC GGTGAAATGGGTAAAGGTTTGGGGGGATAACGGTGGGGGAAGGGGCTCCT TGGGCAAAACCCGACTCTCCCGGGGGAGAAATGGGGTGTTGCACAAGGGG GACCACCCCCCGGGCGGTTATCCCCCCAAATATTTCCATTCTGGGAGGTTG CCCCTTTGGGTCTGCCCCCCCAAACAAACATTTTTATAGCTTTCTTGAGGGG GATTTGCGGGGGGGGGGTAGAGGTTTTATTATTTCCGGGTGGGGCCCCCCC CGGGCGGGGGTTTTTTGTTTTTATTTTAAAAACAGGCGAAGCCCCCCTATTT TTTTCCGACTAGGGAAATAATAATAAAGGGTTTTTTCTTCTTTAAGGAAAA ACCAAAAGGGGAGGTGTTTAAACGCCCACACCCTCTCTCCCGGAAAGAGA AGGGTGTAGAAAACACAACCAGAGCGACGCTTCCTTCAACCCCTATGGGT GGGGGGGGGGGGGTGGGGGGGGGGCGCGAGAATATAATAAAACAACACC CCCCCCCTCTGTGCCTCTAAAGAAGGGGGGAGAGGGGGTGGGGGGATTGA TTCTCTTTATTTTTTGGGGGGGGGGGTGCTCAAAAAATATAACCCCCAAAA Ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đại Học Cần Thơ 5.2 Trình tự gene mã hóa 16S-rRNA dòng TL3 GGGGCATAGCGGCAGCCTACACATGCAGTCGAACAGTAGCACACAGAGCT TGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGC CTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGT CGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCC AGATGGGATTAGCTGGTAGGCGGGGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCC CTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGC CTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCA CTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTACGGTTAATAACCGTGCTGATTGACGTT ACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC GGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTTCTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGC GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATT TGAAACTGGGAGGCTGGAGTTCCGTTGAGGGAGGGAGAATTCCAGGGGTA GCGGGGAAATTGCGTAGAGATTTGGAGGGGATACCGGTGGGGAAGGGGG CCTCCTGGGCCAAAACTCGAGTCTCAGGTGGGGAAAGTGTGGGGGGAAAA AGGGGGCTGATTCCCGGGGGGTCCATACTTTATAACGAGGGGTTATTGCAG GGTGTGCCCCTGAGGGGGGTATCTCTCGGAGAAAAAACGGTACAGAAAGA ATAACCCGCCGAGGGGTCCGCTCCGGCGGTGTGGGACTTAAAAAAATTAA TCTTTCCGGGGGGGGGCCCCCCCCCATGATTGGGGGGACGTATCGGCGCTT TTTTAATTTTAATAGCACCAATATATTATTTCTCTTGTTTTTTTTATGCCCTT AAAAACCGAGATTATAGTAATGAATTGTTTTTTTTTTATGTTTTGGGATATA AATTTTAAATTCAAAGGCGGGTTGGTCTTACAGCGTGCTCCCGCCCATCCT Ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015 Trường Đại Học Cần Thơ TCTTTGGCATGTGGGGAAATGGGGTGTTTTTTTTTTTTGTTAAGTCCGTAGT CCGTGGGCTTCTCGCTCCCCACCCACTCCCTTTGTTAGCGGTGTGTTTGGTC TGGGGTTAGTTGTGAGTGTGTACGTGAGCACATATACAATAATTAATAATT AATATAAAACGAGATTTAGCATCGTTGTGCACCCCGCCGCTCATGGTCTTC CTTAAGCAGCCCGCTG Ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... một số chủng vi sinh vật nội sinh với cây dược liệu có thể sản xuất các hợp chất kháng khuẩn khi chúng sống bên trong cây dược liệu Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella… 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập được các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) tại An Giang có các đặc tính... của cây Xuyên tâm liên lấy từ vùng Bảy Núi – An Giang: pH = 7,22 - Đất tại vùng rễ của cây Xuyên tâm liên lấy từ vùng Huyện An Phú – An Giang: pH = 7,59 c Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân, lá của cây Xuyên tâm liên Sau khi ủ ở nhiệt độ 30°C trong 2 – 3 ngày, các dòng vi khuẩn được trích từ rễ, thân và lá của cây Xuyên tâm liên phát triển tạo thành một vòng pellicle trắng đục Ngành Công nghệ sinh. .. (2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây Ngành Công nghệ sinh học 7 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp... cấp tính, vi m dạ dày, vi m ruột, cảm sốt, sưng tấy, rắn độc cắn: Xuyên tâm liên, Kim ngân hoa, Sài đất; sắc uống - Chữa vi m phổi, sưng amidan: Xuyên tâm liên, Huyền sâm, Mạch môn; sắc uống - Chữa vi m gan nhiễm khuẩn: Xuyên tâm liên, cỏ Nhọ nồi, Diệp hạ châu đắng; sắc uống với thời gian điều trị từ 2 - 4 tuần - Chữa bỏng: Xuyên tâm liên nấu với nước, rửa hàng ngày 2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh Ngành... nitro-acromatics và những vi khuẩn nội sinh trong cây trồng tại đây chứa những gen phân hủy nitro-acromatics, những vi khuẩn nội sinh còn tồn tại trong đất vùng rễ của cây trồng hay có trong đất (Ryan et al., 2008) Theo Van Aken et al., (2004) những dòng vi khuẩn cộng sinh thực vật như Methylbacterium phân lập từ cây Polar lai (Populus deltoids x nigra), cũng có khả năng phân hủy nitro-acromatics như... 3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng Chuẩn bị mẫu vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép, rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn: - Nhỏ 5µl nước cất vô trùng lên kính mang vật Ngành Công nghệ sinh học 25 Vi n NC... nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002) Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều... pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây bệnh héo moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris 2.5.2 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc... lượng khô cho cây Lúa khi thử nghiệm Ngoài ra, E ludwigii thúc đẩy tăng trưởng trọng lượng tươi và chiều dài rễ, chồi ở cây Lolium perenne (Mauricio Shoebitz et al., 2009) 2.6 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 2.6.1 Phân hủy sinh học Siciliano et al., (2001) ghi nhận cây trồng phát triển tốt trong đất nhiễm các hóa chất độc hại có vi khuẩn nội sinh trong cây chứa những gen có khả năng phân hủy độc... Các vi sinh vật sống nội sinh trong cây hoặc ở vùng rễ cây, có cả trong cây dược liệu giúp kích thích cây trồng phát triển tốt bởi chúng có khả năng cố định nitơ, phân giải lân, tổng hợp các hormone tăng trưởng và các hợp chất có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại các tác nhân gây bệnh cây Đặc biệt, ... 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn Từ rễ, thân, Xuyên tâm liên mọc hoang tỉnh An Giang, 18 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập môi trường PDA Hầu hết dòng vi khuẩn phân bố phận Vi khuẩn phân lập tập trung... Bảy Núi – An Giang 14 TT5 Thân Bảy Núi – An Giang 15 TT6 Thân H .An Phú – An Giang 16 TL1 Lá Bảy Núi – An Giang 17 TL2 Lá H .An Phú – An Giang 18 TL3 Lá H .An Phú – An Giang Đặc điểm khuẩn lạc Sau... Phú – An Giang 07 TR7 Rễ Bảy Núi – An Giang 08 TR8 Rễ Bảy Núi – An Giang 09 TR9 Rễ Bảy Núi – An Giang 10 TT1 Thân Bảy Núi – An Giang 11 TT2 Thân Bảy Núi – An Giang 12 TT3 Thân Bảy Núi – An Giang