phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diệp hạ châu (phyllanthus amarus l.) mọc hoang ở tỉnh cà mau

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) MỌC HOANG Ở TỈNH CÀ MAU CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP TRƢƠNG MỘNG TUYỀN VIỆN NC & PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC MSSV: 3104003 LỚP: VSV K36 Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) MỌC HOANG Ở TỈNH CÀ MAU CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP TRƢƠNG MỘNG TUYỀN VIỆN NC & PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC MSSV: 3104003 LỚP: VSV K36 Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Trương Mộng Tuyền DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………. Cần thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gởi lời cảm ơn đến: Quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh học tận tình dạy bảo truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích kỹ thao tác nghiên cứu suốt trình em theo học Viện. Phó Giáo sư – Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, thầy hướng dẫn tận tình, cho em lời khuyên bổ ích thời gian em thực đề tài luận văn tốt nghiệp. Cán tất phòng thí nghiệm đặc biệt anh chị phòng thí nghiệm Vi sinh vật, thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học giúp đỡ em hoàn thành đề tài. Các bạn bè người động viên, cổ vũ, giúp đỡ suốt thời gian qua. Đặt biệt quan tâm chia sẻ gia đình người thân khoảng thời gian xa nhà hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, xin gởi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý Thầy Cô, anh chị tất người bạn tôi. Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2013 Sinh viên thực Trƣơng Mộng Tuyền TÓM LƢỢC Mười sáu dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rễ, thân, lá, trái Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) Tỉnh Cà Mau. Trong đó, mười hai dòng vi khuẩn phân lập tế bào có hình que ngắn bốn dòng tế bào có hình que dài. Bảy dòng vi khuẩn thuộc nhóm Gram dương lại dòng Gram âm. Mười sáu dòng vi khuẩn có khả cố định NH4+ tổng hợp IAA. Dòng H8 có khả tổng hợp NH4+ cao (1,41µg/ml), nồng độ IAA sinh nhiều 19,15µg/ml (do dòng T9 tổng hợp). Chín dòng vi khuẩn có khả hòa tan lân khó tan. Dòng T9, R7, R10B kháng vi khuẩn Escherichia coli, dòng R7, R10B, R12 kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophyla. Ba dòng vi khuẩn T9, R7 R10B có khả kháng khuẩn nhận diện phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S-rDNA. Dòng T9 nhận diện Bacillus subtilis có mức đồng hình 99%, dòng R7 nhận diện Bacillus amyloliquefaciens có mức đồng hình 98% dòng R10B nhận diện Bacillus methylotrophicus có mức đồng hình 99%. Từ khóa: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus methylotrophicus, Bacillus subtilis,cố định NH4+,Diệp Hạ Châu, kháng khuẩn, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh. i MỤC LỤC TÓM LƢỢC I MỤC LỤC II DANH SÁCH BẢNG V DANH SÁCH HÌNH VI TỪ VIÊT TẮT VII PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU . VỊ TRÍ ĐỊA LÝ TỈNH CÀ MAU I. II. GIỚI THIỆU CÂY DIỆP HẠ CHÂU . III. MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH . 1. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp . 1.1. Vi khuẩn Azospirillum sp 1.2. Vi khuẩn Azotobacter sp 1.3. Vi khuẩn Bacillus sp . 1.4. Vi khuẩn Burkholderia sp. 11 1.5. Vi khuẩn Enterobacter sp . 12 1.6. Vi khuẩn Klebsiella sp 12 1.7. Vi khuẩn Pseudomonas sp 12 2. Một số đặc tính vi khuẩn nội sinh . 14 IV. 2.1. Khả cố định đạm . 14 2.2. Khả tổng hợp IAA 14 2.3. Đối kháng sinh học 15 MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN GÂY BỆNH 15 1. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila . 15 2. Vi khuẩn Escherichia coli 16 V. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) TRONG NƢỚC VÀ THẾ GIỚI . 16 1. Tình hình nghiên cứu nước . 17 2. Tình hình nghiên cứu giới 19 PHẦN III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 ii I. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20 1. Địa điểm – thời gian . 20 2. Vật liệu . 20 3. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 20 4. Hóa chất . 21 4.1. Môi trường phân lập vi khuẩn 21 4.2. Môi trường khảo sát khả hòa tan lân . 21 4.3. Môi trường khảo sát khả tổng hợp NH4+, IAA 21 4.4. Môi trường khảo sát khả kháng khuẩn 22 4.5. Hóa chất dùng để khử trùng mẫu 22 4.6. Hóa chất dùng để nhuộm Gram 22 II. PH ƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 1. Phân lập vi khuẩn nội sinh Diệp Hạ Châu . 23 1.1. Quy trình phân lập vi khuẩn 23 1.2. Quan sát, mô tả hình dạng, khả chuyển động vi khuẩn . 24 1.3. Quan sát đo kích thước tế bào vi khuẩn nội sinh . 25 1.4. Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh 26 2. Xác định khả tổng hợp NH4+ dòng vi khuẩn phân lập 27 2.1. Nguyên tắc . 27 2.2. Hóa chất: . 27 2.3. Định lượng đạm vi khuẩn sinh ngày 2, 4, (sau chủng) 28 3. Thí nghiệm khảo sát khả tổng hợp IAA số dòng vi khuẩn phân lập 29 3.1. Chuẩn bị 29 3.2. Định lượng IAA ngày 2, 4, (sau chủng) . 29 4. Thí nghiệm khảo sát khả hòa tan lân . 30 5. Thử nghiệm khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn phân lập được30 6. Nhận diện số dòng vi khuẩn có đặc tính kháng khuẩn . 30 PHẦN IV: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN . 33 I. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN . 33 1. Phân lập vi khuẩn . 33 iii 2. Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập 34 II. ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP . 36 III. KHẢ NĂNG TỔNG HỢP NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN . 38 IV. KHẢ NĂNG TỔNG HỢP IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN . 40 V. KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP . . 41 VI. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 42 1. Khả kháng khuẩn vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli 42 2. Khả kháng khuẩn vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila . 43 VII. ĐỊNH DANH NHỮNG DÒNG VI KHUẨN TRIỂN VỌNG 45 PHẦN V: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 49 I. KẾT LUẬN 49 II. ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 50 PHỤ LỤC . 54 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Bản đồ địa lý Tỉnh Cà Mau Hình 2: Cây Diệp Hạ Châu Hình 3: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens . 13 Hình 4: Dụng cụ phòng thí nghiệm . 20 Hình 5: Phương pháp pha loãng 24 Hình 6: Vòng pellicle vi khuẩn môi trường NFb bán đặc . 34 Hình 7: Đặc điểm số khuẩn lạc phân lập . 35 Hình 8: Nhuộm Gram dòng vi khuẩn phân lập 37 Hình 9: Khả tổng hợp NH4+ dòng vi khuẩn sau 2, 4, 6, ngày chủng môi trường NFb 39 Hình 10: Khả tổng hợp IAA số dòng vi khuẩn sau 2, 4, ngày chủng 41 Hình 11: Vòng sáng hòa tan lân dòng T8 (trái) dòng R9 (phải) 41 Hình 12: Hiệu suất hòa tan lân dòng vi khuẩn sau 2, 4, ngày chủng 42 Hình 13: Vòng sáng kháng vi khuẩn Escherichia coli dòng R10B ngày thứ 42 Hình 14: Tính kháng vi khuẩn E. coli dòng vi khuẩn phân lập . 43 Hình 15: Vòng sáng kháng vi khuẩn A. hydrophila dòng R12 ngày thứ . 44 Hình 16 : Tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila dòng qua ngày khảo sát 44 Hình 17: Phổ điện di dòng vi khuẩn . 45 Hình 18: Kết giải trình tự gen 16S rDNA dòng T9 . 46 Hình 19: Kết giải trình tự gen 16S rDNA dòng R7 . 47 Hình 20: Kết giải trình tự gen 16S rDNA dòng R10B . 48 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần môi trường Potato Dextro Agar (có bổ sung đạm 1g KNO3/L). 21 Bảng 2: Thành phần Môi trường NBRIP đặc 21 Bảng 3: Thành phần môi trường NFb . 21 Bảng 4: Thành phần môi trường LB (Luria – bertani) 22 Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập môi trường PDA . 35 Bảng 7: Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn phân lập môi trường PDA . 37 Bảng 8: Khả tổng hợp NH4+ dòng vi khuẩn sau 2, 4, 6, ngày chủng (nhóm A) 38 Bảng 9: khả tổng hợp IAA dòng vi khuẩn sau 2,4,6 ngày chủng 40 Bảng 10: Trình tự gene 16S rDNA dòng T9 . 46 Bảng 11: Trình tự gene 16S rDNA dòng R7 47 Bảng 12: Trình tự gene 16S rDNA dòng R10B 48 vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngày Summary Statistics dong Count Average Standard Coeff. deviation variation of Minimum Maximum Range 50 0.216667 0.023094 10.6588% 0.19 0.23 0.04 51 0.296667 0.046188 15.569% 0.27 0.35 0.08 52 0.206667 0.0057735 2.79363% 0.2 0.21 0.01 59 0.0933333 0.011547 12.3718% 0.08 0.1 0.02 61 0.193333 0.0152753 7.90099% 0.18 0.21 0.03 62 0.19 0.034641 18.2321% 0.17 0.23 0.06 63 0.0933333 0.0152753 16.3663% 0.08 0.11 0.03 64 0.286667 0.0251661 8.77888% 0.26 0.31 0.05 65 0.133333 0.0208167 15.6125% 0.11 0.15 0.04 Total 27 0.19 0.0739022 5.705578987% 0.08 0.35 0.27 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.130867 0.0000 Within groups 0.0111333 18 0.000618519 Total (Corr.) 0.142 26 0.0163583 26.45 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean Homogeneous Groups 63 0.0933333 X 59 0.0933333 X 65 0.133333 X 62 0.19 X 61 0.193333 X 52 0.206667 X 50 0.216667 X 64 0.286667 X 51 0.296667 X 63 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngày Summary Statistics dong Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 50 0.196667 0.011547 5.87136% 0.19 0.21 0.02 51 0.203333 0.011547 5.67886% 0.19 0.21 0.02 52 0.203333 0.0152753 7.51242% 0.19 0.22 0.03 59 0.0733333 0.011547 15.7459% 0.06 0.08 0.02 61 0.05 0.01 20.0% 0.04 0.06 0.02 62 0.226667 0.0152753 6.73908% 0.21 0.24 0.03 63 0.226667 0.0152753 6.73908% 0.21 0.24 0.03 64 0.356667 0.0321455 9.01276% 0.32 0.38 0.06 65 0.213333 0.0404145 18.9443% 0.17 0.25 0.08 Total 27 0.194444 0.0879394 4.700564609% 0.04 0.38 0.34 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.193333 0.0000 Within groups 0.00773333 18 0.00042963 Total (Corr.) 0.201067 26 0.0241667 56.25 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean Homogeneous Groups 61 0.05 X 59 0.0733333 X 50 0.196667 X 51 0.203333 X 52 0.203333 X 65 0.213333 X 63 0.226667 X 62 0.226667 X 64 0.356667 X 64 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngày Summary Statistics dong Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 50 0.0933333 0.0057735 6.1859% 0.09 0.1 0.01 51 0.176667 0.0208167 11.783% 0.16 0.2 0.04 52 0.133333 0.0152753 11.4564% 0.12 0.15 0.03 59 0.01 0% 0.01 0.01 61 0.133333 0.011547 8.66025% 0.12 0.14 0.02 62 0.33 0.04 12.1212% 0.29 0.37 0.08 63 0.15 0.0264575 17.6383% 0.12 0.17 0.05 64 0.223333 0.0152753 6.83967% 0.21 0.24 0.03 65 0.116667 0.0152753 13.0931% 0.1 0.13 0.03 0.151852 0.086826 5.132391033% 0.01 0.37 0.36 Total 27 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.188807 59.00 0.0000 Within groups 0.0072 18 0.0004 Total (Corr.) 0.196007 26 0.0236009 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean Homogeneous Groups 59 0.01 X 50 0.0933333 X 65 0.116667 XX 52 0.133333 X 61 0.133333 X 63 0.15 XX 51 0.176667 64 0.223333 62 0.33 X X X 65 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 2.1.2. Nhóm B Ngày Summary Statistics dòng Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 53 % 54 0.0433333 0.0057735 13.3235% 0.04 0.05 0.01 55 0.0366667 0.0057735 15.7459% 0.03 0.04 0.01 56 0.123333 0.0208167 16.8784% 0.1 0.14 0.04 57 0.0633333 0.0152753 24.1188% 0.05 0.08 0.03 58 0.1 0.01 10.0% 0.09 0.11 0.02 60 0.04 0% 0.04 0.04 0.0580952 0.0405733 18,7810903% 0.14 0.14 Total 21 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0312571 0.00520952 43.76 0.0000 Within groups 0.00166667 14 0.000119048 Total (Corr.) 0.0329238 20 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dòng Count Mean Homogeneous Groups 53 X 55 0.0366667 X 60 0.04 X 54 0.0433333 X 57 0.0633333 58 0.1 56 0.123333 X X X 66 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngày Summary Statistics dòng Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 53 0.18 0.01 5.55556% 0.17 0.19 0.02 54 0.18 0.01 5.55556% 0.17 0.19 0.02 55 0.113333 0.0152753 13.4782% 0.1 0.13 0.03 56 0.16 0.0173205 10.8253% 0.15 0.18 0.03 57 0.173333 0.0152753 8.81265% 0.16 0.19 0.03 58 0.173333 0.0152753 8.81265% 0.16 0.19 0.03 60 0.156667 0.0208167 13.2872% 0.14 0.18 0.04 Total 21 0.162381 0.0256719 9,4070374% 0.1 0.19 0.09 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.00991429 0.00165238 0.0013 Within groups 0.00326667 14 0.000233333 Total (Corr.) 0.013181 20 7.08 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dòng Count Mean Homogeneous Groups 55 0.113333 X 60 0.156667 X 56 0.16 X 58 0.173333 X 57 0.173333 X 54 0.18 X 53 0.18 X 67 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngày Summary Statistics dòng Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 53 0.186667 0.0208167 11.1518% 0.17 0.21 0.04 54 0.216667 0.023094 10.6588% 0.19 0.23 0.04 55 0.176667 0.0057735 3.26802% 0.17 0.18 0.01 56 0.18 0.01 5.55556% 0.17 0.19 0.02 57 0.216667 0.0057735 2.66469% 0.21 0.22 0.01 58 0.2 0.0173205 8.66025% 0.18 0.21 0.03 60 0.166667 0.0057735 3.4641% 0.16 0.17 0.01 0.191905 0.0222753 7,5427653% 0.16 0.23 0.07 Total 21 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.00699048 0.0039 Within groups 0.00293333 14 0.000209524 Total (Corr.) 0.00992381 20 0.00116508 5.56 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dòng Count Mean Homogeneous Groups 60 0.166667 X 55 0.176667 XX 56 0.18 XX 53 0.186667 XX 58 0.2 57 0.216667 X 54 0.216667 X XX 68 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngày Summary Statistics dòng Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 53 0.0566667 0.0057735 10.1885% 0.05 0.06 0.01 54 0.123333 0.0152753 12.3853% 0.11 0.14 0.03 55 0.07 0.01 14.2857% 0.06 0.08 0.02 56 0.0533333 0.0057735 10.8253% 0.05 0.06 0.01 57 0.0433333 0.0057735 13.3235% 0.04 0.05 0.01 58 0.113333 0.011547 10.1885% 0.1 0.12 0.02 60 0.1 0.01 10.0% 0.09 0.11 0.02 0.08 0.031305 12,0143794% 0.04 0.14 0.1 Total 21 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0182667 31.97 0.0000 Within groups 0.00133333 14 0.0000952381 Total (Corr.) 0.0196 20 0.00304444 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dòng Count Mean Homogeneous Groups 57 0.0433333 X 56 0.0533333 XX 53 0.0566667 XX 55 0.07 60 0.1 X 58 0.113333 XX 54 0.123333 X X 69 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 2.2. Trường Đại học Cần Thơ Khả tổng hợp IAA 16 dòng vi khuẩn sau 2,4,6 ngày chủng Ngày Summary Statistics dòng Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 50 12.94 0.679485 5.25104% 12.22 13.57 1.35 51 15.19 2.10877 13.8826% 12.76 16.54 3.78 52 15.82 1.53528 9.70471% 14.11 17.08 2.97 53 14.47 1.33188 9.20441% 13.57 16.0 2.43 54 11.4067 1.6481 14.4486% 9.51 12.49 2.98 55 19.15 0.412432 2.15369% 18.7 19.51 0.81 56 13.84 0.973499 7.03395% 12.76 14.65 1.89 57 15.01 0.56205 3.7445% 14.38 15.46 1.08 58 13.12 1.79775 13.7024% 11.14 14.65 3.51 59 18.07 0.56205 3.1104% 17.62 18.7 1.08 60 13.1167 1.95899 14.9351% 10.86 14.38 3.52 61 15.55 0.867929 5.58153% 14.92 16.54 1.62 62 15.82 1.09119 6.89755% 15.19 17.08 1.89 63 8.34 0.867929 10.4068% 7.35 8.97 1.62 64 7.98 1.55885 19.5344% 7.08 9.78 2.7 65 11.77 0.867929 7.37407% 11.14 12.76 1.62 13.8496 3.14262 9,2845514% 7.08 19.51 12.43 Total 48 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 411.264 15 27.4176 16.58 0.0000 Within groups 52.9111 32 1.65347 Total (Corr.) 464.175 47 70 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dòng Count Mean Homogeneous Groups 64 7.98 X 63 8.34 X 54 11.4067 X 65 11.77 XX 50 12.94 XXX 60 13.1167 XXXX 58 13.12 XXXX 56 13.84 XXXX 53 14.47 XXX 57 15.01 XXX 51 15.19 XX 61 15.55 X 62 15.82 X 52 15.82 X 59 18.07 X 55 19.15 X Ngày Summary Statistics dòng Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 50 13.74 0.840417 6.11657% 12.85 14.52 1.67 51 15.24 0.788226 5.17209% 14.35 15.85 1.5 52 13.6833 1.44991 10.5962% 12.02 14.68 2.66 53 9.79667 0.632166 6.45286% 9.35 10.52 1.17 54 14.35 1.19954 8.35917% 13.35 15.68 2.33 55 16.7933 0.344287 2.05014% 16.52 17.18 0.66 56 14.6267 1.68776 11.5389% 12.68 15.68 3.0 57 15.24 0.255343 1.67548% 15.02 15.52 0.5 58 15.96 0.190526 1.19377% 15.85 16.18 0.33 71 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 59 17.57 0.190526 1.08438% 17.35 17.68 0.33 60 16.1833 0.726108 4.48677% 15.35 16.68 1.33 61 16.57 0.53507 3.22915% 16.18 17.18 1.0 62 15.1267 0.254231 1.68068% 14.85 15.35 0.5 63 12.9033 0.692556 5.36726% 12.35 13.68 1.33 64 12.96 0.348281 2.68736% 12.68 13.35 0.67 65 13.74 0.255343 1.85839% 13.52 14.02 0.5 14.6552 1.96596 5,372175% 9.35 17.68 8.33 Total 48 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 161.82 15 10.788 17.40 0.0000 Within groups 19.8351 32 0.619846 Total (Corr.) 181.655 47 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dòng Count Mean Homogeneous Groups 53 9.79667 X 63 12.9033 X 64 12.96 X 52 13.6833 XX 65 13.74 XX 50 13.74 XX 54 14.35 XX 56 14.6267 XX 62 15.1267 XX 51 15.24 XX 57 15.24 XX 58 15.96 XX 60 16.1833 XX 61 16.57 XX 55 16.7933 XX 59 17.57 X 72 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngày Summary Statistics dòng Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 50 2.59667 0.150111 5.78091% 2.51 2.77 0.26 51 11.83 1.54204 13.035% 10.21 13.28 3.07 52 6.36 0.77 12.1069% 5.59 7.13 1.54 53 2.77 0.26 9.38628% 2.51 3.03 0.52 54 4.82 0.678454 14.0758% 4.31 5.59 1.28 55 7.72667 0.531633 6.88049% 7.13 8.15 1.02 56 3.11333 0.391706 12.5816% 2.77 3.54 0.77 57 5.16333 0.391706 7.58629% 4.82 5.59 0.77 58 2.6 0.39281 15.1081% 2.26 3.03 0.77 59 9.09667 0.594671 6.53724% 8.41 9.44 1.03 60 3.19667 0.594671 18.6028% 2.51 3.54 1.03 61 7.38 0% 7.38 7.38 62 10.63 0.294449 2.76998% 10.46 10.97 0.51 63 4.56 0.77 16.886% 3.79 5.33 1.54 64 7.38333 0.44456 6.02112% 6.87 7.64 0.77 65 5.93333 0.972899 16.3972% 4.82 6.62 1.8 5.9475 2.88468 10,9580754% 2.26 13.28 11.02 Total 48 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 377.513 15 25.1675 59.25 0.0000 Within groups 13.5921 32 0.424754 Total (Corr.) 391.105 47 73 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dòng Count Mean Homogeneous Groups 50 2.59667 X 58 2.6 X 53 2.77 X 56 3.11333 X 60 3.19667 X 63 4.56 X 54 4.82 X 57 5.16333 XX 65 5.93333 52 6.36 61 7.38 XX 64 7.38333 XX 55 7.72667 X 59 9.09667 62 10.63 51 11.83 2.3. XX XX X X X Khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn sau ngày chủng môi trƣờng LB trãi E.coli Ngày Summary Statistics dong Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 0.175 0.0353553 20.2031% 0.15 0.2 0.05 0.275 0.247487 89.9954% 0.1 0.45 0.35 0.375 0.106066 28.2843% 0.3 0.45 0.15 Total 0.275 0.150831 57% 0.1 0.45 0.35 74 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.04 0.02 0.81 0.5221 Within groups 0.07375 0.0245833 Total (Corr.) 0.11375 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean Homogeneous Groups 0.175 X 0.275 X 0.375 X Ngày Summary Statistics dong Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 0.175 0.0353553 20.2031% 0.15 0.2 0.05 0.275 0.176777 64.2824% 0.15 0.4 0.25 0.325 0.0353553 10.8786% 0.3 0.35 0.05 0.258333 0.106849 41,057866% 0.15 0.4 0.25 Total ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0233333 0.0116667 1.04 0.4546 Within groups 0.03375 0.01125 Total (Corr.) 0.0570833 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Dong Count Mean Homogeneous Groups 0.175 X 0.275 X 0.325 X 75 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngày Summary Statistics dong Count Average Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range 0.2 0.0707107 35.3553% 0.15 0.25 0.1 0.225 0.0353553 15.7135% 0.2 0.25 0.05 0.3 0.0707107 23.5702% 0.25 0.35 0.1 0.241667 0.066458 25,3395141% 0.15 0.35 0.2 Total ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0108333 0.00541667 1.44 0.3636 Within groups 0.01125 0.00375 Total (Corr.) 0.0220833 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Dong Count Mean Homogeneous Groups 0.2 0.225 X 0.3 2.4. X X Khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn sau ngày chủng môi trƣờng LB trải A.hydrophilla Ngày Summary Statistics dong Count Average 0.05 0.325 Total Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range % 0.05 0.05 0.0353553 10.8786% 0.3 0.35 0.05 0.175 0.106066 60.6092% 0.1 0.25 0.15 0.275 0.0353553 12.8565% 0.25 0.3 0.05 0.228571 0.11127 29,6189347% 0.05 0.35 0.3 76 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0605357 0.0201786 4.40 0.1274 Within groups 0.01375 0.00458333 Total (Corr.) 0.0742857 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean Homogeneous Groups 0.05 0.175 XX 0.275 XX 0.325 X X Ngày Summary Statistics dong Count Average 0.15 0.3 Total Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range % 0.15 0.15 0.0707107 23.5702% 0.25 0.35 0.1 0.225 0.176777 78.5674% 0.1 0.35 0.25 0.25 0.0707107 28.2843% 0.2 0.3 0.1 0.242857 0.09759 48,28372% 0.1 0.35 0.25 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0158929 0.00529762 0.39 0.7729 Within groups 0.04125 0.01375 Total (Corr.) 0.0571429 77 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean Homogeneous Groups 0.15 0.225 X 0.25 X 0.3 X X Ngày Summary Statistics dong Count Average 0.3 0.375 Total Standard Coeff. of deviation variation Minimum Maximum Range % 0.3 0.3 0.106066 28.2843% 0.3 0.45 0.15 0.25 0.141421 56.5685% 0.15 0.35 0.2 0.275 0.106066 38.5695% 0.2 0.35 0.15 0.3 0.1 39,674649% 0.15 0.45 0.3 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0175 0.00583333 0.41 0.7574 Within groups 0.0425 0.0141667 Total (Corr.) 0.06 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean Homogeneous Groups 0.25 0.275 X 0.3 0.375 X X X 78 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Viên NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay Vì vậy, vi c nghiên cứu Phân lập những dòng vi khuẩn nội sinh Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) ở Tỉnh Cà Mau để tuyển chọn những dòng vi khuẩn nội sinh có ích cho sự phát triển của cây đặc biệt là đặc tính kháng khuẩn ứng dụng trong lĩnh vực y học được thực hiện Mục tiêu đề tài : Phân lập và tuyển chọn... thí nghiệm: phòng Vi sinh vật, phòng Thực phẩm - Vi n NC & PT Công Nghệ Sinh Học, Đại học Cần Thơ 2 Vật liệu Cây Diệp hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) được thu ở Huyện Đầm Dơi, Tỉnh Cà Mau Vi khuẩn E coli được lấy tại phòng Sinh học Phân tử, Vi n NC&PT CNSH Vi khuẩn A hydrophila được lấy tại Khoa Thủy sản 3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, kính hiển vi điện tử, nồi khử... Chaintreuil et al., (2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây 1 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣờng gặp Theo nghiên cứu khoa học... các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus L.) có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn 2 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ PHẦN II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU I VỊ TRÍ ĐỊA LÝ TỈNH CÀ MAU Tỉnh Cà Mau được tái lập từ cuối năm 1996, là mảnh đất tận cùng của Vi t Nam với... Fushin - Crystal violet - Cồn 70o 22 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học II Trường Đại học Cần Thơ PH ƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trên cây Diệp Hạ Châu 1.1 Quy trình phân lập vi khuẩn Cách chuẩn bị đĩa môi trường phân lập: Sau khi pha môi trường PDA vào bình tam giác thì tiến hành khử trùng ở 121oC, 1atm trong 20 phút cho... ở 30oC trong 24 giờ để kiểm tra có bị nhiễm (nhiễm nấm men và nấm mốc) hay không Chỉ được sử dụng nếu đĩa không bị nhiễm (Nguyễn Thị Diệu Hiền, 2009) Tiến hành thu hoạch các cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.) trong tự nhiên, thu hoạch những cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.) này ở giai đoạn cây đang tăng trưởng tối đa, thu toàn bộ cây và tiến hành các bước sau:  Rửa thật sạch đất bám ở. .. của vi khuẩn 1.3 Quan sát và đo kích thƣớc tế bào vi khuẩn nội sinh Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng, đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần Tiến hành chụp hình vi khuẩn nội sinh dưới kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại 20.000 lần để thấy rõ hơn hình dạng tế bào, các chiên mao ở đầu và chiên mao bên của vi khuẩn. .. khuẩn xuất hiện những khuẩn lạc, lấy khuẩn lạc vùng này cấy truyền sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30oC trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển  Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập đến khi ròng vi khuẩn 1.2 Quan sát, mô tả hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan... communis, lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và đặt tên theo bác sĩ nhi khoa Đức Vi khuẩn E.coli thuộc họ Enterobacteriaceas, vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh đường ruột và các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997) Vi khuẩn E.coli có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5- 40oC,... Quốc, hiện nay người ta đã phân lập được trên dưới 200 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp Cá như Azospirillum, Klebsiella…nhưng trong đó phải kể đến 2 chi có khả năng kháng khuẩn đó là Bacillus và Pseudomonas 7 Chuyên ngành vi sinh vật học K36 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 1.1 Trường Đại học Cần Thơ Vi khuẩn Azospirillum sp Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng . Bacillus sp 8 1.4. Vi khuẩn Burkholderia sp. 11 1 .5. Vi khuẩn Enterobacter sp 12 1.6. Vi khuẩn Klebsiella sp 12 1.7. Vi khuẩn Pseudomonas sp 12 2. Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 14 2.1 14 2.2. Khả năng tổng hợp IAA 14 2.3. Đối kháng sinh học 15 IV. MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN GÂY BỆNH 15 1. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 15 2. Vi khuẩn Escherichia coli 16 V. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU. VII. ĐỊNH DANH NHỮNG DÒNG VI KHUẨN TRIỂN VỌNG 45 PHẦN V: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 49 I. KẾT LUẬN 49 II. ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 v DANH