phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diệp hạ châu (phyllanthus amarus l.) mọc hoang tại lai vung – đồng tháp

... – Lai Vung – Đồng Tháp T05 Thân Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp T06 Thân Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp T07 Thân Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp T08 Lá Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng. .. Đồng Tháp T09 Lá Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 10 T10 Lá Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 11 T11 Trái Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 12 T12 Trái Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp. .. 4.1 Kết phân lập vi khuẩn 4.1.1 Phân lập vi khuẩn Từ rễ thân, trái Diệp hạ châu thu thập từ số xã địa bàn huyện Lai Vung – Đồng Tháp 13 dòng vi khuẩn phân lập Các dòng vi khuẩn phân lập ròng,

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -----  ----- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS AMARUS L.) MỌC HOANG TẠI LAI VUNG – ĐỒNG THÁP CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIÊP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN BÁ TÂN MSSV: 3103985 LỚP: VSVH K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Bá Tân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Trong quá trình tham gia học tập khóa học chuyên ngành Vi Sinh Vật Học– Trường Đại Học Cần Thơ đến nay tôi đã hoàn thành khóa học và đặc biệt là trong quá trình làm luận văn, tôi luôn được sự hỗ trợ về mặt tinh thần và vật chất từ gia đình Thầy Cô và bạn bè giúp tôi vượt qua những khó khăn và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến: PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh Học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần thơ, thầy hướng dẫn đề tài đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt những phương pháp nghiên cứu mới và các kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu. Quý Thầy Cô trong Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt đề tài luận văn. Cô Nguyễn Thị Pha đã quan tâm, động viên tôi trong suốt thời gian làm cố vấn học tập. Gia đình, các bạn cùng lớp Vi Sinh Vật k36 và các bạn thực hiện đề tài cùng Thầy hướng dẫn đã động viên và chia sẽ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý thầy cô và tất cả bạn bè của tôi. Cần Thơ,ngày 25 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Bá Tân Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Trường ĐHCT iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Diệp hạ châu thuộc họ thầu dầu, mọc hoang thường được sử dụng như một vị thuốc nam. Từ hai mẫu Diệp hạ châu thu ở huyện Lai Vung- Đồng Tháp mười ba dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường PDA. Đa số các dòng vi khuẩn này thuộc gram âm và có khả năng chuyển động. Kết quả khảo sát khả năng cố định NH4+ và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy các dòng vi khuẩn này có thể tổng hợp được một lượng IAA và NH4+ nhất định sau 2 ngày chủng. Tám dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn trên 2 chủng vi khuẩn Escherichia coli và Aeromonas hydrophila. Cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được trên hai chủng vi khuẩn thử nghiệm không giống nhau trong đó 5/13 dòng có hoạt tính kháng khuẩn Aeromonas hydrophila và 1/13 dòng có tính kháng khuẩn Escherichia coli. Kết quả giải trình tự gene 16S rRNA cho thấy dòng vi khuẩn triển vọng T08 được định danh là Bacillus subtilis với độ tương đồng 96%. Từ khóa: ammonium, cây Diệp hạ châu, hòa tan lân, IAA, kháng khuẩn, vi khuẩn nội sinh Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ..................................................................................................... LỜI CẢM TẠ............................................................................................................... TÓM LƯỢC................................................................................................................i MỤC LỤC..................................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................vi TỪ VIẾT TẮT .........................................................................................................vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU.......................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề .....................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:.....................................................................2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...................................................................3 2.1 2.2 2.3 Sơ lược về Đồng Tháp...................................................................................3 2.1.1 Địa lý hành chính ...................................................................................3 2.1.2 Điều kiện tự nhiên ..................................................................................3 2.1.3 Tổng quan về huyện Lai Vung................................................................4 Sơ lược về Diệp hạ châu ................................................................................6 2.2.1 Đặc điểm hình thái và phân bố ...............................................................6 2.2.2 Diệp hạ châu – Vị thuốc thần dược.........................................................7 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh..........................................................................8 2.3.1 Vi khuẩn Azospirillum............................................................................9 2.3.2 Vi khuẩn Azotobacter...........................................................................10 2.3.3 Vi khuẩn Bacillus.................................................................................10 2.3.4 Vi khuẩn Burkholderia .........................................................................13 2.3.5 Vi khuẩn Enterobacter .........................................................................14 2.3.6 Vi khuẩn Klebsiella ..............................................................................14 2.3.7 Vi khuẩn Pseudomonas ........................................................................15 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 2.4 2.5 Trường ĐHCT Một số đặt tính của vi khuẩn thử nghiệm ......................................................16 2.4.1 Escherichia coli (E.coli) .......................................................................16 2.4.2 Aeromonas hydrophila..........................................................................17 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh..........................................................18 2.5.1 Đối kháng sinh học...............................................................................18 2.5.2 Phân hủy sinh học ................................................................................19 2.5.3 Sản phẩm từ vi khuẩn nội sinh..............................................................19 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................20 3.1 Thời gian và địa điểm..................................................................................20 3.2 Phương tiện nghiên cứu...............................................................................20 3.3 3.2.1 Dụng cụ................................................................................................20 3.2.2 Thiết bị.................................................................................................20 3.2.3 Nguyên vật liệu ....................................................................................20 3.2.4 Hóa chất và môi trường ........................................................................21 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................23 3.3.1 Phương pháp phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh................................23 3.3.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn..................24 3.3.3 Đo kích thước tế bào vi khuẩn..............................................................24 3.3.4 Nhuộm Gram vi khuẩn .........................................................................25 3.3.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập……. ............................................................................................................26 3.3.6 Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập……. ............................................................................................................28 3.3.7 Đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan .................................................29 3.3.8 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được:..........................................................................................................................30 3.3.9 Nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được.........................................30 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................32 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ...........................................................................32 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.1.1 Phân lập vi khuẩn .................................................................................32 4.1.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập được. 34 4.1.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn trên môi trường PDA....................................35 4.2 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn................36 4.3 Khả năng tổng hợp IAA ở các dòng vi khuẩn ..............................................38 4.4 Đặc điểm vi khuẩn hòa tan lân khó tan ........................................................39 4.5 Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được......................40 4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh ........................................45 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................47 5.1 Kết luận.......................................................................................................47 5.2 Đề nghị........................................................................................................47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................48 PHỤ LỤC..................................................................................................................... Phụ lục 1 : Kết quả Phụ lục 2 : Các hình ảnh Phụ lục 3 : Kết quả phân tích thống kê Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Công thức môi trường PDA .......................................................................... 21 Bảng 2: Thành phần môi trường LB........................................................................... 21 Bảng 3. Công thức môi trường Burk’s N-free (Park et al., 2005) ............................... 22 Bảng 4. Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal., 1999)........................................... 22 Bảng 5: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA....................... 33 Bảng 6: Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA sau 24 giờ cấy .................................................................................................................................. 34 Bảng 7: Đặc tính vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA ......................................... 36 Bảng 8: Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn............................................... 37 Bảng 9: Khả năng tổng hợp IAA ở các dòng vi khuẩn phân lập ................................ 38 Bảng 10: Độ hữu hiệu hòa tan lân của các dòng vi khuẩn ......................................... 40 Bảng 11: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn............................................ 41 Bảng 12: Khả năng kháng vi khuẩn E.coli của các dòng vi khuẩn.............................. 41 Bảng 13: Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn ... 42 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Cây Diệp hạ châu thân xanh.......................................................................... 7 Hình 2: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens............................................................... 16 Hình 3: Đường chuẩn ammonium .............................................................................. 27 Hình 4: Đường chuẩn IAA......................................................................................... 29 Hình 5: Vi khuẩn phát triển hình thành vòng pellicle sau 2-3 ngày chủng .................. 32 Hình 6: Khuẩn lạc phát triển trên môi trường PDA .................................................... 35 Hình 7: Vi khuẩn có Gram âm hình A và Gram dương hình B................................... 36 Hình 8: Vòng sáng halo do vi khuẩn hòa tan lân tạo ra .............................................. 39 Hình 9: Khả năng ức chế sự phát triển của E.coli ...................................................... 43 Hình 10: Khả năng ức chế sự phát triển của Aeromonas hydrophila .......................... 43 Hình 11: Hiệu quả hoạt tính kháng khuẩn Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn .................................................................................................................................. 44 Hình 12: Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn 16S rRNA của dòng vi khuẩn T08.................................................................................................................. 45 Hình 13: Mức độ tương đồng của dòng T08 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu NCBI ......................................................................................................................... 45 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool DNA Deoxyribo Nucleic Acid ĐK Đường kính E.coli Escherichia coli IAA Indole–3–Acetic Acid LB Luria – Bertani OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar RNA Ribonucleic Acid Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Diệp Hạ Châu là tên thường gọi của 2 cây Phyllanthus amarus và Phyllanthus niruri thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Nghiên cứu của Viện Dược liệu Việt Nam (1987-2000) cho thấy 2 loài Phyllanthus này đều có tại Việt Nam và đều có flavonoid, tannin, acid hữu cơ. Trong thực tế, các nhà khoa học cho rằng nó chỉ là một loại cây với tên gọi khác nhau mà thôi. Gọi là Diệp hạ châu vì cây có nhiều trái nhỏ hình tròn giống như hạt ngọc (châu) mọc bên dưới (hạ) các lá (diệp). Người dân Việt Nam đã quen thuộc dưới tên gọi dân dã là chó đẻ răng cưa hoặc mỹ miều hơn là Diệp hạ châu (ngọc dưới lá). Những cây thuốc cùng họ Euphorbiaceae cũng được tìm thấy ở nhiều quốc gia trên thế giới, và người ta cho rằng đây là một thảo dược phổ biến ở các nước nhiệt đới. Tại Ấn Ðộ, theo mô tả của các nhà khoa học, cây thuốc này có thể cao từ 30-60cm và có hoa màu vàng. Ngoài ra còn được tìm thấy ở các nước khác như Trung Quốc (Phyllanthus urinaria), Cu Ba, Nigeria, Guam, Philippines... Toàn bộ cây được sử dụng làm thuốc, có tác dụng giảm đau, chữa viêm gan... Các nhà khoa học đã chứng minh đây là một cây thuốc mang lại nhiều ích lợi cho sức khỏe con người. So sánh với kháng sinh tổng hợp, có thể thấy các cây thuốc kháng sinh tuy hiệu lực kháng khuẩn không mạnh bằng nhưng cũng đủ để chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn. Không những thế, chúng còn có nhiều ưu điểm mà thuốc kháng sinh tổng hợp không có. Một trong những vấn đề đó là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình hình lạm dụng kháng sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Đây là chuyện nan giải đối với kháng sinh tổng hợp hiện nay, nhưng đối với kháng sinh thực vật người ta chưa thấy hiện tượng này. Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Diệp hạ châu, Sài đất (Wedelia calendulacea, Less), cây Giấp Cá (Houttuynia cordata, Thunb)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton như methyl n-nonyl ceton, Ldecanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α-pinen, camphen,... Có tác Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006). Tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dược liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng tốt. Ngoài ra chúng còn có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) nhưng chúng cũng có khả năng kích thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất biến dưỡng trung gian như ở cây dược liệu chúng có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Kaul et al., 2008). Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella…Đề tài ”Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.) mọc hoang tại Lai Vung – Đồng Tháp” để tuyển chọn những dòng vi khuẩn nội sinh có ích cho sự phát triển của cây đặc biệt là đặc tính kháng khuẩn ứng dụng trong lĩnh vực y học. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diệp Hạ Châu có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về Đồng Tháp 2.1.1 Địa lý hành chính Đồng Tháp là tỉnh thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long, cách TP Hồ Chí Minh 165km về phía Tây Nam. Hai nhánh sông Cửu Long chảy qua tạo nên hệ thống giao thông thủy thuận lợi. Hai bến cảng nằm bên bờ sông Tiền giúp vận chuyển hàng hóa thuận tiện với biển Đông và nước bạn Campuchia, là “cửa ngõ” của vùng nguyên liệu, nông, thủy sản, thực phẩm. 2.1.2 Điều kiện tự nhiên Là một tỉnh thượng nguồn sông Cửu Long, Đồng Tháp có thế mạnh về nông nghiệp và thủy sản, sản lượng lương thực bình quân hàng năm trên 2,6 triệu tấn phục vụ tiêu dùng và xuất khẩu. Có nhiều loại cây trái nổi tiếng như: Nhãn Châu Thành, bưởi Phong Hòa, xoài Cao Lãnh, quýt hồng Lai Vung… Đặc biệt hoa kiểng với trên 298 ha và hàng trăm loại hoa và kiểng quý cung cấp cho cả nước và xuất khẩu. Nghề nuôi thủy sản phát triển mạnh nhất là cá tra và tôm càng xanh, hàng năm cung cấp cho chế biến xuất khẩu trên 250.000 tấn cá và trên 2.000 tấn tôm càng xanh. Đồng Tháp có khí hậu ấm áp quanh năm. Nhiệt độ trung bình là 27,46 oC; tháng có nhiệt độ trung bình cao nhất là 29,10 oC (tháng 4), tháng có nhiệt độ trung bình thấp nhất là 25,20oC (tháng giêng); nhiệt độ lúc cao nhất là 37oC (tháng 5) và thấp nhất là 18oC (tháng giêng). Đồng Tháp là vùng hạ lưu, chịu ảnh hưởng của chế độ thủy văn sông Mê-Kông (Cửu Long), đồng thời cũng chịu chế độ “bán nhật triều” của Vịnh Thái Lan. Chế độ thủy văn, gồm 3 thời kỳ:  Thời kỳ lũ lên: Từ giữa tháng 5 đến đầu tháng 8.  Thời kỳ lũ chính: Từ giữa tháng 8 đến thánh 10.  Thời kỳ lũ rút: Từ tháng 11 năm này đến tháng 4 năm sau Từ lâu, người dân Đồng Tháp đã tận dụng khai thác những lợi thế chế độ thủy văn phục vụ cho quá trình dựng bờ, giữ cõi, xây dựng và bảo vệ Tổ quốc (chống xâm lược, khai thác tiềm năng sông Tiền, sông Hậu và Đồng Tháp Mười, phù sa bồi đắp Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT ruộng đồng; đào kinh, rửa phèn; đánh bắt, nuôi trồng thủy sản,…), tạo sắc thái riêng của cư dân miền sông nước. Đất đai Đồng Tháp nằm hai bên bờ sông Tiền, Phía Bắc của Sông Hậu, với diện tích là 3,374 km 2 Đất đai ở Đồng Tháp chia làm bốn nhóm lớn:  Nhóm đất xám: Diện tích 26.727,8 ha; tập trung ở Tân Hồng, Tam Nông và một ít ở Hồng Ngự; phần lớn không bị ngập hoặc ngập nông vào mùa lũ; có độ cao khoảng 2,5-3,5 m; gồm đất xám bạc màu, đất xám điển hình, đất xám đọng mùn và đất xám nhiễm phèn.  Nhóm đất giồng: 243 ha; ở Động Cát, Gò Tháp  Nhóm đất phù sa: Diện tích 152.219,6 ha (chiếm 46,72% diện tích của Tỉnh); đây chính là vùng vườn cây ăn trái của Tỉnh, với 21.247 ha, tập trung ở các huyện, thị Nam Sông Tiền, như Vườn Hồng Sa Đéc, quít hồng nổi tiếng ở Lai Vung, nhãn Châu Thành, xoài Cao Lãnh,...  Nhóm đất phèn: Diện tích khoảng 146.672 ha (45,01%); phân bố các huyện vùng sâu của Tỉnh. 2.1.3 Tổng quan về huyện Lai Vung Huyện Lai Vung nằm ở phía nam của tỉnh Đồng Tháp, trong vùng kinh tế trọng điểm phía nam của tỉnh (vùng Sa Đéc). Với diện tích tự nhiên là 238km2, dân số gần 166.000 người (năm 2008). Huyện Lai Vung bao gồm 11 xã và 1 thị trấn:  Thị trấn Lai Vung  Xã Định Hòa  Xã Hòa Long  Xã Hòa Thành  Xã Long Hậu  Xã Long Thắng  Xã Phong Hòa  Xã Tân Dương Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT  Xã Tân Hòa  Xã Tân Phước  Xã Tân Thành  Xã Vĩnh Thới Huyện Lai Vung có vị trí quan trọng giữa sông Tiền và sông Hậu; nằm kề với khu công nghiệp Sa Đéc, ngang khu công nghiệp Trà Nóc (Cần Thơ) và tiếp giáp với các trung tâm đô thị lớn của vùng như thành phố Cần Thơ, thành phố Long Xuyên (An Giang) thuận lợi cho việc thu hút đầu tư phát triển. Huyện Lai Vung là huyện thuộc vùng ngập nông, nguồn nước ngọt dồi dào, đất đai màu mỡ thuận lợi cho việc phát triển nền sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa cây trồng, vật nuôi đem lại hiệu quả kinh tế cao. Có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển một nền kinh tế toàn diện. Đặc điểm địa chất: huyện Lai Vung có mẫu chất đơn giản tạo cho huyện một quỹ đất tương đối đồng nhất. Huyện có các mẫu chất:  Đặc điểm địa chất huyện Lai Vung mang cấu trúc chung của tỉnh Đồng Tháp cũng như vùng Đồng bằng sông Cửu Long, là loại trầm tích trẻ sông biển.  Loại đất được hình thành từ trầm tích sông, phân bố ven sông lớn hình thành đất phù sa chiếm hầu hết diện tích trong huyện. Khí hậu có đặc điểm chung của tỉnh Đồng Tháp, chịu ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới gió mùa gần xích đạo. Thủy văn chịu tác động của 3 yếu tố: Lũ, mưa và thủy triều biển đông, hàng năm hình thành 2 mùa rõ rệt: Mùa lũ trùng hợp với mùa mưa và mùa kiệt trùng với mùa khô. (http://www.tiepthinongsanviet.org.vn) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 2.2 2.2.1 Trường ĐHCT Sơ lược về Diệp hạ châu Đặc điểm hình thái và phân bố A. Mô tả cây Cây Diệp hạ châu là một loại cỏ mọc hằng năm, cao chừng 30cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành, thường có màu đỏ. Lá mọc so le, lưỡng lệ trong như lá kép, phiến lá thuôn, dài 5-15mm, rộng 2-5mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép nguyên nhưng như hơi có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới màu lơ xanh, không cuống hay có cuống rất ngắn. Hoa mọc ở kẽ lá, nhỏ, màu nâu đỏ, đơn tính, hoa đực, hoa cái cùng gốc ở đầu cành, cái ở dưới, Hoa không cuống hoặc có cuống rất ngắn. Đường kính trái có thể đạt tới 2mm, treo lủng lẳng dưới lá, do đó có tên diệp hạ châu: vì cây có nhiều trái nhỏ hình tròn giống như hạt ngọc (châu) mọc bên dưới (hạ) các lá (diệp) nghĩa là ngọc dưới lá. Trái ba cạnh, hình trứng, màu nâu nhạt, có vân ngang. Có 3 loại Diệp hạ châu: Cây Diệp hạ châu thân xanh (Diệp hạ châu đắng) Phyllanthus niruri (tên đồng nghĩa Phyllanthus amarus): Toàn thân có màu xanh tươi, cành ngắn, rất ít phân nhánh, phiến lá có màu xanh nhạt, ngắn và mỏng hơn Diệp hạ châu thân đỏ. Khi nhai có vị đắng nên trong đông y được gọi là cây Diệp hạ châu đắng. Cây Diệp hạ châu thân đỏ (Diệp hạ châu ngọt) Phyllanthus urinaria: Thân có màu hanh đỏ và màu thường đậm nơi gốc cành, phân nhánh rất nhiều, phiến lá có màu xanh hơi đậm, dài và dầy hơn cây Diệp hạ châu thân xanh. Khi nhai có vị ngọt nên trong đông y được gọi là cây Diệp hạ châu ngọt. Một loài Diệp hạ châu nữa Phyllanthus sp. có màu xanh đậm, lá rời rạc, phiến lá hẹp và chóp nhọn hơn so với hai loài trên. Loài này không được dùng làm thuốc. B. Phân bố, thu hái và chế biến Cây Diệp hạ châu răng cưa mọc hoang ở khắp nơi trong nước ta cũng như ở khắp các nước vùng nhiệt đới. Người ta dùng toàn cây hái về làm thuốc. Mùa hái quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa hạ. Thường dùng tươi có khi phơi khô. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT C. Thành phần hoá học Trong loài Phyllanthus discoides Muell-Arg. Có Phyllanthin C14H17O2N, phyllantin C13H15O3N (Manske R.H.F: The Alkaloits Chemistry and physiology XIV1973, 428) và phyllantidin C13H34O2N (Horii Z et al Tetrahedron Letters 1972, 1877) Trong loài Phylathus niruri L có phyllanthin C24H34O6, hypophyllanthin C24H30O7 niranthin C24H32O7, nirtetralin C24H30O7 và phylteralin C24H34O6 (a njaneyulu A.S et al Telrahedron 1973, 29, 129) Hình 1: Cây Diệp hạ châu thân xanh Nguồn: http://www.tienduoc.com/diep-ha-chau/290-cay-qcho-deq-diep-ha-chauvi-thuoc-dan-gian-va-duoc-lieu-quy-.htmL, (ngày 17/7/2013) 2.2.2 Diệp hạ châu – Vị thuốc thần dược Một nghiên cứu được tiến hành tại trường Ðại học Dược Santa Catarina (Brazil) vào năm 1984 về Diệp hạ châu đã phát hiện có một alkaloid là phyllanthoside. Alkaloid này có tác dụng chống co thắt mạnh. Phyllanthoside có tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn. Những Alkaloid của Phyllanthus có tác dụng làm giãn cơ, đặc biệt là đối với cơ quan bài tiết. Các nhà nghiên cứu phỏng đoán nó có tác dụng làm mòn sỏi ở đường tiết niệu (thận và bàng quang). Nghiên cứu của Nhật Bản và Ấn Ðộ trong năm 1980 đã xác định những tác dụng điều trị của Diệp hạ châu đối với bệnh gan là do tác dụng của các hoạt chất phyllanthin, hypophyllathin và triacontanal. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Trong một ghi chú đặc biệt, cuối những năm 1980, Break Stone đã gây được sự chú ý đối với toàn thế giới về tác dụng chống virus viêm gan B của cây thuốc này. Những thử nghiệm lâm sàng trên trẻ em với bệnh viêm gan truyền nhiễm bằng một thuốc chứa Phyllanthus amarus của Ấn Ðộ đã cho kết quả hứa hẹn trong cả In vivo và In vitro. Nghiên cứu In vitro về sự ức chế virus viêm gan B của Break Stone được báo cáo tại Ấn Ðộ vào năm 1982. Trong nghiên cứu trên In vivo, Break Stone cũng đã loại trừ virus gây bệnh viêm gan B ở những động vật có vú trong 3-6 tuần. Virus viêm gan B không chỉ tồn tại trong giai đoạn cấp tính mà còn tồn tại trong cơ thể và có thể gây ung thư gan. Các nghiên cứu cho thấy có tới 90% bệnh nhân bị ung thư gan đã từng mắc bệnh viêm gan virus B và đây quả là một điều đáng sợ! Phyllanthus niruri và Phyllanthus amarus đã cho thấy các dược chất tự nhiên không độc mà nó chứa đựng có tác dụng đối với virus viêm gan B. Cây thuốc này còn có tác động tới cả hệ thống miễn dịch của cơ thể. Khi mà AIDS trở thành đại dịch nguy hiểm trên thế giới và cho tới nay việc điều trị vẫn còn là một thách thức đối với khoa học, thì những nghiên cứu gần đây nhất của Break Stone đã phát hiện tác dụng chống virus HIV của cây thuốc này. Vào năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã khám phá tác dụng ức chế sự phát triển HIV-1 của Phyllanthus niruri thông qua sự kìm hãm quá trình nhân lên của virus HIV với cao lỏng của cây thuốc. Trong một nghiên cứu khoa học được tiến hành vào năm 1996, Viện nghiên cứu Dược học Bristol Myezs Squibb cũng đã chiết xuất được ít nhất một hoạt chất có tác dụng này và người ta đã đặt tên nó là "Nuruside". (http://www.ykhoa.net/yhoccotruyen/baiviet/29_282.htm) 2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian của chu kỳ sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Kobayashi và Palumbo, 2000; Bandara, 2006). Nó có giá trị trong nông nghiệp như một công cụ thực hiện cải tiến mùa màng (Muthukumarasamy et al., 2002). Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotobacter, Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Bacillus, Beijerinckia, Derxia, Trường ĐHCT Enterobacteriaeae (Klebsiella, Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên, nó cũng có thể xâm nhập vào các mô thông qua khí khẩu hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel et al., 2002), thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari et al., 1988). Hiện nay các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt như vi khuẩn có khả năng cố định nitơ trong không khí (Xu et al., 1998), tổng hợp kích thích tố auxin (Barbieri et al., 1986), giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường (Rosenblueth và Martinez, 2006), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh (Fahey et al., 1991), hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007). 2.3.1 Vi khuẩn Azospirillum Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau. Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum (Tarrand et al., 1978). Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980). Vi khuẩn Azospirilum là vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ, vùng đất xung quanh rễ, thân và lá của cây. Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinh với rễ của các loại ngũ cốc, các loại cây cỏ và cây có củ (Döbereiner et al., 1995). Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng hình que ngắn; kích thước biến thiên trong khoảng 0,8-1,7μm chiều rộng và 1,4 3,7μm chiều dài (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Từ đó đến nay, người ta đã phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn Azospirilum có khả năng cố định đạm tự do hoặc kết hợp với vùng rễ của cây họ hòa bản, đặc biệt vùng rễ của cây cỏ nhiệt đới, lúa nước, mía, ngô, lúa mì (Boddy et al., 1995)… Ngoài ra, Nguyễn Hữu Hiệp et al., (2005) cũng tìm ra dòng vi khuẩn Azospirilum cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu. Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra 7 nhóm vi khuẩn Azospirilum: Azospirilum lipoferum, Azospirilum brasilense (Tarrand et al., 1978); Azospirilum amazonese (Magalhase et al., 1983); Azospirilum halopraeferrans (Reinhold et al., 1987); Azospirilum irkense (Khanmas et al., 1989); hai loài còn lại là Azospirilum doebereinerae và Azospirilum largomobile Dekhil et al., (1997). Chúng có những đặc điểm chung như: là vi khuẩn Gram âm, hình que cong hay chữ S, chiều rộng 1,0 – 1,5µm, sinh trưởng tốt ở 30oC và pH từ 6,0 – 7,0 (Bashan et al., 2004). Azospirilum có thể chuyển động được trong môi trường lỏng nhờ có những chiên mao dài ở một đầu (polar flagellum) tế bào (Đào Thanh Hoàng, 2005). 2.3.2 Vi khuẩn Azotobacter Azotobacter là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que đầu tròn (rods with rounded ends) đến hình trái xoan (ellipsoidal) hoặc hình cầu (coccoid), hình dạng của chúng tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy và thời gian nuôi cấy. Azotobacter có khả năng di động với tiêm mao (flagella) hoặc không di động. Sự sắp xếp của tiêm mao có rất nhiều tranh cãi nhưng theo quan sát của Hofer, Krasilnikov và cộng sự bằng kính hiển vi thì hầu hết Azotobacter có lông roi nằm ở bên; ngoại trừ A. insique có tiêm mao nằm ở một cực. Azotobacter phát triển và cố định đạm tốt nhất ở pH trung tính, chúng có thể phát triển trên môi trường với khoảng pH từ 4,5-5,5 đến 9,0 (Gül Fidan Saribay, 2003), Azotobacter là vi khuẩn điển hình sống trong môi trường có nhiệt độ vừa phải (mesophillic). Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và cố định đạm của Azotobacter nằm trong khoảng 25 – 30oC (Mishustin và Shilnikova, 1969). Nhiệt độ tối thiểu cho sự tăng trưởng của Azotobacter nằm trên 0oC một chút. 2.3.3 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 10 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N. Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65 oC (Rosovitz et al., 1998). Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, … Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: 2.3.1 Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn gram dương, hình que, di động, kích thước 0,7-0,9 x1,8-3m, nội bào tử (0,6-0,8 x 1-1,4m), là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH=7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ giới hạn 15-50 o C, nhiệt độ tối ưu 30-40 oC. 2.3.3.2 Bacillus cereus Đây là loài có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)µm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 –1,5)µm Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 11 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Theo nghiên cứu của Swetha Sunkar và C Valli Nachiyar (2012) trên cây bứa mủ vàng (Garcinia xanthochymus), Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng vi khuẩn E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi và Klebsiella pneumonia. 2.3.3.3 Bacillus subtilis Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 .Chúng được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bịu. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính acid ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 –5) x 0,6 µm. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi. Khuẩn lạc khô, không màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36oC –50oC, tối đa khoảng 60oC. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6–0,9µm. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200-300 năm (Nguyễn Thành Đạt, 1990). Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 12 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT amin, subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV). Đặc biệt, B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật –một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe (Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007). 2.3.3.4 Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa là vi khuẩn gram dương, có khuẩn lạc không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhầy, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6) µm, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kiềm và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymycin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược. 2.3.4 Vi khuẩn Burkholderia Vi khuẩn Burkholderia sống ở vùng rễ của nhiều loại cây khác nhau; các vi khuẩn thuộc giống Burkholderia được phân lập từ vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như bắp, mía, cà phê, lúa, cỏ... Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm như khi các vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây lúa sẽ cố định đạm đến 19% tổng lượng đạm cần thiết cho nhu cầu của cây lúa, cũng như năng suất cây lúa có chủng loài Burkholderia vietnamiensis tương đương với năng suất của cây lúa không chủng loài Burkholderia vietnamiensis nhưng có bón phân đạm 25 – 30 kg/ha. Burkholderia là vi khuẩn gram âm, hình que, đường kính khoảng 1 µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Jesus et al., 2004). Vi khuẩn Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng trong môi trường ít khí thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi cấy từ 1- 4 mm (Paulina et al., 2001). Trong môi trường nuôi cấy chúng tạo thành những khuẩn lạc trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2 – 4 mm tròn phẳng hoặc lài (Jesus et al., Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 13 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2004). Vi khuẩn Burkholderia có bộ gen lớn nhất so với các loài vi khuẩn trong đất đã được biết đến có tiềm năng quan trọng trong hệ sinh thái và thương mại cho xử lý sinh học, trình tự bộ gen Burkholderia sẽ đóng vai trò quan trọng trong các cơ chế bảo vệ môi trường. Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu nhiệt đới (Mounlin et al., 2001). Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella et al., 2003; Chen et al., 2006). Hiện nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia ( Martinez – Aguilar et al., 2008) bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, rễ cây, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây (Coenye và Vadnamme, 2003; Osulliva và Mahenthiralingam, 2005). 2.3.5 Vi khuẩn Enterobacter Vi khuẩn cũng thuộc nhóm γ–proteobacteria, hầu hết vi khuẩn gram âm, có hình que, sống kỵ khí không bắt buộc một số loài vi khuẩn này sống vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng tổng hợp ammonium và có khả năng kích thích sự sinh trưởng thực vật. Theo Sariah et al. (2012) thử nghiệm khả năng tạo IAA và có khả năng hòa tan phosphate của dòng Enterobacter gergovie trên hạt lúa cùng với một số dòng vi khuẩn khác. Yolanda et al. (2011) khảo sát dòng Enterobacter để tăng hiệu quả trong nông nghiệp bền vững, tất cả các dòng vi khuẩn được khảo sát điều có khả năng tổng hợp ammonium, IAA và hòa tan lân khó tan. 2.3.6 Vi khuẩn Klebsiella Vi khuẩn thuộc nhóm γ–proteobacteria, vi khuẩn gram âm, hình que, không hay ít di chuyển sống kỵ khí không bắt buộc có hai loài quan trọng đó là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống tự nhiên trong cây. Vi khuẩn này được phân lập và nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA trên vùng rễ nhiều loài thực vật như mía (Govindarajan et al., 2007), đậu nành (Kuklinsky et al., 2004). Do có khả năng tổng hợp IAA nên vi khuẩn Klebsiella giúp tăng chiều dài rễ và chồi thực vật (Sachev et al., 2009). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 14 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 2.3.7 Trường ĐHCT Vi khuẩn Pseudomonas Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học. Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae (Glickmann et al., 1998; Suzuki et al., 2003; Xie et al., 1996). Chúng có khả năng phân giải phosphat. Trong rác ủ, phospho tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác nhau. Phospho được tích lũy trong rác khi động thực vật chết đi, những hợp chất phospho hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất phospho vô cơ khó tan. Do đó phospho tồn tại ở hai dạng: phospho hữu cơ và phospho vô cơ. Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi: Bacillus và Pseudomonas. Các loài có khả năng hòa tan mạnh là B. megatherium, B. mycoides và Pseudomonas sp. Trong số các loài Pseudomonas spp., P. fluorescens là được chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004). Pseudomonas fluorescens: Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram âm, có đơn hoặc tùng mao, sống hiếu khí bắt buộc nhưng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào. Chúng có cơ chế trao đổi chất cực kỳ linh hoạt giúp chúng sống được cả trong đất và trong nước. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25-30oC. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 15 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Hình 2: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (*Nguồn:http://www.quorumtech.com/image-gallery/low-angle-rotary-shadowing-images, ngày 20/07/2013) Đến nay, người ta vẫn chưa biết được chính xác cơ chế kiểm soát sinh học của Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết được đưa ra như sau: thứ nhất người ta cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự. Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe. Cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn như các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide. Theo Sivamani et al., (1987) vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể được dùng như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây bệnh héo moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris. 2.4 Một số đặt tính của vi khuẩn thử nghiệm 2.4.1 Escherichia coli (E.coli) Escherichia coli (E.coli) trước đây gọi là Bacterium coli commune hay Bacilus coli communis, lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và đặt tên theo bác sĩ nhi khoa Đức. Vi khuẩn E.coli thuộc học Enterobacteriaceas, vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh đường ruột và các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 16 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Vi khuẩn E.coli có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 40oC, nhiệt độ thích hợp nhất là 37oC, pH thích hợp nhất là 7,2 – 7,4 phát triển được pH từ 5,5 – 8. E.coli có thể phát triển trên môi trường thông dễ dàng, một số chủng có thể phát triển trên môi trường tổng hợp nên người ta chọn chúng để nghiên cứu về sinh vật học ( Nguyễn Như Thanh, 1997). Trong điều kiện bình thường vi khuẩn E.coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn vi khuẩn bội nhiễm đường tiêu hóa và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). Vi khuẩn E.coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra. + Nhóm độc tố đường ruột (Enterotoxin): gồm hai loại độc tố chịu nhiệt (gồm hai loại là STb có vai trò quan trọng trong gây bệnh tiêu chảy do các chủng E.coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh) (Carter et al., 1995) và độc tố không chịu nhiệt LT ( LT là một trong những yếu tố gây triệu chứng tiêu chảy quan trọng) (Faibrother et al., 1992). + Nhóm độc tố tế bào (Shiga/Verotoxin): nhóm độc tố này được trong môi trường nuôi cấy tế bào Vero, được sản sinh bởi vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy và bệnh phù đầu ở lợn con ( Konowalchuck et al., 1997). Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn E.coli có khả năng kháng lại một số lạo kháng sinh như: Amoxicillin, Chloramphenicol, Trimethroprim, Tetracyclin, Streptomycin ( Đỗ Ngọc Thúy et al., 2002). Để điều trị bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli sử dụng phương pháp kháng sinh đồ. 2.4.2 Aeromonas hydrophila Trong giống Aeromonas có 2 nhóm, (1) loài vi khuẩn không di động (A. Salmonicida) thường gây bệnh ở các nước lạnh, (2) các loài vi khuẩn di động bao gồm (A. hydrophila, A. caviae, A. sobria), đặc tính chung của của 3 loài vi khuẩn này là di động nhờ có một tiêm mao, vi khuẩn hình que, Gram âm, hai đầu tròn, phản ứng Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 17 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT oxidase dương tính, khử nitrat. Các loài vi khuẩn Aeromonas di động đều được phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là A. hydrophila (Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008). Theo Lewis và Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên, theo Anhka (1990). A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80-90% ( Ngô Minh Dung, 2007). Đỗ Thị Hòa et al., (2004) bệnh nhiễm trùng do A. hydrophila thường gặp ở nhiều loại thủy sản nước ngọt ở nhiều nước khác nhau như Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Úc,.... Ở Việt Nam, các loại cá nuôi lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều có thể bị bệnh như: cá trắm cỏ, cá tra, cá basa, cá chép, cá trê....Tỷ lệ tử vong thủy sản thường từ 30-70%, bệnh xảy ra ở các giai đoạn khác nhau trong quá trinh sinh trưởng. Bệnh do A. hydrophila ở nước ta có thể xuất hiện quanh năm, nhưng thường tập trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bện xuất hiện nhiều vào đầu màu mưa, mùa có nhiệt độ 25-28oC. Tại Việt Nam, Nguyễn Trung Cấp - Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung Ương cho biết từ năm 2009-2013 có hàng chục ca nhiễm A. hydrophila được ghi nhận, trong đó những trường hợp nhiễm bệnh khi làm việc dưới nước bị đứt chân, tay. Cá biệt có người bắt cá bị ngạnh cá đâm vào tay và nhiễm bệnh. Trước đây có một số bệnh nhân nhiễm A. hydrophila, bị hoại tử da tay, chân nặng nề nhưng sau điều trị và được vá da, hiện bệnh nhân rất khỏe mạnh. Cách phòng bệnh: tốt nhất là nên tránh lội vào vùng nước có bùn, nước nhiễm bẩn khi có vết xước ở tay chân mà không có phương tiện bảo hộ. Người làm nghề đặc thù như làm việc trên bè cá tôm, bè tre nứa, công nhân vệ sinh... nên trang bị đủ phương tiện bảo hộ cá nhân. Không nên chơi đùa ở vũng nước có bùn bẩn. 2.5 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 2.5.1 Đối kháng sinh học Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các sinh vật gây hại; điều này có thể dẫn đến hiện tượng gia tăng kháng bệnh (ISR = induced systemic resistance) hay kích kháng (SAR = systemic-acquired resistance). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 18 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc ngăn chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum trên bông vải (Chen et al., 1995); nấm Fusarium oxysporum f. sp. pisi trên đậu pea (Benhamou et al., 1996)… 2.5.2 Phân hủy sinh học Siciliano et al., (2001) ghi nhận cây trồng phát triển tốt trong đất nhiễm các hóa chất độc hại có vi khuẩn nội sinh trong cây chứa những gen có khả năng phân hủy độc chất này. Thực tế cho thấy nhiều cánh đồng nhiễm nitro-acromatics và những vi khuẩn nội sinh trong cây trồng tại đây chứa những gen phân hủy nitro-acromatics, những vi khuẩn nội sinh còn tồn tại trong đất vùng rễ của cây trồng hay có trong đất (Ryan et al., 2008). Theo Van Aken et al., (2004) những dòng vi khuẩn cộng sinh thực vật như Methylbacterium phân lập từ cây Polar lai (Populus deltoids x nigra), cũng có khả năng phân hủy nitro-acromatics như 2,4,6-trinitro-toluene. Sự phát hiện những vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy sinh học giúp cho chúng ta có thể sử dụng trực tiếp như là các chế phẩm sinh học phân hủy độc chất hay cắt chuyển gen có khả năng phân hủy độc chất vào những vi khuẩn khác và dùng chúng để làm sạch môi trường… 2.5.3 Sản phẩm từ vi khuẩn nội sinh Nhiều giống vi khuẩn nội sinh như Pseudomonas, Burkholderia và Bacillus (Lodewyckx et al., 2002) được biết là những loài trong những giống vi khuẩn tổng hợp ra nhiều sản phẩm thứ cấp bao gồm các kháng sinh, chất kháng ung thư, hợp chất hữu cơ thơm, kháng nấm, kháng virus, kháng sâu……và những sản phẩm thứ cấp này được trích ly từ sự lên men của những loài vi khuẩn này (Ryan et al., 2008). Hiện nay hầu hết các nghiên cứu tập trung vào chế phẩm kháng nấm có trọng lượng phân tử nhỏ, hoạt tính cao với liều lượng nhỏ chống lại nhiều vi khuẩn gây bệnh trên người, gia súc và cây trồng như taxol (chống khối u) ở vi khuẩn nội sinh Taxomyces andreane trên cây Taxus brevifolia (Strobel et al., 1993), Oocydin A (kháng nấm) từ vi khuẩn Serratia marcescens trên cây Rhyncholacis penicilata (Strobel et al., 2004), Cytonic acids A và D (kháng virus) ở vi khuẩn Cytoaema sp. trên cây Quercus sp. 103 (Guo et al., 2000). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 19 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 11/2013 tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật Môi Trường thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. 3.2 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ - Đĩa petri - Que cấy, kẹp cấy - Đèn cồn - Ống đong - Micropipette - Đầu cone - Tube Eppendorf 1.5mL và 2.2mL - Cối, chày, giấy nhôm, kẹp, kéo 3.2.2 Thiết bị - Tủ cấy vô trùng - Biosafe II – ESCO (Singapore) - Nồi khử trùng nhiệt ướt - Tủ ủ vi sinh vật - Binder (Đức) - Máy ly tâm - Eppendorf - Máy vortex - Cân điện tử - Startorius (Đức) - Máy đo OD Backman Coulter - Kính hiển vi – Meji (Nhật) 3.2.3 Nguyên vật liệu Cây Diệp hạ châu được thu mẫu từ các vùng trên địa bàn huyện Lai Vung – tỉnh Đồng Tháp. Vi khuẩn E.coli được cung cấp bởi phòng Công nghệ Sinh học Phân tử thuộc Viện NC & PT Công nghệ Sinh học. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 20 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Vi khuẩn Aromonas hidrophila được cung cấp bởi Bộ môn bệnh cá khoa thủy sản – Đại học Cần Thơ. 3.2.4 Hóa chất và môi trường a) Hóa chất dùng để khử trùng mẫu - Nước cất vô trùng - Ethanol (cồn) 70% - Hydrogen peroxide (H2O2 ) 3% b) Môi trường dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh. - Môi trường dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường PDA đặc Bảng 1. Công thức môi trường PDA Hóa chất Liều lượng (g/l) Khoai tây 200 Dextrose 20 Agar 20 pH 5,6 ± 0,2 (250C) c) Hóa chất kiểm tra đặc tính sinh hóa (Sharmin và Rahman, 2007) . -Hóa chất dùng để nhuộm Gram vi khuẩn  Iod  Fushin  Crystal violet  Ethanol (cồn) 70%, Nước cất hai lần vô trùng d) Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được Bảng 2: Thành phần môi trường LB Hóa chất Liều lượng (g/l) Tryptone 10 NaCl 10 Yeast extract 5 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 21 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT e) Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh đã phân lập Bảng 3. Công thức môi trường Burk’s N-free (Park et al., 2005) Hóa chất Liều lượng (g/l) Sucrose 10 K2HPO4 0,52 MgSO4. 7H2O 0,1 CaCl2 0,2 KH2PO4 0,41 KOH 4,5 FeSO4 .7H2O 0,005 Na2MoO4 .2H2O 0,0025 Na2SO4 0,05 pH 7,0 f) Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng hòa tan lân của vi khuẩn nội sinh đã phân lập. Bảng 4. Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal., 1999) Hóa chất Liều lượng (g/l) Sucrose 10 Ca3(PO4 )2 5 MgSO4. 7H2O 0,25 KCl 0,2 MgCl2.6H2O 5 (NH4)2SO4 0,1 pH 7,0 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 22 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 3.3 Trường ĐHCT Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh pH của đất vùng rễ dao động từ 7,0 – 7,2 (phụ lục 1) - Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân, lá và trái - Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm rồi làm khô chúng bằng giấy hút ẩm. - Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% (trong 30 giây), dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Để kiểm tra vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt rễ, thân, lá và trái: hút 50µL nước cất rửa mẫu lần cuối cùng trải vào môi trường PDA và ủ ở 30 oC. Sau 24h kiểm tra xem có vi sinh vật nào phát triển không. Nếu không có vi sinh vật nào phát triển, chứng tỏ mẫu đã khử trùng bề mặt sạch và những vi khuẩn phân lập được là vi khuẩn nội sinh trong rễ, thân, lá và trái của Diệp hạ châu. - Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1mL nước cất vô trùng. - Lấy 10µL dung dịch nghiền ở trên cấy vào ống nghiệm chứa môi trường PDA bán đặc không bổ sung đạm rồi đem ủ ở 30 oC để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. - Sau khoảng 2 - 3 ngày nuôi, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 3 6mm, lấy 5µL dung dịch nuôi vùng này cấy sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30 oC trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển. - Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập đến khi vi khuẩn ròng. - Trữ vi khuẩn đã phân lập ròng trong môi trường PDA. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 23 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.3.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn. Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép, rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn: + Nhỏ 5µl nước cất vô trùng lên kính mang vật. + Khử trùng kim cấy hay kim mũi giáo khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. + Dùng kim cấy, lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. + Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45°, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí. + Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học từ vật kính 10X sang vật kính 40X, để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn. 3.3.3 Đo kích thước tế bào vi khuẩn Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong nước cất vô trùng tiếp tục đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.  Cách chuẩn bị mẫu: +Nhỏ 10µl nước cất vô trùng lên kính mang vật. +Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. +Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. +Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45°, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.  Để đo kích thước của tế bào vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính như sau: +Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính. +Thước trắc vi thị kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm, được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài là 10µm. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 24 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT  Phương pháp đo - Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh cho thấy ảnh rõ của thước. - Xê dịch thước trắc vi thị kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với 1 vạch của thước trắc vi thị kính và 1 vạch thứ 2 nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính. - Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. - Gọi N là số khoảng của thước trắc vi vật kính trùng với n là số khoảng của thước trắc vi thị kính và x là trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính thì x sẽ là: x - N *10 m n Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. Di chuyển vi mẫu sao cho 1 đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm vạch thứ 2 trùng với đầu kia của mẫu đo. - Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính nằm trong hai vạch này. - Tính kích thước của vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của 2 thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) 3.3.4 Nhuộm Gram vi khuẩn Sau khi quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn. Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau: + Lấy 10µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật. + Dùng que cấy đã khử trùng trên gnọn lửa đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật. + Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhầm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật. + Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để yên 2 phút. + Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô. + Nhỏ từ từ 1-2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy cà để trong một phút. + Rửa bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT + Rửa lại bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa + Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. + Nhỏ từ 1-2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để yên 1 phút. + Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin. + Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước. + Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002). 3.3.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập. a. Nguyên tắc Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982) b. Hóa chất: - Chuẩn bị dung dịch KCl 2M: Hòa tan 15g KCl vào trong 100mL nước cất. - Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40 mL stock (NH4+) để được 200mL, sau cùng được dung dịch 2µg/mL - Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0.5l. - Hypochloride buffer: hòa tan 15mL NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5l. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng Tiến hành thí nghiệm: Cho 15mL môi trường lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121 oC trong 20 phút. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 26 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. c. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) Phương pháp định lượng: 1. Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5l. 2. Pha buffer: cho 15mL NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5g NaOH vào 0,5g lít nước cất. 3. Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm 0 1 2 3 4 5 Hình 3: Đường chuẩn ammonium Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5mL H2O : 0mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4mL H2O : 1mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3mL H2O : 2mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2mL H2O : 3mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1mL H2O : 4mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0mL H2O : 5mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử 4. Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn Hút 1,5mL dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút 1mL dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4mL H2O, 5mL buffer, 5mL thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 27 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sóng 636 nm, sau đó vẽ đồ thị trên Excel có thể tính được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn. 3.3.6 Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập. a. Chuẩn bị - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb, New và Burk lỏng. - Cho 15 mL môi trường lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 20 phút. - Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng) b. Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) 1. Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5g FeCl3 trong 1l H2SO4 10,8M 2. Chuẩn bị phosphat buffer 200mL: A: KH2PO4 0,136g/100 mL nước cất. B: K2HPO4 0,174g/100 mL nước cất. 3. Lấy 39mL A, 61mL B cho thêm nước cất vừa đủ 200mL, chỉnh pH = 7 4. Hút 1, mL dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. 5. Ly tâm 5.500 vòng/phút trong 10 phút. 6. Hút cẩn thận 1 mL phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham. 7. Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm. 8. Chuẩn bị đường chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thương mại hòa tan với 10mL phosphate buffer được nồng độ là 160µg/L. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/mL. Sau đó, cho 2mL thuốc thử vào, để ủ 20 phút trong tối cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 28 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 0 2.5 5 Trường ĐHCT 10 20 30 40 80 Hình 4: Đường chuẩn IAA 9. Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 40µg/mL. 10. Kết quả đo OD các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp… 3.3.7 Đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan Để đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn, tiến hành thí nghiệm sau: Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trường PDA lỏng thu sinh khối: chủng 1 mL vi khuẩn gốc vào ống falcon 50mL có chứa 20mL môi trường PDA lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007). Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan. Hiệu suất hòa tan lân E được tính theo công thức: Đường kính halo E = ------------------------------ x 100 Đường kính khuẩn lạc (Nguyen et al., 1992) Tiến hành thí nghiệm Dùng micropipet hút 5L dung dịch vi khuẩn từ mỗi ống nghiệm môi trường tăng sinh PDA có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường NBRIP. Mỗi đĩa 4 dòng, 3 lần lặp lại. Quan sát và đo đường kính halo, khuẩn lạc mỗi ngày. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.3.8 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được:  Chuẩn bị môi trường LB đặc.  Trải vi khuẩn gây bệnh (sử dụng E.coli và Aeromonas hydrophila) lên bề mặt đĩa môi trường.  Dùng giấy thấm đường kính 0,6cm nhúng vào vi khuẩn nuôi đạt mật số 108 tế bào/mL trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trãi vi khuẩn thử nghiệm.  Ủ 35 oC trong 12h – 24h.  Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn 3.3.9 Nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được Sau khi kiểm tra khả năng tổng hợp NH4+ và khả năng tổng hợp IAA và tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập, chọn một số dòng có khả năng tổng hợp ammonium, tổng hợp IAA và có tính kháng khuẩn để giải trình tự gen 16S rRNA. Quy trình trích ADN nhanh theo phương pháp của Barberio và Fani (1998). - Cấy vi khuẩn từ ống trữ ròng lên đĩa Petri chứa môi trường LB. Ủ 24h trong tủ ủ ở 30°C. - Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf - Cho bi vào từng tuýp Eppendorf và trộn đều dung dich trên máy ly tâm. - Ủ ở 95°C trong 10 phút (ủ trong water bath). - Lập tức đem ngâm đá nhanh trong 10 phút để phá vỡ tế bào của vi khuẩn - Ly tâm nhẹ hai lần. Thu được dịch trích ADN của vi khuẩn. - Đem trữ ở -20°C nếu chưa tiến hành quy trình PCR. - Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR - Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) Thành phần Nước cất hai lần Buffer 10X MgCl2 Thể tích (μl) 11,75 2,5 2,0 4,0 0,5 0,25 dNTPS DMSO Mồi F Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 30 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Mồi R Taq DNA polymerase (5U/µl) ADN vi khuẩn Tổng thể tích 0,25 0,25 2,0 25 Quy trình PCR - Biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút. - Tiếp theo là 3 chu trình được gia nhiệt như sau: + 95°C trong 1 phút + 49°C trong 1 phút + 72°C trong 1 phút - Bước cuối cùng là 72°C trong 10 phút. - Sản phẩm PCR sau đó được trữ lạnh ở -20°C để điện di Điện di gel agarose sản phẩm PCR - Chuẩn bị gel nhỏ : (20ml) + Agarose (1%): 0,2g + TAE buffer (1X): 20ml - Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lò vi sóng (microwave) - Sau khi nấu để nguội khoảng 50 – 60°C, bổ sung EtBr 0,4μl - Rót gel vào khuôn - Sau khi rót gel vào khuôn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu. - Load mẫu: dùng Micropipet hút 10μl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10μl mẫu DNA vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng. - Điện di 60 phút ở 90V. Với cặp mồi 16SrRNA (Lane, 1991) Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3 Chụp hình gel bằng máy chụp gep Bio – Rad. Các số liệu thí nghiệm được tính toán thống kê bằng phầm mềm Statgraphics 16.1.18 (32 bit). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 31 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 4.1.1 Phân lập vi khuẩn Từ rễ thân, lá và trái của cây Diệp hạ châu được thu thập từ một số xã trên địa bàn huyện Lai Vung – Đồng Tháp 13 dòng vi khuẩn đã được phân lập. Các dòng vi khuẩn phân lập ròng, được đặt tên là Tx (trong đó T là ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập được và x là số thứ tự dòng từ 01 đến 13). Các dòng vi khuẩn này phân bố ở cả trong rễ thân, lá và trái của cây Diệp hạ châu. Chúng có chung đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Khi được cấy trong môi trường bán đặc, vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle (màu trắng trên môi trường NFb), cách bề mặt môi trường 3-6 mm sau 2-3 ngày nuôi (hình 5). Vòng pellicle Hình 5: Vi khuẩn phát triển hình thành vòng pellicle sau 2-3 ngày chủng Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 32 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Nguồn gốc và ký hiệu của các dòng vi khuẩn được trình bày trong bảng 5. Bảng 5: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA STT Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu 1 T01 Rễ Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 2 T02 Rễ Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 3 T03 Rễ Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 4 T04 Thân Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 5 T05 Thân Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 6 T06 Thân Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 7 T07 Thân Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 8 T08 Lá Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 9 T09 Lá Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 10 T10 Lá Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 11 T11 Trái Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 12 T12 Trái Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 13 T13 Trái Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.1.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập được. Cấy các dòng vi khuẩn đã ròng lên môi trường PDA trong đĩa petri, ủ ở 30oC. Kết quả quan sát cho thấy đa số các dòng vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc tròn, hầu hết có màu trắng đục 10/13 dòng (chiếm 76,9%), chỉ có 3 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng trong (chiếm 23,1%). Kích thước khuẩn lạc của vi khuẩn sau 24 giờ cấy trên môi trường PDA và ủ ở 30 oC dao động từ 1 – 6 mm (Hình 6). Bảng 6: Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA sau 24 giờ cấy STT Dòng vi khuẩn Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc Đường kính (mm) 1 T01 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 2,0 2 T02 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 1,5 3 T03 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 3,0 4 T04 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 6,5 5 T05 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 1,0 6 T06 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 2,2 7 T07 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi lài, có tâm 3,0 8 T08 Trắng trong Tròn, bìa không đều, độ nổi mô 2,0 9 T09 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 1,0 10 T10 Trắng trong Tròn, bìa không đều, độ nổi mô 2,0 11 T11 Trắng trong Tròn, bìa không đều, độ nổi mô 1,5 12 T12 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 5,0 13 T13 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô 4,0 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 34 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Dạng bìa khuẩn lạc: đa số khuẩn lạc tròn, bìa nguyên 76,9%, không đều 23,1%. Trong đó có 1 dòng có tâm chiếm 7,7%. Độ nổi của khuẩn lạc: phần lớn vi khuẩn có độ nổi mô (11/13) chiếm 84.6%, một số dòng có độ nổi lài (2/13) chiếm 15,4%. A B C Hình 6: Khuẩn lạc phát triển trên môi trường PDA Ghi chú: Hình A là Dòng T07 có khuẩn lạc màu trắng đục, độ nổi lài, có tâm Hình B là Dòng T01 có khuẩn lạc màu trắng đục, độ nổi mô, bìa nguyên Hình C là Dòng T08 có khuẩn lạc màu trắng trong, độ nổi mô, bìa nguyên 4.1.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn trên môi trường PDA Bảng 7 cho thấy đa số các dòng vi khuẩn phân lập được có dạng hình que, một số hình cầu và chuỗi. Trong đó vi khuẩn hình que ngắn (7/13) chiếm 53,8%, que dài (2/13) chiếm 15,4%, cầu đôi và chuỗi (4/13) chiếm 30,8% (Bảng 7). Tất cả các dòng vi khuẩn đều chuyển động. Kích thước tế bào dao động từ 1,3-2,5 x 1,7-6,8 µm phù hợp với mô tả của Juni (2005) và Towner (2006). Kết quả nhuộm Gram cho thấy đa số các dòng vi khuẩn phân lập được là Gram âm (Hình 7). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 7. Đặc tính vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA Kích thước vi khuẩn Dòng STT vi Grama Chuyển Hình dạng độngb khuẩn lạc khuẩn Chiều rộng Chiều dài (µm) (µm) 1 T01 + + Que ngắn 1,71 2,05 2 T02 – + Chuỗi 2.56 10,2 3 T03 – + Que dài 2,56 5,98 4 T04 – + Cầu đôi 1,71 3,42 5 T05 – + Que ngắn 1,54 3,76 6 T06 – + Que ngắn 1,37 1,71 7 T07 – + Cầu đôi 1,71 3,42 8 T08 + + Que ngắn 1,71 3,42 9 T09 – + Chuỗi 1,56 11,9 10 T10 – + Que dài 1,71 6,84 11 T11 – + Que ngắn 1,71 4,44 12 T12 – + Que ngắn 1,37 4,44 13 T13 – + Que ngắn 1,37 4,10 Ghi chú: a: (–) gram âm, (+) gram dương. b: (–)không chuyển động, (+) chuyển động A B Hình 7: Vi khuẩn có Gram âm hình A và Gram dương hình B Độ phóng đại vật kính X100 Ghi chú: Hình A là Dòng T04 Hình B là Dòng T08 4.2 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn Mười ba dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường PDA được chọn khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ từ nitơ tự do sau 2, 4, 6 và 8 ngày (sau khi chủng trong môi trường NFb lỏng, không N, không Yeast extract). Sau hai ngày chủng vi khuẩn, cả 13 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT dòng đều có khả năng tổng hợp NH4+ nhưng với nồng độ thấp, sau 4 ngày lượng NH4+ tăng dần và đạt nồng độ cao nhất vào ngày thứ 6. Đến ngày thứ 8 lượng NH4+ giảm (bảng 8). Bảng 8: Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn STT Dòng vi Hàm lượng Đạm trung bình (µg/mL) khuẩn Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 1 T01 0,012c 0,094fg 0,208e 0,155g 2 T02 0,016def 0,131k 0,134bc 0,103de 3 T03 0,018fg 0,083ef 0,145c 0,115ef 4 T04 0,008b 0,056bc 0,138bc 0,079bc 5 T05 0,017efg 0,099gh 0,148c 0,091cd 6 T06 0,014d 0,083ef 0,115ab 0,073b 7 T07 0a 0,038a 0,140c 0,079bc 8 T08 0,008b 0,062cd 0,143c 0,043a 9 T09 0,016def 0,075de 0,143c 0,100de 10 T10 0,015de 0,113gh 0,153c 0,112e 11 T11 0,019g 0,123hk 0,180d 0,131f 12 T12 0,008b 0,107gh 0,115ab 0,064b 13 T13 0a 0,043ab 0,110a 0,064b 11,2 10,1 4,8 10,1 CV% Ghi chú: Các trị trung bình theo sau các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở 5% Ở ngày 2, các dòng vi khuẩn đã tổng hợp NH4+ nhưng với hàm lượng không cao, bình quân khoảng 0,012 µg/mL. Trong đó, dòng T11 tổng hợp được hàm lượng NH4+ cao nhất (0,019 µg/mL) và hầu như 2 dòng T07, T13 không có khả năng tổng hợp được lượng NH4+ trong ngày 2. Ngày 4, các dòng vi khuẩn tổng hợp hàm lượng NH4+ nhiều hơn ngày 2 nhưng vẫn còn thấp. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các dòng. Ngày 6, hàm lượng NH4+ cao nhất, trong đó dòng vi khuẩn tổng hợp NH4+ cao nhất là do dòng T01 (0,208 µg/mL) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại và thấp nhất do dòng T13 tổng hợp (0,110 µg/mL). Sang ngày thứ 8, do lượng chất Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT dinh dưỡng không còn đủ để duy trì sự sống cho các dòng vi khuẩn nên chúng đã sử dụng chính lượng NH4+ do chúng tạo ra. Bên cạnh đó do môi trường nuôi không còn thuận lợi như trước (lượng chất dinh dưỡng giảm và có nhiều chất thải) nên nhiều tế bào vi khuẩn chết. Do đó, hàm lượng NH4+ được tổng hợp giảm đáng kể, tuy nhiên dòng T01 vẫn giữ được khả năng tổng hợp hàm lượng NH4+ cao nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. 4.3 Khả năng tổng hợp IAA ở các dòng vi khuẩn Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) mà không cần bổ sung tryptophan vào môi trường nuôi cấy. Các dòng tạo IAA vào ngày thứ 2, cao nhất vào ngày thứ 4 và giảm mạnh vào ngày 6 (bảng 9). Tuy nhiên có dòng có khả năng tổng hợp lượng IAA tăng dần từ ngày 2 đến ngày 6 và có dòng lại giảm vào ngày 4 tăng dần vào ngày 6. Bảng 9: Khả năng tổng hợp IAA ở các dòng vi khuẩn phân lập Hàm lượng IAA trung bình (µg/mL) STT Dòng vi khuẩn Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 1 T01 6,27d 3,90a 7,38cd 2 T02 7,17de 13,46ef 4,39b 3 T03 6,90de 16,35h 3,62b 4 T04 3,74c 16,73h 4,22b 5 T05 9,24g 9,73d 7,98de 6 T06 7,71ef 13,18ef 6,78c 7 T07 2,39b 16,57h 4,39b 8 T08 8,34fg 13,96f 9,26fg 9 T09 1,04a 7,68c 2,59a 10 T10 12,48i 12,79e 6,78c 11 T11 13,38i 15,18g 9,26fg 12 T12 4,64c 6,73b 8,83ef 13 T13 10,59h 13,79f 9,95g 7,7 4,6 7,9 CV% Ghi chú: Các trị trung bình theo sau các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở 5% Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Trong 13 dòng vi khuẩn, có 3 dòng tạo được lượng IAA trên 16 (µg/mL) vào ngày thứ 4 và đây cũng là thời điểm mà các dòng vi khuẩn này tạo ra IAA nhiều nhất. Sau hai ngày chủng vi khuẩn trên môi trường NFb lỏng, vi khuẩn đã tổng hợp được lượng IAA khá cao, cao nhất là do dòng T10 (12,48 µg/mL) và T11 (13,38 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Thấp nhất là do dòng T09 tạo ra lượng IAA là 1,04 (µg/mL). Đến ngày 4 lượng IAA bắt đầu tăng mạnh và đạt nồng độ cao nhất, cao nhất là do dòng T04, T07 và T03 tạo ra lượng IAA trên 16 (µg/mL) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Sau 6 ngày, lượng IAA bắt đầu giảm do lượng chất dinh dưỡng không còn dồi dào như những ngày trước, cao nhất là dòng T13 tạo ra 9,95 (µg/mL) và thấp nhất do dòng T09 tạo ra 2,59 (µg/mL) 4.4 Đặc điểm vi khuẩn hòa tan lân khó tan Tám trong mười ba dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng hòa tan lân từ dạng khó tan thành dạng dễ hấp thu biểu hiện qua đường kính halo. Các dòng vi khuẩn này phát triển tốt trên môi trường NBRIP và được nhận diện dễ dàng qua cách tạo halo và thay đổi màu môi trường (từ xanh sang vàng) do hạ pH (môi trường có chất chỉ thị màu bromothymol blue) do các dòng vi khuẩn sinh trưởng tổng hợp được acid hữu cơ (Rossosilini et al., 1998) (Hình 8). A B C Hình 8: Vòng sáng halo do vi khuẩn hòa tan lân tạo ra Ghi chú: Hình A là dòng T08(lá) vi khuẩn làm môi trường đổi từ xanh sang vàng Hình B là dòng T10 (lá) và Hình C là dòng T13 (trái) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 39 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Sau 1 ngày: 13/13dòng vi khuẩn cấy đều xuất hiện trên bề mặt môi trường agar. - Ngày ba, chỉ có 8/13 dòng tạo halo (cao nhất 12,5 mm ở dòng T10) - Ngày sáu, 8 dòng tạo halo ngày trước có kích thước vòng halo tăng rất nhanh đường kính halo ghi nhận cao nhất 15 mm ở dòng T07 và T10, thấp nhất là dòng T05 là 9 mm. - Ngày chín, đường kính halo của các dòng tiếp tục tăng nhưng chậm hơn so với ngày sáu, dòng cao nhất là dòng T10 15,5 mm và thấp nhất là vẫn là dòng T05. (Bảng 10). Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 10. Các dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan rất tốt, trong đó dòng T13 có hiệu suất hòa tan cao nhất. Dòng T05 hòa tan lân thấp và chỉ tăng kích thước đường kính khuẩn lạc mà không tăng đường kính halo, chứng tỏ dòng vi khuẩn này có thể đã sử dụng lượng lân hòa tan để phát triển sinh khối (Ohtake et al., 1998). Bảng 10 : độ hữu hiệu hòa tan lân của các dòng vi khuẩn Thời gian ủ STT Dòng 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày E E E 1 T03 111,1 133,3 125 2 T04 112,5 111,1 121,1 3 T05 114,3 112,5 105,9 4 T07 133,3 166,6 157,9 5 T08 120 125 123,8 6 T10 138,9 150 134,8 7 T12 129,4 130 135 8 T13 160 164,7 170,6 Ghi chú: E là hệ số hòa tan lân 4.5 Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 40 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Tất cả các dòng vi khuẩn được tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn với 2 loại vi khuẩn: E.coli và Aeromonas hydrophila. Sau một ngày chủng vi khuẩn lên môi trường cấy trải sẵn E.coli cả 13 dòng đều phát triển khuẩn lạc nhưng chỉ có một dòng T08 là tạo vòng kháng khuẩn (Hình 9). Trên môi trường chứa vi khuẩn Aeromonas hydrophila có 5/13 dòng có tính kháng khuẩn thể hiện qua cách tạo vòng kháng khuẩn (Hình 10). Bảng 11 : Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn STT Dòng vi khuẩn Kháng E.coli Kháng Aeromonas hydrophila 1 T04 - + 2 T07 - + 3 T08 + + 4 T09 - + 5 T11 - + Ghi chú : (+) kháng ; (-) không kháng Dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn E.coli xuất hiện ở lá. Kết quả sau 24h ủ ở 30 oC cho ta thấy rõ vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc. Bảng 12: Khả năng kháng vi khuẩn E.coli của các dòng vi khuẩn Thời gian ủ STT Dòng 1 ngày 2 ngày 3 ngày D D D 1,87 2,25 2,25 Lần 1 1 T08 E.coli Lần 2 Ghi chú : D là đường kính vòng kháng khuẩn Ngày 1, các dòng vi khuẩn chưa thích nghi với môi trường mới nên khả năng kháng khuẩn không cao. Đến ngày 2, khi đã thích nghi với môi trường mới các dòng vi khuẩn hoạt động tốt hơn nên khả năng kháng vi khuẩn E.coli tăng lên. Ở ngày 3, đường kính vòng kháng khuẩn vẫn tiếp tục tăng nhưng không nhiều. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 41 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Ở nghiệm thức vi khuẩn thử nghiệm Aeromonas hydrophila sau 1 ngày chủng các dòng vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn khá lớn và chúng phát triển lớn dần qua các ngày. Song do mỗi dòng vi khuẩn có tính chất khác nhau nên hiệu suất hoạt tính kháng khuẩn của chúng cũng khác nhau. Ngày 1, các dòng vi khuẩn chưa thích nghi với môi trường mới nên khả năng kháng khuẩn không cao. Đến những ngày tiếp theo, khi đã thích nghi với môi trường mới các dòng vi khuẩn hoạt động tốt hơn nên khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila tăng lên. Bảng 13: Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn Thời gian ủ STT Dòng Vi khuẩn gây bệnh 1 ngày 2 ngày 3 ngày D D D 1 T04 2,25 2,13 4 2 T07 2 2,25 3,25 3 T08 1,25 2 3 4 T09 1 1,75 4 5 T11 0,75 2,25 2,75 Aeromonas hydrophila Ghi chú : D là đường kính vòng kháng khuẩn Khả năng kháng của các dòng vi khuẩn tăng theo thời gian. Ngày 1, vòng kháng khuẩn có đường kính nhỏ, khác biệt không có ý nghĩa giữa các dòng vi khuẩn. Đến ngày 2, đường kính vòng kháng khuẩn tăng lên vòng kháng khuẩn có đường kính lớn nhất là dòng T07. Ở ngày 3, đường kính vòng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn tăng, dòng có đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất là dòng T04. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 42 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Hình 9: Khả năng ức chế sự phát triển của E.coli của dòng T08 Ghi chú: 37 là dòng T08 Hình 10: Khả năng ức chế sự phát triển của Aeromonas hydrophila Ghi chú: 33 là dòng T04 40 là dòng T11 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 43 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 4.5 Trường ĐHCT a a 4 a 3.5 a a 3 2.5 b a ab a a a ngày 3 ab 1.5 ngày 2 a 2 ngày 1 ab 1 a 0.5 0 T04 T07 T08 T09 T11 nghiệm thức Hình 11: : Hiệu quả hoạt tính kháng khuẩn Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê Sau một ngày chủng 5 dòng vi khuẩn phân lập được bắt đầu xuất hiện vòng kháng khuẩn và tăng dần qua các ngày (Hình 11). Hiệu quả cao nhất do dòng T04, khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các dòng. Đến ngày 2, hiệu suất tăng dần nhưng có một số dòng đường kính khuẩn lạc không phát triển chỉ tăng vòng kháng khuẩn. Ngày 3, hiệu suất tăng nhanh, cao nhất là do Dòng T04, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với các dòng khác. Theo kinh nghiệm dân gian đã sử dụng Diệp hạ châu để trị liên cầu, tụ cầu khuẩn vàng, trực khuẩn bạch cầu (Đỗ Huy Bích et al., 2004). Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu từ bảng 13 cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập được có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh trên cá là Aeromonas hydrophila gây bệnh đốm đỏ trên cá. Vi khuẩn gây bệnh cá đã kháng rất nhiều kháng sinh mạnh và gây thiệt hại đáng kể cho các nhà nuôi trồng thủy sản (Tu Thanh Dung et al., 2008). Mặc khác, việc sử dụng kháng sinh điều trị đã gây chi phí cao và sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản ảnh hưởng đến sức khỏe con người, còn là rào cản các doanh nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu. Do đó, phát hiện khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh trên cá của Diệp hạ châu sẽ góp phần không nhỏ trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 44 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh Do dòng vi khuẩn T08 có khả năng cố đinh đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân khá cao, có khả năng kháng vi khuẩn E.coli và vi khuẩn A.hydrophila nên được chọn giải trình tự. Phổ điện di trên gel agarose cho thấy dòng vi khuẩn T08 có băng (band) ở vị trí 1500bp so với thang chuẩn (Hình 12). 1 2 3 1500bp Hình 12: Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn 16S rRNA của dòng vi khuẩn T08 Chú thích: (1) Thang chuẩn (2) T08 (3) Đối chứng âm Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trình tự tương đồng với các trình tự trên ngân hàng gen. Kết quả đã cho thấy trình tự của dòng T08 có mức đồng hình là 96% với 16S-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis. Hình 13: Mức độ tương đồng của dòng T08 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu NCBI Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 45 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Trình tự nucleotid của dòng T08: TAGGGGCGCGGACAGCCAATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCC CTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTG GGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTT CAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAG CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG TAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAA TAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGG GCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGG GTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGT AGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTG GTCTGTAACTGACGCTGAAGAACGAAAGCGTGGGGAACGAACAGGATTAGATACC CTGGGTAGTCCCCCCCGTAAACGATGAATGCTTAGTGTTTAGGGGGTTTCCCCCCC TTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAATACGGTCGCAAGAC TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAACATGTGGTTTAA TTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGA GATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAG TTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAACCCGAGGAAA GGGGGGGGATGACGTCAAATAATCATGCCCCTTTTAACTGGGGGTACCACCGTGC TTCAATGGGAAGAAAAAAAGGGGGGCGGAACCCCCGGGGTTAGCCAATCCCCCA AATTGTTTTCTTTTCGGAACAAAGTTGCAACTCAACTCC Đã có nhiều nghiên cứu về lợi ích Bacillus subtilis được ứng dụng trong y học và chăn nuôi. Năm 1958-1960, Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột. Theo nghiên cứu của Đặng Ngọc Phương Uyên năm 2007, Bacillus subtilis chủng L211 có khả năng đối kháng cao với E. coli O157:H7. Theo nghiên cứu của Gupta và Vyas năm 1989, Bacillus subtilis nhiễm vào và gây tử vong cho muỗi Anophelis aulicifacies gây sốt rét ở Ấn Độ. Năm 1962, Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn tính. Loài Bacillus subtilis có thể sản xuất nhiều loại kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn (Chen H et al., 2008). Ngoài ra Bacillus subtilis có thể sản xuất hơn hai mươi loại kháng sinh đặt biệt là kháng sinh lipopeptide có thể diệt nấm, diệt khuẩn và cả côn trùng (Kim et al., 2004). Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 46 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Mười ba dòng vi khuẩn được phân lập từ 2 mẫu Diệp hạ châu. Các dòng đều có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA. Dòng vi khuẩn T08 có khả năng cố đinh đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân khá cao, có khả năng kháng vi khuẩn E.coli và đặt biệt là kháng rất tốt sự phát triển của vi khuẩn A.hydrophila. Bằng kỹ thuật giải trình tự 16S rRNA dòng vi khuẩn T08 tương đồng 96% với dòng Bacillus subtilis 5.2 Đề nghị Tiếp tục khảo sát hiệu quả các dòng vi khuẩn trên các loại vi khuẩn gây bệnh khác nhau Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 47 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Dược liệu Đại học Y Dược TPHCM- Bộ môn Dược liệu Đại học Dược Hà Nội, 1998. Bài giảng Dược liệu. Tập 1. Bộ Y tế và Bộ Giáo dục đào tạo. Trang 259-289. Cao Ngọc Điệp, 2011. Vi khuẩn nội sinh thực vật. Nxb Đại Học Cần Thơ, Cần Thơ. 192 trang Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002. Giáo trình thực tập vi sinh vật. Nxb Đại Học Cần Thơ, Cần Thơ.100 trang Đặng Thị Huỳnh Mai và Cao Ngọc Điệp, 2002. Phân lập vi sinh vật hoà tan lân khó tan. Tuyển tập Công trình Nghiên cứu Khoa học. Trang 353-358 Đỗ Tất Lợi, 2000. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y Học. Trang 40-41. Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây Cúc Xuyên Chi (Wedelia trilobata L.) Hitche. Tạp chí Khoa học, 18a 168-176 Nguyễn Hữu Hiệp. 2008. Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất phân vi sinh ở qui mô thí nghiệm cho cây mía trồng tại Tỉnh Sóc Trăng. Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ 8, tr.149-157. Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp. 2009. Phân lập và khảo sát đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi. Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2), tr.241-250. Nguyễn Thành Dũng, 2009. Phân lập những dòng vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng ở huyện Vĩnh Thuận tỉnh Kiêng Giang. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần thơ. Cần Thơ. Nguyễn Thị Minh Thư, 2010. Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm Burkholderia sp. trên cây lúa cao sản trồng ở Hậu Giang. Nguyễn Thị Phương Như, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm. Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nông nghiệp Hà Nội. Nguyễn Thành Đạt, 1990. Thực hành vi sinh, NXB Nông Nghiệp Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 48 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Phạm Hoàng Hộ, 1999. Cây cỏ Việt Nam-quyển 1. Nhà xuất bản Trẻ. Trang 288. Phùng văn Tạo, 2013. Phân lập, khảo sát đặc tính và nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây mè. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ. Cần Thơ Tiếng Anh A. V. Sturz, B. R. Christie and J. Nowak, 2000. Bacterial Endophytes: Potential Role in Developing Sustainable Systems of Crop Production. Plant Sciences, 19 (1): 1- 30. A.A. Hassen , J. Xu and J. Yang, 2007. Growth Conditions of Associative NitrogenFixing Bacteria Enterobacter cloace in Rice Plants. Agricultural Journal, 2: 672675. Artidtaya Bhoonobtong, Sasiphimol Sawadsitang, Sirirath Sodngam and Wiyada Mongkolthanaruk, 2012. Characterization of Endophytic Bacteria, Bacillus amyloliquefacien for antimicrobial Agents Production. International Conference on Biological and Life Sciences, 40: 6- 11. Barbara Reinhold, Thomas Hurek, Ernst-Georg Niemann and Istvan Fendrik, 1996. Close Association of Azospirillum and Diazotrophic Rods with Different Root Zones of Kallar Grass. Applied and Environmental Microbiology, 52 (3): 520526. Clémence Chaintreuil, Eric Giraud, Yves Prin, Jean Lorquin, Amadou Bâ, Monique Gillis, Philippe de Lajudie, and Bernard Dreyfus, 2000. Photosynthetic Bradyrhizobia Are Natural Endophytes of the African Wild Rice Oryza breviligulata. Applied and Environmental Microbiology, 66 (12): 5437- 5447. Denise K. Zinniel, Pat Lambrecht, N. Beth Harris, Zhengyu Feng, Daniel Kuczmarski, Phyllis Higley, Carol A. Ishimaru, Alahari Arunakumari, Raúl G. Barletta, and Anne K. Vidaver, 2002. Isolation and Characterization of Endophytic Colonizing Bacteria from Agronomic Crops and Prairie Plants. Applied and Environmental Microbiology, 68 (5): 2198- 2208. Diego Harari and P. Sikivie, 1988. Gravitational field of a global string. The American Physical Society new Journal, 37 (12): 3438–3440. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 49 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT E. Sivamani and S. S. Gnanamanickam, 1988. Biological control of Fusarium oxysporumf.sp.cubense in banana by inoculation with Pseudomonas fluorescens. Plant and Soil, 107 (1): 3- 9. Enrico Scarpella, Saskia Rueb and Annemarie H. Meijer, 2003. The RADICLELESS1 gene is required for vascular pattern formation in rice. Development, (130): 645- 658. Hilda Rodríguez and Reynaldo Fraga, 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnology Advances 17: 319- 339 Hong Xie, J.J. Pasternak and Bernard R. Glick, 1996. Isolation and Characterization of Mutants of the Plant Growth- Promoting Rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 That Overproduce Indoleacetic Acid. Current Microbiology, 32 (2): 6771. Hoon Hwangbo, Ro Dong Park, Yong Woong Kim, Yo Sup Rim, Keun Hyung Park, Tae Hwan Kim, Jang Sun Suh and Kil Yong Kim, 2-Ketogluconic Acid Production and Phosphate Solubilization by Enterobacter intermedium. Current Microbiology, 47 (2): 87- 92. Isabel M. M. Roos and M. J. Hattingh, 1983. Scanning Electron Microscopy of Pseudomonas syringae pv,morsprunorum on Sweet Cherry Leaves. Journal of Phytopathology, 108 (1): 18- 25. J. C. Biswas, J.K. Ladha and F.B. Dazzo, Rhizobia Inoculation Improves Nutrient Uptake and Growth of Lowland Rice. Soil Science Society of America Journal, 64 (5): 1644- 1650. J. Hallmann, A. Quadt-Hallmann, W. F. Mahaffee and J. W. Kloepper, 1997. Bacterial endophytes in agricultural crops. Revue canadienne de microbiologie, 43 (10): 895- 914. James G. Daly and Roselynn M. W. Stevenson, 1990. Characterization of the Renibacterium salmoninarum haemagglutinin. Applied and Environmental Microbiology, 136 (5): 949- 953. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 50 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Jeffrey J. Tarrand, Noel R. Krieg, Johanna Döbereiner, 1978. A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group, genus, Azospirillum gen. nov. with and two descriptions of species, Azospirillum a new lipoferum (Beijerinck) comb. nov. And Azospirillum brasilense sp. nov.. Revue canadienne de microbiologie, 24 (8): 967- 980. Jesús Caballero-Mellado, Janette Onofre-Lemus, Paulina Estrada-de los Santos and Lourdes Martínez-Aguilar, 2007. The Tomato Rhizosphere, an Environment Rich in Nitrogen-Fixing Burkholderia Species with Capabilities of Interest for Agriculture and Bioremediation. Applied and Environmental Microbiology, 73 (16): 5308- 5319. Johan Goris, Paul De Vos, Jesús Caballero-Mellado, Joonhong Park, Enevold Falsen, John F. Quensen III, James M. Tiedje and Peter Vandamme, 2004. Classification of the biphenyl- and polychlorinated biphenyl-degrading strain LB400T and relatives asBurkholderia xenovorans sp. nov.. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51 (5): 1677- 1681. L. A. O'Sullivan, E. Mahenthiralingam, 2005. Biotechnological potential within the genus Burkholderia. Applied Microbiology, 41 (1) 8- 11. Lionel Moulin, Antonio Munive, Bernard Dreyfus & Catherine Boivin-Masson, 2001. Nodulation of legumes by members of the -subclass of Proteobacteria. International Weekly Journal of Science, 411: 948- 950. Luis M. R. and P. W. Ludden, 2005. Maturation of nitrogenase: a Biochemical puzzle. Journal of Bacteriology, 187 (2): 405- 414. William G. Weisburg, Susan M. Barns, Dale A. Pelletier, and David J. Lane, 1991. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. Journal Of Bacteriology, 173 (2): 697- 703. M. John Albert, M. Ansaruzzaman, Kaisar A. Talukder, Ashok K. Chopra, Inger Kuhn, Motiur Rahman, A. S. G. Faruque, M. Sirajul Islam, R. Bradley Sack and Roland Mollby, 2000. Prevalence of Enterotoxin Genes in Aeromonas spp. Isolated From Children with Diarrhea, Healthy Controls, and the Environment. Applied and Environmental Microbiology, 38 (10): 3785- 3790. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 51 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Michael H Glickman, David Trường ĐHCT M Rubin, Olivier Coux, Inge Wefes, Günter Pfeifer, Zdenka Cjeka, Wolfgang Baumeister, Victor A Fried and Daniel Finley, 1998. A Subcomplex of the Proteasome Regulatory Particle Required for Ubiquitin- Conjugate Degradation and Related to the COP9-Signalosome and eIF3. Cell Press, 94 (5): 615- 623. Muthukumarasamy R., G. Revathi, S. Seshadri and C. Laskshminarsimhan, 2002. Gluconacetobacter diazotrophicus (Syn. Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte intropics. Curr Sci, 83: 137-145. Nicole Benhamou, 1996. Elicitor-induced plant defence pathways. Trend in Plant Science, 1 (7): 233- 240. Panchal H and S.S. Ingle, 2011. Isolation and Characterization of Endophytes From the Root of Medicinal Plant Chlorophytum borivilianum (Safed musli). Journal of Advances in Developmental Research, 2 (2): 205- 209. P van Berkum and B B Bohlool, 1980. Evaluation of nitrogen fixation by bacteria in association with roots of tropical grasses.Evaluation of nitrogen fixation by bacteria in association with roots of tropical grasses. Microbiological Review, 44 (3): 491- 517. Salme Timmusk, Nina Grantcharova and E. Gerhart H. Wagner, 2005. Paenibacillus polymyxa Invades Plant Roots and Forms Biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 71 (11): 7292- 7300. Sheng Qin, Jie Li, Hua Hong Chen, Guo Zhen Zhao, Wen Yong Zhu, Cheng Lin Jiang, Li Hua Xu and Wen Jun Li, 2009. Isolation, Diversity, and Antimicrobial Activity of Rare Actinobacteria from Medicinal Plants of Tropical Rain Forests in Xishuangbanna, China. Applied and Environmental Microbiology, 75 (19): 6176- 6186. Shino Suzuki, Yuxi He, Hiroshi Oyaizu, 2003. Indole-3-Acetic Acid Production in Pseudomonas fluorescens HP72 and Its Association with Suppression of Creeping Bentgrass Brown Patch. Current Microbiology, 47 (2): 138- 143. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 52 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Sunita Rangarajan, Lilly M. Saleena, Preeti Vasudevan and Sudha Nair, 2003. Biological suppression of rice diseases by Pseudomonas spp. under saline soil conditions. Plant and Soil, 251 (1): 73- 82. Swetha Sunkar and C Valli Nachiyar., 2012. Biogenesis of antibacterial silver nanoparticles using the endophytic bacterium Bacillus cereus isolated from Garcinia xanthochymus. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2 (12): 953- 959. Tom Coenye and Peter Vandamme, 2003. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches. Environmental Microbiology, 5 (9): 719- 729. Valgas Cleidson, Souza Simone Machado de; Smania Elza F A and Smania, JR Artur, 2007. Screening methods to determine antibacterial activity of natural products. Brazilian Journal of Microbiology 38: 369- 380. V. K. Pillay and J. Nowak, 1997. Inoculum density, temperature, and genotype effects on in vitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato (Lycopersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a pseudomonad bacterium. Revue canadienne de microbiologie, 43 (4): 354-361. Wen- Ming Chen, Euan K. James, Tom Coenye, Jui-Hsing Chou, Edmundo Barrios, Sergio M. de Faria, Geoffrey N. Elliott, Shih-Yi Sheu, Janet I. Sprent and Peter Vandamme, 2006. Burkholderia mimosarum sp. nov., isolated from root nodules of Mimosaspp. from Taiwan and South America. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56 (8): 1847- 1851. Xiaocong Yu, Tshidi Tsibane, Patricia A. McGraw, Frances S. House, Christopher J. Keefer, Mark D. Hicar, Terrence M. Tumpey, Claudia Pappas, Lucy A. Perrone, Osvaldo Martinez, James Stevens, Ian A. Wilson, Patricia V. Aguilar, Eric L. Altschuler, Christopher F. Basler and James E. Crowe Jr, 2008. Neutralizing antibodies derived from the B cells of 1918 influenza pandemic survivors. International Weekly Journal of Science, 455: 532- 536. Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 53 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Trang web http://www.ykhoa.net/yhoccotruyen/voha/vh088.htm (17/7/2013) http://khanhngocstc.com/bvct/s/88/cay-diep-ha-chau-va-cac-cong-dung-chuabenh.html (17/7/2013) http://ijbar.ssjournals.com/index.php/journal/article/view/375 (17/7/2013) http://www.takdgroup.com/index.php?detail/51/&DI%E1%BB%86PH%E1%BA%A0-CHAU (18/7/2013) http://www.tienduoc.com/diep-ha-chau/287-diep-ha-chau.html (18/7/2013) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 54 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1 : Kết quả STT PH đất Địa điểm thu mẫu 1 7,12 Xã Định Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 2 7,11 Xã Phong Hòa – Lai Vung – Đồng Tháp 1. Số liệu đo ammonium Ngày 2 Dòng T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 T10 T11 T12 T13 Lần 1 0.013 0.018 0.015 0.009 0.019 0.014 0.001 0.009 0.018 0.015 0.020 0.009 0.000 Lần 2 0.010 0.015 0.020 0.009 0.016 0.015 0.001 0.008 0.014 0.014 0.019 0.019 0.000 Lần 3 0.013 0.016 0.019 0.008 0.015 0.014 0.001 0.009 0.016 0.016 0.018 0.008 0.000 Lần 1 0.089 0.145 0.089 0.049 0.113 0.081 0.041 0.065 0.081 0.121 0.105 0.121 0.049 Lần 2 0.097 0.129 0.073 0.057 0.089 0.081 0.033 0.057 0.073 0.105 0.129 0.105 0.041 Lần 3 0.097 0.129 0.089 0.065 0.097 0.089 0.041 0.065 0.073 0.113 0.137 0.097 0.041 Ngày 4 Dòng T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 T10 T11 T12 T13 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Ngày 6 Dòng T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 T10 T11 T12 T13 Lần 1 0.243 0.146 0.138 0.123 0.138 0.116 0.138 0.146 0.161 0.153 0.191 0.108 0.108 Lần 2 0.198 0.123 0.161 0.153 0.146 0.108 0.153 0.131 0.138 0.161 0.183 0.116 0.116 Lần 3 0.183 0.168 0.138 0.138 0.161 0.123 0.131 0.153 0.131 0.146 0.168 0.123 0.108 Lần 1 0.164 0.119 0.110 0.092 0.092 0.083 0.074 0.046 0.101 0.101 0.128 0.055 0.074 Lần 2 0.155 0.101 0.110 0.074 0.101 0.074 0.092 0.037 0.110 0.119 0.146 0.064 0.064 Lần 3 0.146 0.092 0.128 0.074 0.083 0.064 0.074 0.046 0.092 0.119 0.119 0.074 0.055 Ngày 8 Dòng T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 T10 T11 T12 T13 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2. Số liệu đo IAA Ngày 2 Dòng T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 T10 T11 T12 T13 Lần 1 7.08 6.81 6.81 4.11 10.05 7.35 2.49 8.43 1.14 11.95 13.30 4.38 10.86 Lần 2 5.46 7.08 7.62 3.30 8.97 7.89 2.49 7.89 1.14 13.84 13.57 4.92 10.05 Lần 3 6.27 7.62 6.27 3.84 8.70 7.89 2.22 8.70 0.86 11.68 13.30 4.65 10.86 Lần 1 4.52 13.68 15.52 16.68 8.85 13.02 16.02 14.52 7.85 13.02 15.35 7.35 13.68 Lần 2 3.85 12.85 16.52 15.85 9.68 13.02 17.02 14.02 7.68 13.02 15.18 6.52 13.85 Lần 3 3.35 13.85 17.02 17.68 10.68 13.52 16.68 13.35 7.52 12.35 15.02 6.35 13.85 Ngày 4 Dòng T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 T10 T11 T12 T13 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Ngày 6 Dòng T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 T10 T11 T12 T13 Lần 1 7.38 4.31 3.28 4.31 8.15 7.38 5.08 9.69 2.77 7.64 8.41 8.15 9.69 Lần 2 6.87 4.05 3.54 3.79 7.64 6.62 3.79 9.44 2.51 6.10 9.95 8.92 9.95 Lần 3 7.90 4.82 4.05 4.56 8.15 6.36 4.13 8.67 2.51 6.62 9.44 9.44 10.21 3. Chỉ số đo vòng halo lân Bảng khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 STT Dòng Đk khuẩn lạc (cm) Đk halo (cm) Đk khuẩn lạc (cm) Đk halo (cm) Đk khuẩn lạc (cm) Đk halo (cm) 1 T03 0.9 x 0.9 1.0 x 1.0 0.9 x 0.9 1.2 x 1.2 1.1 x 0.9 1.2 x 1.3 2 T04 0.8 x 0.8 0.9 x 0.9 0.9 x 0.9 1.0 x 1.0 1.0 x 0.9 1.1 x 1.2 3 T05 0.7 x 0.7 0.8 x 0.8 0.8 x 0.8 0.9 x 0.9 0.8 x 0.9 0.8 x 1.0 4 T07 0.9 x 0.9 1.2 x 1.2 0.9 x 0.9 1.5 x 1.5 0.9 x 1.0 1.5 x 1.5 5 T08 1.0 x 1.0 1.1 x 1.2 1.0 x 1.0 1.2 x 1.3 1.1 x 1.0 1.3 x 1.3 6 T10 0.9 x 0.9 1.3 x 1.2 1.0 x 1.0 1.5 x 1.5 1.2 x 1.1 1.6 x 1.5 7 T12 0.9 x 0.8 1.0 x 1.2 1.0 x 1.0 1.3 x 1.3 1.0 x 1.0 1.3 x 1.4 8 T13 0.7 x 0.8 1.2 x 1.2 0.8 x 0.9 1.4 x 1.4 0.8 x 0.9 1.4 x 1.5 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4. Chỉ số đo vòng kháng khuẩn Vi khuẩn thử nghiệm Aeromonas hydrophila Thời gian ủ 1 ngày 2 ngày Dòng Halo Khuẩn Halo Khuẩn (mm) lac (mm) (mm) lac (mm) 10 x 12 8 x 10 10 x 13 8 x 10 T04 10 x 10 7x8 11 x 10 8.5 x 9 12 x 10 9x8 13 x 13 9 x 10 T07 7x8 6x7 8 x9 7 x8 7x7 6x6 8 x8 6 x6 T08 7.5 x 7.5 6x6 8 x8 6 x6 6.5 x 6.5 6x6 8 x8 6 x6 T09 8x9 7x7 10 x 12 9 x 10 7 x 6.5 6x6 8 x8 6 x6 T11 8 x 7.5 7x7 12 x 10 9 x8 3 ngày Halo Khuẩn (mm) lac (mm) 13 x 10 10 x 8 14 x 15 9 x 10 17 x 18 14 x 15 13 x 14 9 x 11 9 x9 6x6 10 x 10 7x7 11 x 11 6x7 14 x 12 8 x 11 11 x 10 7x8 13 x 11 10 x 9 Vi khuẩn thử nghiệm E.coli 1 ngày Halo Khuẩn (mm) lac (mm) 7.5 x 8 6 x6 8 x8 6 x6 Dòng T08 Thời gian ủ 2 ngày Halo Khuẩn (mm) lac (mm) 8 x9 6.5 x 6.5 9 x9 6.5 x 6.5 3 ngày Halo Khuẩn (mm) lac (mm) 8x9 6.5 x 6.5 9 x 10 7x7 Phụ lục 2 : Các hình ảnh 1. Đường chuẩn đo đạm Đường chuẩn ngày 2 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Đường chuẩn ngày 4 0.7 y = 0.0803x + 0.0039 R2 = 0.9917 y = 0.1246x + 0.0069 R2 = 0.9994 0.6 0.5 Series1 0.4 Series1 Linear (Series1) 0.3 Linear (Series1) 0.2 0.1 0 0 2 4 6 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 0 2 4 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Đường chuẩn ngày 6 Đường chuẩn ngày 8 y = 0.1332x - 0.0024 R2 = 0.9998 0.7 0.6 0.6 y = 0.1101x + 0.0139 R2 = 0.9945 0.5 0.5 0.4 0.4 Series1 0.3 Series1 0.3 Linear (Series1) 0.2 0.2 0.1 0.1 0 Linear (Series1) 0 -0.1 0 2 4 6 0 2 4 6 2. Đường chuẩn đo IAA Đường chuẩn IAA ngày 2 0.35 Đường chuẩn IAA ngày 4 0.6 y = 0.0037x + 0.0178 R2 = 0.9606 0.3 y = 0.006x + 0.0049 R2 = 0.9827 0.5 0.25 0.4 0.2 Series1 Linear (Series1) 0.15 Series1 0.3 Linear (Series1) 0.2 0.1 0.1 0.05 0 0 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Đường chuẩn IAA ngày 6 0.35 y = 0.0039x + 0.0032 R2 = 0.9973 0.3 0.25 0.2 Series1 Linear (Series1) 0.15 0.1 0.05 0 0 20 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 40 60 80 100 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 3 : Kết quả phân tích thống kê 1. Bảng kết quả phân tích phương sai thí nghiệm xác định hàm lượng đạm do 13 dòng vi khuẩn tổng hợp được ở 2,4,6 và 8 ngày sau khi chủng (trên môi trường NFb). Ngày 2 CV= 11.2% Method: 95.0 percent LSD DONG Count Mean T13 T07 T12 T04 T08 T01 T06 T10 T09 T02 T05 T03 T11 0.000125 0.00137 0.008427 0.008427 0.008427 0.0117477 0.014238 0.0150683 0.0158987 0.0163137 0.0167287 0.017974 0.0188043 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0.00133356 Df Mean Square F-Ratio P-Value 12 0.00011113 63.51 0.0000 0.0000454918 26 0.00137905 Homogeneous Groups X X X X X X X XX XXX XXX XXX XX X 0.00000174968 38 Ngày 4 CV= 10.1% Method: 95.0 percent LSD DONG Count Mean T07 T13 T07 T08 T09 T06 3 3 3 3 3 3 0.0382557 0.0436063 0.0569823 0.0623328 0.0757089 0.0837346 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Homogeneous Groups X XX XX XX XX XX Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 T03 T01 T05 T12 T10 T11 T02 Source Between groups Within groups Total (Corr.) 3 3 3 3 3 3 3 Trường ĐHCT XX XX XX XX XX XX X 0.0837346 0.0944355 0.099786 0.107812 0.113162 0.123863 0.131889 Sum of Squares 0.0318259 Df Mean Square F-Ratio P-Value 12 0.00265216 32.12 0.0000 0.00214706 26 0.0000825792 0.033973 38 F-Ratio P-Value 11.34 0.0000 Ngày 6 CV= 4.8% Method: 95.0 percent LSD Source Sum of Squares Between 0.0252961 groups Within 0.00483108 groups Total 0.0301272 (Corr.) Df 12 Mean Square 0.00210801 26 0.000185811 38 DONG Count Mean T13 T12 T06 T02 T04 T07 T09 T08 T03 T05 T10 T11 T01 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0.110611 0.115616 0.115616 0.134564 0.138138 0.140641 0.143143 0.143143 0.145646 0.148148 0.153153 0.180681 0.208208 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Homogeneous Groups X XX XX XX XX X X X X X X X X Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Ngày 8 CV= 10.1% Method: 95.0 percent LSD Source Sum of Squares Between 0.0337974 groups Within 0.00269481 groups Total 0.0364922 (Corr.) Df Trường ĐHCT 12 Mean Square 0.00281645 26 0.000103647 F-Ratio P-Value 27.17 0.0000 38 DONG Count Mean T08 T13 T12 T06 T04 T07 T05 T09 T02 T10 T03 T11 T01 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0.043294 0.0644867 0.0644868 0.0735695 0.0796246 0.0796246 0.0917348 0.100817 0.103845 0.112928 0.115955 0.131093 0.155313 Homogeneous Groups X X X X XX XX XX XX XX X XX X X 2. Bảng kết quả phân tích phương sai thí nghiệm xác định hàm lượng IAA do 13 dòng vi khuẩn tổng hợp được ở 2,4,6 ngày sau khi chủng (trên môi trường NFb). Ngày 2 CV= 7.7% Method: 95.0 percent LSD Source Sum of Squares 491.48 Between groups Within 7.98636 groups Total (Corr.) 499.466 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Df 12 Mean Square 40.9567 26 0.307168 F-Ratio P-Value 133.34 0.0000 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DONG Count Mean T09 T07 T04 T12 T01 T03 T02 T06 T08 T05 T13 T10 T11 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1.04505 2.3964 3.74775 4.64865 6.27027 6.9009 7.17117 7.71171 8.34234 9.24324 10.5946 12.4865 13.3874 Ngày 4 CV= 4.6% Method: 95.0 percent LSD Source Sum of Squares Between 597.899 groups Within 8.16667 groups Total (Corr.) 606.066 Df 12 Mean Square 49.8249 26 0.314103 F-Ratio P-Value 158.63 0.0000 38 DONG Count Mean T01 T12 T09 T05 T10 T06 T02 T13 T08 T11 T03 T07 T04 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3.90556 6.73889 7.68333 9.73889 12.7944 13.1833 13.4611 13.7944 13.9611 15.1833 16.35 16.5722 16.7389 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Homogeneous Groups X X X X X XX XX XX XX X X X X Homogeneous Groups X X X X X XX XX X X X X X X Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Ngày 6 CV= 7.9% Method: 95.0 percent LSD Source Sum of Squares 219.838 Between groups Within 7.05676 groups Total (Corr.) 226.895 Df 12 Mean Square 18.3199 26 0.271414 F-Ratio P-Value 67.50 0.0000 38 DONG Count Mean T09 T03 T04 T02 T07 T06 T10 T01 T05 T12 T11 T08 T13 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.59829 3.62393 4.22222 4.39316 4.39316 6.78632 6.78633 7.38462 7.98291 8.83761 9.26496 9.26496 9.94872 Homogeneous Groups X X X X X X X XX XX XX XX XX X 3. Kết quả phân tích thống kê thử nghiệm vi khuẩn Ngày 1 Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean T11 T09 T08 T07 T04 2 2 2 2 2 0.75 1.0 1.25 2.0 2.25 Source Sum of Squares 3.35 Between groups Within 1.25 groups Total (Corr.) 4.6 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Df 4 Mean Square 0.8375 5 0.25 Homogeneous Groups X XX XX XX X F-Ratio P-Value 3.35 0.1086 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Ngày 2 Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean T09 T08 T04 T11 T07 2 2 2 2 2 1.75 2.0 2.125 2.25 2.25 Source Sum of Squares 0.35 Between groups Within 3.65625 groups Total (Corr.) 4.00625 Df 4 Mean Square 0.0875 5 0.73125 Homogeneous Groups X X X X X F-Ratio P-Value 0.12 0.9695 9 Ngày 3 Method: 95.0 percent LSD dong Count Mean T11 T08 T07 T09 T04 2 2 2 2 2 2.75 3.0 3.25 4.0 4.0 Source Sum of Squares 2.65 Between groups Within 2.75 groups Total (Corr.) 5.4 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Df 4 Mean Square 0.6625 5 0.55 Homogeneous Groups X X X X X F-Ratio P-Value 1.20 0.4121 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học – Khóa 36 Trường ĐHCT Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... gian như ở cây dược liệu chúng có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Kaul et al., 2008) Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella…Đề tài Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.) mọc hoang tại Lai Vung – Đồng Tháp để tuyển chọn những dòng vi khuẩn nội sinh có ích... nhạt, có vân ngang Có 3 loại Diệp hạ châu: Cây Diệp hạ châu thân xanh (Diệp hạ châu đắng) Phyllanthus niruri (tên đồng nghĩa Phyllanthus amarus) : Toàn thân có màu xanh tươi, cành ngắn, rất ít phân nhánh, phiến lá có màu xanh nhạt, ngắn và mỏng hơn Diệp hạ châu thân đỏ Khi nhai có vị đắng nên trong đông y được gọi là cây Diệp hạ châu đắng Cây Diệp hạ châu thân đỏ (Diệp hạ châu ngọt) Phyllanthus urinaria:... al., (2001) ghi nhận cây trồng phát triển tốt trong đất nhiễm các hóa chất độc hại có vi khuẩn nội sinh trong cây chứa những gen có khả năng phân hủy độc chất này Thực tế cho thấy nhiều cánh đồng nhiễm nitro-acromatics và những vi khuẩn nội sinh trong cây trồng tại đây chứa những gen phân hủy nitro-acromatics, những vi khuẩn nội sinh còn tồn tại trong đất vùng rễ của cây trồng hay có trong đất (Ryan et... sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập đến khi vi khuẩn ròng - Trữ vi khuẩn đã phân lập ròng trong môi trường PDA Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 23 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.3.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước... cho sự phát triển của cây đặc biệt là đặc tính kháng khuẩn ứng dụng trong lĩnh vực y học 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diệp Hạ Châu có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT... cành, phân nhánh rất nhiều, phiến lá có màu xanh hơi đậm, dài và dầy hơn cây Diệp hạ châu thân xanh Khi nhai có vị ngọt nên trong đông y được gọi là cây Diệp hạ châu ngọt Một loài Diệp hạ châu nữa Phyllanthus sp có màu xanh đậm, lá rời rạc, phiến lá hẹp và chóp nhọn hơn so với hai loài trên Loài này không được dùng làm thuốc B Phân bố, thu hái và chế biến Cây Diệp hạ châu răng cưa mọc hoang ở khắp nơi trong. .. dòng vi khuẩn cộng sinh thực vật như Methylbacterium phân lập từ cây Polar lai (Populus deltoids x nigra), cũng có khả năng phân hủy nitro-acromatics như 2,4,6-trinitro-toluene Sự phát hiện những vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy sinh học giúp cho chúng ta có thể sử dụng trực tiếp như là các chế phẩm sinh học phân hủy độc chất hay cắt chuyển gen có khả năng phân hủy độc chất vào những vi khuẩn. .. Biosafe II – ESCO (Singapore) - Nồi khử trùng nhiệt ướt - Tủ ủ vi sinh vật - Binder (Đức) - Máy ly tâm - Eppendorf - Máy vortex - Cân điện tử - Startorius (Đức) - Máy đo OD Backman Coulter - Kính hiển vi – Meji (Nhật) 3.2.3 Nguyên vật liệu Cây Diệp hạ châu được thu mẫu từ các vùng trên địa bàn huyện Lai Vung – tỉnh Đồng Tháp Vi khuẩn E.coli được cung cấp bởi phòng Công nghệ Sinh học Phân tử thuộc Vi n NC... đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và đặt tên theo bác sĩ nhi khoa Đức Vi khuẩn E.coli thuộc học Enterobacteriaceas, vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh đường ruột và các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 16 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học... yếu là cho công nghiệp dược 2.3.4 Vi khuẩn Burkholderia Vi khuẩn Burkholderia sống ở vùng rễ của nhiều loại cây khác nhau; các vi khuẩn thuộc giống Burkholderia được phân lập từ vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như bắp, mía, cà phê, lúa, cỏ Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm như khi các vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây lúa sẽ cố định đạm đến 19%