khuẩn phân lập.
a. Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb, New và Burk lỏng.
- Cho 15 mL môi trường lỏng NFb, New và Burk vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng)
b. Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
1. Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5g FeCl3 trong 1l H2SO4 10,8M 2. Chuẩn bị phosphat buffer 200mL:
A: KH2PO4 0,136g/100 mL nước cất. B: K2HPO4 0,174g/100 mL nước cất.
3. Lấy 39mL A, 61mL B cho thêm nước cất vừa đủ 200mL, chỉnh pH = 7 4. Hút 1, mL dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. 5. Ly tâm 5.500 vòng/phút trong 10 phút.
6. Hút cẩn thận 1 mL phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham. 7. Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm.
8. Chuẩn bị đường chuẩn IAA:
Cân 0,0016g IAA thương mại hòa tan với 10mL phosphate buffer được nồng độ là 160µg/L. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/mL. Sau đó, cho 2mL thuốc thử vào, để ủ 20 phút trong tối cho phản ứng xảy ra hoàn toàn.
9. Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 40µg/mL.
10. Kết quả đo OD các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp…