Sau khi kiểm tra khả năng tổng hợp NH4+ và khả năng tổng hợp IAA và tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập, chọn một số dòng có khả năng tổng hợp ammonium, tổng hợp IAA và có tính kháng khuẩn để giải trình tự gen 16S rRNA.
Quy trình trích ADN nhanh theo phương pháp của Barberio và Fani (1998). -Cấy vi khuẩn từ ống trữ ròng lên đĩa Petri chứa môi trường LB. Ủ 24h trong
tủ ủ ở 30°C.
-Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf
-Cho bi vào từng tuýp Eppendorf và trộn đều dung dich trên máy ly tâm. -Ủ ở 95°C trong 10 phút (ủ trong water bath).
-Lập tức đem ngâm đá nhanh trong 10 phút để phá vỡ tế bào của vi khuẩn -Ly tâm nhẹ hai lần. Thu được dịch trích ADN của vi khuẩn.
-Đem trữ ở -20°C nếu chưa tiến hành quy trình PCR. -Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR -Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) Thành phần Thể tích (μl) Nước cất hai lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 dNTPS 4,0 DMSO 0,5 Mồi F 0,25
Mồi R 0,25
Taq DNA polymerase (5U/µl) 0,25
ADN vi khuẩn 2,0
Tổng thể tích 25
Quy trình PCR
-Biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút.
-Tiếp theo là 3 chu trình được gia nhiệt như sau: + 95°C trong 1 phút
+ 49°C trong 1 phút + 72°C trong 1 phút
-Bước cuối cùng là 72°C trong 10 phút.
-Sản phẩm PCR sau đó được trữ lạnh ở -20°C để điện di Điện di gel agarose sản phẩm PCR
-Chuẩn bị gel nhỏ : (20ml) + Agarose (1%): 0,2g + TAE buffer (1X): 20ml
-Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lò vi sóng (microwave) -Sau khi nấu để nguội khoảng 50 – 60°C, bổ sung EtBr 0,4μl -Rót gel vào khuôn
-Sau khi rót gel vào khuôn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu.
-Load mẫu: dùng Micropipet hút 10μl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10μl mẫu DNA vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng.
-Điện di 60 phút ở 90V.
Với cặp mồi 16SrRNA (Lane, 1991)
Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3 Chụp hình gel bằng máy chụp gep Bio – Rad.
Các số liệu thí nghiệm được tính toán thống kê bằng phầm mềm Statgraphics 16.1.18 (32 bit).
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN