phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá (houttuynia cordata t.) ở tỉnh đồng tháp

So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ cây Diếp cá Nhóm 1 .... So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh trong cây Diếp cá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH

TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.)

Ở TỈNH ĐỒNG THÁP

PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP TRỊNH THỊ LỆ HOA

MSSV: 3113715 LỚP: VSVH K37

Cần Thơ, Tháng 11/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH

TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.)

Ở TỈNH ĐỒNG THÁP

PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP TRỊNH THỊ LỆ HOA

MSSV: 3113715 LỚP: VSVH K37

Cần Thơ, Tháng 11/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp Trịnh Thị Lệ Hoa DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký tên)

LỜI CẢM TẠ Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất nhiều sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý Thầy, Cô, sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn cùng sự quan tâm và động viên từ gia đình Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn

PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ - người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận văn này

Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống

Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn thành công

Cần Thơ, ngày 30 tháng 11 năm 2014

Trịnh Thị Lệ Hoa

TÓM TẮT

Diếp cá (Houttuynia corata T.) là một trong những cây có tính kháng khuẩn tốt

đã được ứng dụng trong y học, nhưng các nghiên cứu trước đây chỉ sử dụng dịch trích

mà chưa quan tâm nhiều đến vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá Vì vậy, việc phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá được thực hiện Mười bảy dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá thu ở huyện Châu Thành và huyện Lai Vung thuộc tỉnh Đồng Tháp Hầu hết vi khuẩn đều có dạng hình que, một số khác có dạng cầu đôi Trong đó có 14 dòng thuộc vi khuẩn Gram âm và 3 dòng thuộc vi khuẩn Gram dương, phần lớn chúng đều có khả năng chuyển động Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA cho thấy, tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp đạm và IAA Trong đó, dòng DR3 tổng hợp đạm cao nhất ở ngày thứ 6 và dòng DR2 tổng hợp IAA cao nhất ở ngày thứ 4 Chỉ có một dòng

vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan Khảo sát khả năng kháng khuẩn của 17 dòng vi khuẩn phân lập được, kết quả cho thấy 7 dòng có khả năng kháng Aeromonas hydrophila, 9 dòng có khả năng kháng Escherichia coli và 7 dòng có khả năng kháng được cả 2 loài vi khuẩn gây bệnh

Kết quả giải trình tự gene 16S-rRNA, dòng DR2, DR3 và DL4 được nhận diện là Bacillus aryabhattai dòng B8W22 với tỉ lệ đồng hình lần lượt là 95%, 97% và 96%

Từ khóa: Ammonium, Diếp cá, hòa tan lân, IAA, kháng khuẩn, vi khuẩn nội sinh

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH xi

CÁC TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Đồng Tháp 3

2.1.1 Vị trí địa lý 3

2.1.2 Địa hình 3

2.1.3 Khí hậu 4

2.1.4 Thủy văn 4

2.2 Sơ lược về cây Diếp cá 4

2.2.1 Tên gọi và phân loại 4

2.2.2 Đặc điểm 5

2.2.3 Phân bố 5

2.2.4 Thành phần hóa học 5

2.2.5 Tác dụng của cây Diếp cá trong y học 6

2.2.5.1 Tác dụng kháng khuẩn 6

2.2.5.2 Tác dụng kháng viêm 6

2.2.5.3 Tác dụng trên hệ hô hấp 6

2.2.5.4 Tác dụng trên hệ miễn nhiễm 6

2.2.5.5 Tác dụng lợi tiểu 7

2.2.5.6 Tác dụng chống oxy hóa 7

2.2.5.7 Tác dụng chống ung thư 7

2.3 Vi khuẩn nội sinh 8

2.3.1 Định nghĩa vi khuẩn nội sinh 8

2.3.2 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh 8

2.3.3 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh 8

2.3.3.1 Nguồn gốc 8

2.3.3.2 Di chuyển 9

2.3.3.3 Tiếp cận 9

2.3.3.4 Xâm nhập hay xuyên thấu 9

2.3.3.5 Sinh sản 10

2.3.3.6 Xâm nhập 10

2.3.3.7 Định cư 10

2.3.4 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 10

2.3.4.1 Khả năng cố định đạm 10

2.3.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan 11

2.3.4.3 Khả năng tổng hợp IAA 12

2.3.4.4 Khả năng đối kháng sinh học 12

2.4 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp 13

2.4.1 Vi khuẩn Bacillus 13

2.4.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 13

2.4.1.2 Vi khuẩn Bacillus cereus 14

2.4.2 Vi khuẩn Klebsiella 14

2.4.3 Vi khuẩn Pseudomonas 14

2.4.4 Vi khuẩn Azotobacter 15

2.4.5 Vi khuẩn Azospirillum 15

2.5 Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp 16

2.5.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 16

2.5.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A hydrophila) 16

2.6 Tình hình nghiên cứu cây Diếp cá trong và ngoài nước 17

2.6.1 Trong nước 17

2.6.2 Ngoài nước 17

2.7 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 18

2.7.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR 18

2.7.2 Mồi (primer) sử dụng trong kỹ thuật PCR 19

2.8 Điện di gel agarose 20

2.8.1 Nguyên tắc của kỹ thuật điện di 20

2.8.2 Điện di trên gel agarose 20

2.9 Phương pháp giải trình tự DNA 20

2.9.1 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy 20

2.9.2 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động 21

2.9.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã 21

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Phương tiện nghiên cứu 23

3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực hiện 23

3.1.2 Vật liệu 23

3.1.3 Dụng cụ - Thiết bị 23

3.1.4 Hóa chất 24

3.1.4.1 Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn 24

3.1.4.2 Hóa chất trích DNA 24

3.1.4.3 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR 24

3.1.4.4 Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh 25

3.1.4.5 Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ 26

3.1.4.6 Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân 27

3.2 Phương pháp nghiên cứu 27

3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu 27

3.2.2 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá 28

3.2.3 Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và kích thước vi khuẩn 28

3.2.4 Nhuộm Gram vi khuẩn 30

3.2.5 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ 31

3.2.5.1 Nguyên tắc 31

3.2.5.2 Hóa chất 31

3.2.5.3 Tiến hành thí nghiệm 31

3.2.5.4 Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 và 8 (sau khi chủng) 31

3.2.6 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan 33

3.2.7 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA 33

3.2.7.1 Chuẩn bị 33

3.2.7.2 Hóa chất 33

3.2.7.3 Phương pháp 34

3.2.8 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn 35

3.2.9 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh 35

3.2.10 Xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 38

4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc 39

4.1.2 Đặc điềm tế bào vi khuẩn 42

4.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa trên lượng NH4 + (ammonium) tổng hợp được 43

4.2.1 So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ cây Diếp cá (Nhóm 1) 44

4.2.2 So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân cây Diếp cá (Nhóm 2) 46

4.2.3 So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ

lá cây Diếp cá (Nhóm 3) 48

4.2.4 So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh trong cây Diếp cá 50

4.3 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá 52

4.4 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA (indol-3-acetic acid) của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá 53

4.4.1 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ của cây Diếp cá (Nhóm 1) 54

4.4.2 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khau6n3 phân lập được từ thân của cây Diếp cá (Nhóm 2) 56

4.4.3 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ lá của cây Diếp cá (Nhóm 3) 57

4.4.4 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh trong cây Diếp cá 58

4.5 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá 60

4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Escherichia coli 60

4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Aeromonas hydrophila 62

4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 65

CHƯƠNG 5 KẾ LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 78

Phụ lục 1: Hình biểu đồ đường chuẩn NH4

+

và IAA

1 Đường chuẩn đo đạm

2 Đường chuẩn đo IAA

a Khả năng kháng E coli của các dòng vi khuẩn phân lập được

b Khả năng kháng A hydrophila của các dòng vi khuẩn phân lập được

Phụ lục 3: Kết quả giải trình tự

1 Trình tự gen mã hóa 16S-rRNA của dòng DR2

2 Trình tự gen mã hóa 16S-rRNA của dòng DR3

3 Trình tự gen mã hóa 16S-rRNA của dòng DL4

Phụ lục 4: Kết quả thống kê

1 Kết quả thống kê lượng ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được

a Kết quả thống kê lượng ammonium của 17 dòng vi khuẩn phân lập được

b Kết quả thống kê lượng ammonium của các dòng vi khuẩn ở rễ

c Kết quả thống kê lượng ammonium của các dòng vi khuẩn ở thân

d Kết quả thống kê lượng ammonium của các dòng vi khuẩn ở lá

2 Kết quả thống kê lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được

a Kết quả thống kê lượng IAA của 17 dòng vi khuẩn phân lập được

b Kết quả thống kê lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở rễ

c Kết quả thống kê lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở thân

d Kết quả thống kê lượng IAA của các dòng vi khuẩn ở lá

3 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn

a Kết quả khảo sát khả năng kháng E coli

b Kết quả khảo sát khả năng kháng A hydrophila

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) 25

Bảng 2: Môi trường PDA 25

Bảng 3: Môi trường NFb (g/l) (Krieg và Dobereiner, 1984) 26

Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng 26

Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin 26

Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) 27

Bảng 7: Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh 36

Bảng 8: Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc 39

Bảng 9: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá 40

Bảng 10: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA đặc 42

Bảng 11: Lượng ammonium do 17 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá tổng hợp theo thời gian (µg/mL) 44

Bảng 12: Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ tổng hợp theo thời gian (µg/mL) 45

Bảng 13: Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn phân lập từ lá tổng hợp theo thời gian (µg/mL) 48

Bảng 14: Hiệu quả hòa tan lân của dòng DR1 trên môi trường NBRIP đặc 53

Bảng 15: Lượng IAA do 17 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ cây Diếp cá tổng hợp theo thời gian (µg/mL) 54

Bảng 16: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ tổng hợp theo thời gian (µg/mL) 55

Bảng 17: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn phân lập từ lá tổng hợp theo thời gian (µg/mL) 58

Bảng 18: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E

coli 62

Bảng 19: Kết quả nhận diện 3 dòng vi khuẩn triển vọng 65

Bảng 20: Đặc điểm khuẩn lạc của 3 dòng vi khuẩn giải trình tự 66

Bảng 21: Đặc điểm tế bào của 3 dòng vi khuẩn giải trình tự 66

Bảng 22: Hàm lượng đạm và hàm lượng IAA của 3 dòng vi khuẩn giải trình tự 67

Bảng 23: Hiệu quả kháng khuẩn với vi khuẩn E coli và A hydrophila của 3 dòng vi khuẩn giải trình tự 67

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Bản đồ hành chính tỉnh Đồng Tháp 3

Hình 2: Cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) 5

Hình 3: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ 32

Hình 4: Xây dựng đường chuẩn đo IAA 34

Hình 5: Vòng pellicle xuất hiện sau 2 – 3 ngày chủng vi khuẩn vào môi trường NFb bán đặc 38

Hình 6: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường PDA đặc 41

Hình 7: Vi khuẩn có Gram âm (A) và Gram dương (B) 43

Hình 8: Hàm lượng ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân cây Diếp cá 46

Hình 9: Hàm lượng ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng phân lập được từ cây Diếp cá 50

Hình 10: Vòng halo do dòng vi khuẩn DR1 tạo ra trên môi trường NBRIP 52

Hình 11: Hàm lượng IAA của các dòng vi kkhuẩn phân lập được từ thân của cây Diếp cá 56

Hình 12: Hàm lượng IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng phân lập được từ cây Diếp cá 59

Hình 13: Khả năng kháng khuẩn của dòng DL1 và DL3 với vi khuẩn E coli sau 1 ngày ủ 61

Hình 14: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn A hydrophila 63

Hình 15: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn DL4 và DL2 với vi khuẩn A hydrophila sau 1 ngày ủ 64

Hình 16: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA 65

CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

IAA Indole – 3 – Acetic Acid

NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate

NFb Nitrogen fixing bacteria

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato dextrose agar

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, khi khoa học phát triển, con người đã biết tổng hợp các chất có hoạt

tính sinh học điều trị bệnh từ các cây thuốc có trong tự nhiên, mà chất lượng không hề

thua kém các sản phẩm thuốc làm từ hóa học Thậm chí, dược phẩm sản xuất từ thiên

nhiên còn có nhiều ưu điểm như ít tác dụng phụ, thường không có độc tính và đem lại

hiệu quả điều trị lâu dài

Với điều kiện thiên nhiên nhiều ưu đãi, Việt Nam có một hệ sinh thái phong

phú và đa dạng, có nhiều tiềm năng để phát triển nguồn dược liệu Trong đó, có nhiều

cây dược liệu có tính kháng khuẩn đã được Y học dân tộc dùng làm thuốc Trong số đó

có thể kể đến cây Diếp cá Diếp cá là loại rau rất quen thuộc trong các bữa ăn hàng

ngày của các gia đình Việt Nam, nhất là các tỉnh phía Nam Thường dùng làm rau ăn

sống, làm gia vị cùng các loại rau khác Diếp cá cũng được sử dụng làm thuốc trị một

số bệnh như táo bón, sởi, viêm cơ, đau mắt, viêm phổi, nhiễm trùng

Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất

(Wedelia chinensis M.), cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp hạ châu

(Phyllanthus urinaria L.)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng

khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như

methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal Nhóm terpen bao gồm các chất α

pinen, camphen,… Có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia,

Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E coli (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh ở cây dược liệu chưa

được quan tâm nhiều Do đó, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát

triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan

trọng trong giai đoạn hiện nay

Vì vậy, nhằm mục đích phát hiện các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá

nên đề tài: “Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá (Houttuynia corata T.) ở tỉnh

Đồng Tháp” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập được các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Diếp cá ở tỉnh Đồng

Tháp có những đặc tính tốt như: tính kháng khuẩn, khả năng cố định đạm, tổng hợp

IAA và hòa tan lân

Hình 1: Bản đồ tỉnh Đồng Tháp

(Nguồn http://tulieu.violet.vn/document/, ngày 2/6/2014)

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Đồng Tháp

2.1.1 Vị trí địa lý

Đồng Tháp là tỉnh thuộc khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long, nằm trong giới

hạn tọa độ 10°07’ - 10°58’ vĩ độ Bắc và 105°12’ - 105°56’ kinh độ Đông Phía Tây

Bắc giáp tỉnh Prây Veng (Campuchia), phía Nam giáp tỉnh Vĩnh Long và thành phố

Cần Thơ, phía Tây giáp tỉnh An Giang, phía Bắc giáp tỉnh Long An và Tiền Giang

(Nguồn http://vi.wikipedia.org, ngày 31/5/2014)

2.1.2 Địa hình

Địa hình Đồng Tháp tương đối bằng phẳng với độ cao phổ biến 1–2 m so với

mặt biển Địa hình được chia thành 2 vùng lớn là vùng phía bắc sông Tiền và vùng

phía nam sông Tiền

(Nguồn http://vi.wikipedia.org, ngày 31/5/2014)

2.1.3 Khí hậu

Đồng Tháp nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, đồng nhất trên địa giới toàn tỉnh,

có 2 mùa rõ rệt, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 đến tháng 4

năm sau Nhiệt độ trung bình năm là 27oC, số giờ nắng trung bình 6,8 giờ/ngày Lượng

mưa trung bình từ 1.170 – 1.520 mm, tập trung vào mùa mưa, chiếm 90 – 95% lượng

mưa cả năm Đặc điểm khí hậu này tương đối thuận lợi cho phát triển nông nghiệp

toàn diện

(Nguồn http://vi.wikipedia.org, ngày 31/5/2014)

2.1.4 Thủy văn

Đồng Tháp có hệ thống sông, ngòi, kênh, rạch chằng chịt, nhiều ao, hồ lớn

Sông chính là sông Tiền (một nhánh của sông MêKông) chảy qua tỉnh với chiều dài

132 km Dọc theo hai bên bờ sông Tiền là hệ thống kênh rạch dọc ngang Đường liên

tỉnh giao lưu thuận tiện với trên 300km đường bộ và một mạng lưới sông rạch thông

thương

(Nguồn http://vietnamtourism.com/, ngày 31/5/2014)

2.2 Sơ lược về cây Diếp cá

2.2.1 Tên gọi và phân loại

Cây Diếp cá còn có tên là cây Lá giấp, Ngư tinh thảo

Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb Thuộc họ Lá giấp Saururaceae (Đỗ

- Chi Diếp cá (Houttuynia Thunb.)

- Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.)

Hình 2: Cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.)

(Hình chụp, ngày 2/6/2014)

2.2.2 Đặc điểm

Diếp cá là loại cây thân thảo, sống lâu năm, có thân rễ mọc ngầm dưới đất

Phần thân trên mặt đất cao 15-50 cm, có màu lục hoặc màu tím đỏ Lá mọc so le

Cuống lá dài, phiến lá hình tim dài 4-6 cm, rộng 3-4 cm, có 5-7 gân gốc Hoa nở vào

tháng 5-8 Cụm hoa là 1 bông dài 2,5 cm bao bởi 4 lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều

hoa nhỏ màu vàng nhạt Trông toàn bộ bề ngoài cụm hoa và lá bắc giống như một cái

hoa đơn độc Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn (Phạm Hoàng Hộ, 1999)

2.2.3 Phân bố

Cây Diếp cá phân bố ở Nhật Bản, Trung Quốc, Nepal, Ấn Độ, các nước Đông

Dương và Indonesia Ở nước ta, cây Diếp cá mọc rất phổ biến Thường gặp mọc hoang

nơi ẩm ướt trên các bãi ven suối, bờ sông

(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki)

2.2.4 Thành phần hóa học

Thành phần hoá học của cây Diếp cá: Nước 91,5%; protid 2,9%; glucid 2,7%,

lipid 0,5%, cellulose 1,8%, dẫn xuất không protein 2,2%, khoáng toàn phần 1,1%

(ngoài ra trong đó có calcium, kali, caroten, vitamin C)

Theo Đỗ Tất Lợi (2004), trong cây có khoảng 0,0049% tinh dầu và một ít chất

alkaloid Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton, chất myrcen, axit

caprinic và laurinaldehyt Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin

Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7%

2.2.5 Tác dụng của cây Diếp cá trong y học

2.2.5.1 Tác dụng kháng khuẩn

Diếp cá có khả năng chống lại Herpes type I và II Trong đó khả năng chống lại

Herpes type II mạnh hơn so với type I Ngoài ra Diếp cá còn có tác dụng ngăn cản sự

sinh sản của các vi khuẩn Streptococcus pneumonia (gây sưng phổi) và

Staphylococcus aureus (gây mụn nhọt có mủ) Tác dụng trên các vi khuẩn Shigella,

Salmonella và E.coli (gây kiết lỵ, tiêu chảy) thì yếu hơn

Theo Zhang et al (2008) Diếp cá còn có khả năng diệt được Gonococcus (gây

bệnh lậu mủ) và ngăn cản sự phát triển của các siêu vi khuẩn cúm

Cây Diếp cá có khả năng ức chế phát triển của vi khuẩn E.coli O157- H7 giống

như kháng sinh beta-lactam (Kim et al., 2010)

2.2.5.2 Tác dụng kháng viêm

Theo Zhang et al (2008) hoạt chất trong Diếp cá có khả năng chống sưng viêm

và làm hạ sốt Do các acid béo trong lá khô có khả năng ngăn chặn sự tổng hợp

prostaglandin - thủ phạm gây ra phản ứng sưng viêm (do phản ứng loại ức chế

cyclooxygenase) Diếp cá còn được dùng để điều trị hen suyễn, viêm mũi dị ứng do tác

dụng ức chế phản ứng quá mẫn qua trung gian tế bào Mast

2.2.5.3 Tác dụng trên hệ hô hấp

Khi trích dung dịch nước Diếp cá qua màng phúc mô thỏ tác dụng hạ ho được

nhận thấy rõ rệt Khả năng trị bệnh nhiễm trùng đường hô hấp của Diếp cá cũng đã

được chứng minh rõ ràng:

- Khi dùng liều cao (60 g) để trị bệnh sưng phổi có ung nhọt, kết quả rất tốt, ung

nhọt biến mất và không để lại di chứng sau 2 tuần điều trị

- Dịch chiết nước Diếp cá cũng rất hữu hiệu khi trị các bệnh ho do phổi bị tắc

nghẽn kinh niên (Zhang et al., 2008)

2.2.5.4 Tác dụng trên hệ miễn nhiễm

Chất decanoyl acetaldehyde trong Diếp cá có khả năng làm tăng tính thực bào

của các tế bào bạch cầu, đồng thời cũng tăng tỷ lệ properdin nên giúp tăng khả năng

của hệ miễn nhiễm chống lại các bệnh tật, tăng sức đề kháng để ngăn ngừa các bệnh

do siêu vi khuẩn (Zhang et al., 2008)

2.2.5.5 Tác dụng lợi tiểu

Tác dụng này có được có thể là do liên quan đến các chất quercitrin,

isoquercitrin và muối kali trong cây Diếp cá Khi dùng dịch chiết nước Diếp cá để

ngâm tưới trên thận của cóc và chân của ếch thì nhận thấy các vi mạch máu giãn nở,

làm gia tăng sự lưu thông của máu và tạo ra sự tăng bài tiết nước tiểu Chất

isoquercitrin còn có tác dụng làm tăng sự bền chắc của các vi mạch máu

Vì vậy các bệnh nhân cao huyết áp nên ăn thêm Diếp cá để giúp lợi tiểu, hạ

huyết áp, đồng thời giúp mạch máu vững chắc hơn (Zhang et al., 2008)

2.2.5.6 Tác dụng chống oxy hóa

Diếp cá có tác dụng kháng bleomycin (chất gây ra sự xơ hoá phổi ở chuột) Mặc

dù dịch chiết nước Diếp cá có tác dụng dọn sạch gốc tự do và tác dụng ức chế oxy hoá

xanthin yếu hơn vitamin E nhưng hoạt tính ức chế sự peroxid hoá lipid tế bào gan ở

chuột tương đương với vitamin E

Diếp cá có chứa các hợp chất flavonoid như phloretin-2’-0-β-D-glucopyranosid,

quercetin-3-0-β-D-galactopyranosid có tác dụng đối với sự peroxy hóa lipid màng

tế bào gan bằng cách hạn chế quá trình peroxy góp phần bảo vệ tế bào và duy trì sự

hoạt động bình thường của tế bào (Võ Văn Chi, 2004)

2.2.5.7 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết nước Diếp cá có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa và đột biến

gen Nồng độ polyphenol trong dịch chiết nước cao hơn dịch chiết methanol, và khả

năng kháng đột biến gen của dịch chiết nước cao hơn dịch chiết methanol

Dịch chiết aceton 70% trong nước của cây Diếp cá có chứa các hợp chất

flavonoid như phloretin-2’-0-β-D-glucopyranosid, quercetin-3-0-β-D galactopyranosid

có khả năng kháng ung thư ở các dòng tế bào ung thư Sarcoma-180 trong thử nghiệm

in vitro và invivo gây ung thư trên chuột

Lai et al (2010) cho biết, chiết xuất từ cây Diếp cá có khả năng ức chế sự tăng

trưởng của các tế bào gây ung thư trực tràng

Các alkaloid được tìm thấy trong dịch chiết methanol của cây Diếp cá có tác

dụng chống lại 5 dòng tế bào ung thư ở người (A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF-498

và HCT-15) (Kim et al., 2007)

2.3 Vi khuẩn nội sinh

2.3.1 Định nghĩa vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian chu kì sống

của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn này

có lợi ích đối với cây (Kobayashi et al., 2000; Bandara et al., 2006)

2.3.2 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang dại,

chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo nhiều cách Có thể chúng

bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên, thông qua lông hút, giữa các

tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống như: Azotobacter, Bacillus,

Gluconacetobacter, Pseudomonas, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter,

Herbaspirillum, Derxia, Paenibacillus (Elmerich, 2007) Tuy nhiên nó cũng có thể xâm

nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí tổn thương của lá Sau khi xâm

nhập vào cây chủ , các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát

tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay

vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002) Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất

biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng

cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường

(Pillay et al., 1997; Tan et al., 2003)

Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh đối với cây chủ mà

nhiều loài còn có khả năng tổng hợp IAA, cố định đạm từ không khí và hòa tan lân

khó tan, kích thích cây tăng trưởng và làm tăng năng suất cây trồng

(Muthukumarasamy et al., 2002) Một số dòng đã mang lại hiệu quả cao trong kiểm

soát bệnh của cây, nhất là hạn chế nguồn bệnh trong đất như Fusarium oxysporum,

Gaeumannomyces graminis, Pythium spp…

2.3.3 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh

2.3.3.1 Nguồn gốc

Qua những kết quả thu được từ thân, lá, hạt, rễ (Mano và Morisaki, 2008) cho

rằng nguồn của vi khuẩn nội sinh là đất vùng rễ Kết hợp nhiều kết quả phân lập vi

khuẩn nội sinh từ rễ cây lúa mì, bông vải, bắp ngọt, bắp đá và cải canola đều kết luận

vi khuẩn nội sinh xuất phát từ đất Vai trò của hạt như là một nguồn của vi khuẩn nội

sinh vẫn là một điều còn tranh luận (Hallmann et al., 1997)

2.3.3.2 Di chuyển

Theo Hallmann (2001), thường vi khuẩn nội sinh được thu hút hay di chuyển từ

môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động hay ngẫu nhiên hoặc

cả hai cơ chế

Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp chất như là dưỡng chất để vi khuẩn nội sinh

tìm đến và quần tụ trên bề mặt rễ, ví dụ vi khuẩn có ích Pseudomonas fluorescens và

Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa mì do rễ lúa mì tổng hợp và phóng thích chất

kích thích tổng hợp (Bashan, 1986)

2.3.3.3 Tiếp cận

Một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn nội sinh vào bề mặt rễ là lectin

Đây là hợp chất rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn cộng sinh và

giả thiết này cũng được các nhà khoa học đề cập đến vi khuẩn nội sinh

2.3.3.4 Xâm nhập hay xuyên thấu

Theo Hallmann (2001), có nhiều con đường chính để vi khuẩn nội sinh xâm

nhập vào bên trong mô thực vật như:

- Các lỗ tự nhiên như thủy khổng (Hydathodes), lỗ khí khổng (stomata), lỗ rễ (bì

khổng= lenticels)

- Lỗ từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ ngang (lateral roots)

- Vi lỗ (micropores)

- Vết thương do tác động vật lý (wounds)

Tuy nhiên con đường quan trọng và có khả năng nhất là vi khuẩn nội sinh xâm

nhập vào bên trong mô thực vật theo vết thương và vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình

thành lông hút, đây là lớp tế bào non rất dễ xâm nhập

Vết bệnh cũng có thể là vị trí cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong, ví dụ như

trường hợp vết bệnh từ tuyến trùng (Hallmann et al., 1997)

Ngoài ra vi khuẩn có thể tiết ra enzyme cellulase để phá hủy lớp tế bào biểu bì

của rễ non để xâm nhập vào bên trong thực vật như trường hợp vi khuẩn

Gluconacetobacter diazotrophicus

2.3.3.5 Sinh sản

Vi khuẩn nội sinh tập trung hay tiếp cận các địa điểm mà chúng có khả năng

xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật số tương đối thấp chỉ từ 1.000 đến

1.000.000 tế bào/g mô thực vật (Hallmann, 2001) và chúng bắt buộc phải sinh sản một

số lượng tương đối lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật Hurek et al

(1994) cho rằng sự phân cắt hay sinh sản vi khuẩn Azoarcus sp được tìm thấy bên

ngoài và cả bên trong nhu mô rễ lúa và cỏ Kallar

2.3.3.6 Xâm nhập

Hallmann (2001) tóm tắt sự xâm nhập của vi khuẩn nội sinh vào bên trong mô

thực vật bằng 7 con đường như sau:

- Tập trung và xâm nhập ngẫu nhiên trên bề mặt rễ non

- Tập trung và xâm nhập bên dưới lớp biểu bì rễ

- Tập trung và xâm nhập ngay vết thương ở rễ do sự ma sát

- Tập trung và xâm nhập ngay lỗ mọc các lông hút

- Tiếp cận đầu lông hút của rễ non để di chuyển vào trong

- Len lỏi khoảng hở giữa các tế bào rễ

- Có thể đi theo trong quá trình hấp thu chất dinh dưỡng vào rễ qua con đường

các mạch gỗ

2.3.3.7 Định cư

Sau khi xâm nhập vào trong nhu mô thực vật, vi khuẩn nội sinh di chuyển đến

các bó mạch gỗ để theo nước từ rễ lên các phần khác trên không của cây Vi khuẩn nội

sinh cũng có thể tập trung sinh sống và phát triển trong các tế bào nhu mô lá, tế bào

diệp lục Ở đây chúng có thể phát triển lâu dài hay có thể tiếp tục sinh sản và di

chuyển đến các bộ phận khác của cây

2.3.4 Một số đặc tính của vi kuẩn nội sinh

2.3.4.1 Khả năng cố định đạm

Đạm là dưỡng chất rất cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của thực vật

Trong không khí đạm có đến 78% nhưng cây trồng không hấp thu trực tiếp được

Các quá trình cố định đạm sinh học tự nhiên nhờ vi khuẩn cố định đạm, hàng

năm trên thế giới có khoảng 160 – 176 triệu tấn nitơ khí quyển đã được cố định và

chuyển hóa thành nguồn phân đạm dưới các dạng khác nhau (Hardy et al., 1992)

Lượng đạm này ước tính gấp khoảng 2 lần lượng phân bón sản xuất ra hàng năm trên

toàn thế giới

Trong quá trình cố định đạm sinh học, khâu then chốt của toàn bộ chu trình nitơ

là sự khử liên kết của N2 thành NH3 nhờ vào nguồn năng lượng ATP, sự hoạt động của

phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase (Yan et al., 2008)

Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase biến đổi N2 thành NH3

theo công thức:

N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP + 16H2O → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Ammonia (NH3) được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon để

đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng Việc đánh

giá về khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn được phân lập cũng là một khâu

quan trọng để phân loại chúng

Trong nhiều trường hợp, sự phát triển của vi khuẩn cấy ở các môi trường đặc,

bán đặc hay môi trường lỏng không đạm thì không đủ bằng chứng cho hoạt tính cố

định đạm của vi khuẩn Các điều kiện sinh lý tương thích với hoạt tính nitrogenese và

sự phát hiện về hoạt tính này bằng các thử nghiệm khử acetylene cũng có thể không

đem lại kết quả như mong muốn

Để sự cố định đạm nội sinh có hiệu quả thì cần phải cung cấp đầy đủ các chất cần

thiết từ cây chủ và các điều kiện môi trường thích hợp cho sự cố định đạm liên kết Do

đó, sự chứng minh phân tử về sự có mặt của các gen nif trong bộ gen của vi khuẩn

được giả định là cố định đạm thường được xem là vật chỉ thị đáng tin cậy để phân loại

vi khuẩn (Elmerich, 2007)

2.3.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan

Lân (P) là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu nhất cần cho sự

sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Illmer và Schinner, 1992) Nhìn chung, lân sẵn

có trong đất cần cho sự sinh trưởng thực vật thấp, hàm lượng lân trung bình trong đất

khoảng 0,05% (w/w) nhưng chỉ có 0,1% hàm lượng lân tổng số là có giá trị cho cây

(Zou et al., 1992) Tuy nhiên, các dạng có thể hòa tan của phân lân khi bón vào đất lại

dễ dàng bị kết tủa thành các dạng không hòa tan được như là: CaHPO4, Ca3(PO4)2,

FePO4 và AlPO4 nên cây khó hấp thu (Omar, 1998) và dẫn đến việc bón phân lân vượt

quá mức đối với đất trồng

Một số vi sinh vật được biết là có liên quan đến sự hòa tan của các phosphate

không tan (Alexander, 1977) Các vi sinh vật hòa tan phosphate làm cho phosphate

khó tan trở thành dạng có thể hòa tan bằng quá trình acid hóa và làm giảm pH do các

acid hữu cơ được vi khuẩn tiết ra tạo ra nhiều ion H+ (Lin et al., 2006) Các acid hữu

cơ được sản xuất bởi vi khuẩn và nấm trong quá trình hòa tan lân khó tan chủ yếu là:

citric, lactic, gluconic, oxalic, tartaric, acetic và 2-ketogluconic acid (Speber, 1985;

Duff, 1963)

Theo Moghimi và Tate (1978), ngoài cơ chế acid hóa, các vi khuẩn còn có thể

hòa tan lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion Trong đó phức

cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp hòa tan lân khó tan khi cấu

trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức

2.3.4.3 Khả năng tổng hợp IAA

Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự

sinh trưởng thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa

sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng Tác

động của auxin phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ như nhau IAA kích thích

đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự

khởi đầu của rễ bên và thành lập lông rễ (Theologies và Ray, 1982; Gray et al., 2001)

Theo Sergeeva et al (2002), các nhóm vi khuẩn khác nhau kể cả vi khuẩn đất,

vi khuẩn biểu sinh, vi khuẩn nội sinh và một số Cyanobacteria đã được phát hiện là có

khả năng sinh tổng hợp indole-3-acid acetic từ tiền chất L-tryptophan (Trp) Ngoại trừ

một số loài của những nhóm này như Pseudomonas savastanoi và Agrobacterium

tumefaciens có liên quan đến bệnh thực vật, ở các loài còn lại thì kích thích sự sinh

trưởng của thực vật (Patten và Glick, 1996)

2.3.4.4 Khả năng đối kháng sinh học

Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các

sinh vật gây hại, điều này có thể dẫn đến hiện tượng gia tăng kháng bệnh (ISR =

induced systemic resistance) hay kích kháng (SAR = systemic-acquired resistance) Vi

khuẩn nội sinh có vai trò trong việc ngăn chặn tác hại của nấm Fusarium oxysporum f

sp pisi trên đậu pea (Benhamou et al., 1996)

2.4 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc, hiện nay người ta đã phân

lập được trên dưới 200 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá như Azospirillum,

Klebsiella…nhưng trong đó phải kể đến 2 chi có khả năng kháng khuẩn đó là Bacillus

và Pseudomonas

2.4.1 Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có

khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh

nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí

hoặc kỵ khí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động

bằng tiêm mao Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong

thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể

phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,

nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử

dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ, Một vài loài

có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol, hầu hết đều là loài ưa

nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30oC - 45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt

với nhiệt độ tối ưu là 65oC

Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH=7, một số phù hợp với pH=9-10 như Bacillus

alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH=2-6 như Bacillus acidocaldrius Bacillus có

khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng

được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, …

2.4.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và

đặc biệt là ở cỏ khô (Nguyễn Lân Dũng, 1983) Bacillus subtilis là vi khuẩn hình que,

ngắn, nhỏ, kích thước (3 –5) x 0,6 µm Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn

bào ít khi kết chuỗi sợi Khuẩn lạc khô, không màu hay xám nhạt, có thể màu trắng

hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm

nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch

Bacillus subtilis sinh trường tốt nhất ở 36 – 50oC, tối đa khoảng 60 oC Bào tử

của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao Bào tử hình bầu dục, kích thước

0,6–0,9µm

Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc

tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để

sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides,

acid amin, subtilisin

2.4.1.2 Vi khuẩn Bacillus cereus

Đây là loài có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides,

Bacillus thuringiensis Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí…

Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm

cho thực phẩm hư hỏng Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh

Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1–1,5) x (3–5)µm, có khi dài hơn, chúng

đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2–1,5)µm nằm

lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào Khuẩn lạc của chúng phẳng,

khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn Lân Dũng, 1983)

Theo nghiên cứu của Swetha Sunkar và Valli Nachiyar (2012), Bacillus cereus

sống nội sinh trên cây bứa mủ vàng (Garcinia xanthochymus) có khả năng diệt các

chủng vi khuẩn E coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella

typhi và Klebsiella pneumonia

2.4.2 Vi khuẩn Klebsiella

Vi khuẩn Klebsiella thuộc Gram âm, dạng hình que, ít chuyển động, có khả

năng kết nang thành bào xác, kỵ khí không bắt buộc, sống tự do trong đất hoặc có khả

năng xâm nhập và nội sinh trong cây trồng Klebsiella oxytoca có khả năng tổng hợp

IAA từ tiền chất tryptophan là 30µg/mg trọng lượng khô, mức độ biểu hiện hoạt tính

của nitrogenase trong phản ứng khử acetylene là khá cao

2.4.3 Vi khuẩn Pseudomonas

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự biến dưỡng

dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường

khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật

Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử

dụng trong công nghệ sinh học

Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que,

di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên

men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen

Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và

phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin,

cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất

dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas syringae (Glickmann et al., 1998; Suzuki et al., 2003; Xie

et al., 1996)

2.4.4 Vi khuẩn Azotobacter

Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ

đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974) Sự khám phá ra

vi khuẩn Azotobacter paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh

Đây là loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang Tuy nhiên, khi

Brown (1976) theo dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspanum

notatum cũng được cộng sinh với sự có mặt của Azotobacter paspali ở vùng rễ Bà cho

rằng Azotobacter paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspanum notatum chủ yếu

bằng việc tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm

2.4.5 Vi khuẩn Azospirillum

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có dạng hình que

ngắn, cong hoặc hình chữ S (như Azospirillum lipoferum) Đây là vi khuẩn có khả

năng tổng hợp IAA, khả năng cố định đạm, hòa tan lân và một số chất dinh dưỡng

khác

Năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn và

đã được Becking (1963) phát hiện lại Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự

liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau Sau

đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum (Tarrand

et al., 1978) Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và

được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980)

Trong những năm 1984 – 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống

Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986)

Trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm,

hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000),

sản xuất kích thích tố thực vật hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng

(Rangarajan et al., 2003)

2.5 Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp

2.5.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli)

Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceas, chiếm khoảng 80% vi khuẩn hiếu

khí, là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra nhiều

bệnh đường ruột và các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997)

Trong điều kiện bình thường vi khuẩn E coli khu trú chủ yếu ở phần sau của

ruột, ít khi hiện diện ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật Khi gặp điều kiện

thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn vi khuẩn bội nhiễm

đường tiêu hóa và gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Vi khuẩn E coli có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 40oC, nhiệt độ tối ưu là

37oC, pH thích hợp là 7,2 – 7,4 và một số chủng có thể phát triển trên môi trường tổng

hợp (Nguyễn Như Thanh, 1997)

Vi khuẩn E coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin (độc tố đường ruột),

Verotoxin (độc tố tế bào), Neurotoxin (độc tố thần kinh) Mỗi loại độc tố gắn với một

thể bệnh mà chúng gây ra Ngoài ra, vi khuẩn E coli có khả năng kháng lại một số loại

kháng sinh như: Amoxicillin, Chloramphenicol, Trimethroprim, Tetracyclin,

Streptomycin (Đỗ Ngọc Thúy và Cù Hữu Phú, 2002)

2.5.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A hydrophila)

Theo Lewis và Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống

Aeromonas thì A hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan

trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên

A hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỷ lệ chết từ

80-90% (Angka, 1990)

Trong giống Aeromonas có 2 nhóm, (1) loài vi khuẩn không di động (A

Salmonicida) thường gây bệnh ở các nước lạnh, (2) các loài vi khuẩn di động bao gồm

(A hydrophila, A caviae, A sobria) Đặc tính chung của của 3 loài vi khuẩn này là di

động nhờ có một tiêm mao, vi khuẩn hình que, Gram âm, hai đầu tròn, phản ứng

oxidase dương tính, khử nitrat Các loài vi khuẩn Aeromonas di động đều được phân

lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là A Hydrophila (Huỳnh Thị

Phượng Quyên, 2008)

2.6 Tình hình nghiên cứu cây Diếp cá trong và ngoài nước

2.6.1 Trong nước

Võ Văn Chi (2004), đã nghiên cứu rất cụ thể về hình thái và công dụng trị một

số bệnh của cây Diếp cá mà trong dân gian từ lâu đã sử dụng

Phan Văn Cư và Nguyễn Thị Thu Hường (2012), đã chiết tách và định lượng

sterols từ lá của cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) ở Tỉnh Thừa Thiên Huế

bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp Theo Hà Thị Bích Ngọc (2007) cây Diếp cá có

chứa beta-caroten và lutein

Đến nay, Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng

phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây

dược liệu thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập

đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây dược liệu có khả kích thích cây phát

triển tốt thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp hormone tăng trưởng

kích thích cây dược liệu phát triển, góp phần giảm các loại bệnh, giảm chi phí sản xuất

và đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội

sinh với cây chưa được quan tâm nhiều Vì vậy, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật

hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn, nhằm

thay thế các loại kháng sinh tổng hợp giúp giảm tỷ lệ kháng thuốc ở một số mầm bệnh

nguy hiểm sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay

2.6.2 Ngoài nước

Theo Park et al (2005) cho biết cây Diếp cá có khả năng kháng khuẩn cũng

như kháng viêm Ngoài ra, các dịch chiết từ cây Diếp cá còn có thể giúp gia tăng số

lượng tế bào lympho nhanh chóng giúp tăng tính miễn dịch ở người (Lee et al., 2008)

Cây Diếp cá có khả năng ức chế phát triển của vi khuẩn E coli O157- H7 giống

như kháng sinh beta-lactam (Kim et al., 2010)

Chiết xuất của cây Diếp cá ức chế sự tăng trưởng tế bào và gây ra cơ chế tế bào

đối với các tế bào ung thư trực tràng (Lai et al., 2010)

Theo Gon et al (2008), khi nghiên cứu công dụng của cây Diếp Cá (Houttuynia

cordata Thunb.) cho biết dịch trích của cây này có khả năng diệt khuẩn Salmonella

2.7 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.7.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu

kỳ gồm ba giai đoạn (Khuất Hữu Thanh, 2006):

- Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90-95oC, làm đứt các liên kết hydro của

phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau Đoạn DNA khuôn có các đoạn

dài gồm nhiều nucleotide giống nhau, hoặc tỷ lệ G-C càng cao, có nhiệt độ biến tính

(Tm) cao hơn Do vậy cần căn cứ đặc điểm của DNA khuôn để lựa chọn nhiệt độ biến

tính phù hợp, giai đoạn này kéo dài 1 phút đến 2 phút

- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55-65oC để các mồi bắt cặp với các mạch

đơn DNA khuôn ở các đầu 3, theo nguyên lý Chargaff Giai đoạn này khoảng 30-60

giây

- Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70-72oC thích hợp với điều kiện hoạt động của

enzyme DNA polymerase Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn

thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp

với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn

này còn gọi là giai đoạn polymer hóa (polymerization) Thời gian giai đoạn này từ 30

giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA

Chu kỳ gồm ba bước này sẽ được lặp lại nhiều lần khoảng 25-40 (tùy vào ứng

dụng chuyên biệt) Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72oC trong 5

phút, sau đó cho ngừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở

4oC (tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Nguyễn Thị Lang và Bùi

Chí Bửu, 2005)

Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kỳ trước

được làm khuôn ở chu kỳ kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số

nhân Một phản ứng PCR thường thực hiện 20-40 chu kỳ, từ mỗi đoạn DNA khuôn có

thể tạo nên 220-240 bản sao DNA Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở

những chu kỳ sau lượng khuôn tăng, lượng mồi và dNTP tự do giảm, enzyme DNA

polymerase hoạt động yếu dần, do đó cần tính toán hàm lượng mồi dNTP, enzyme để

đảm bảo phản ứng PCR có kết quả tốt nhất

2.7.2 Mồi (primer) sử dụng trong kỹ thuật PCR

Primer là các đoạn oligonucleotide ngắn khoảng 14-15 nucleotide, có vai trò

quyết định thành công của phản ứng PCR Một cặp mồi trong PCR gồm có mồi xuôi F

và mồi ngược R

- Mồi xuôi (sense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3, của mạch khuôn 5,→ 3,

- Mồi ngược (antisense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3, của mạch khuôn 3,→ 5,

Điều kiện chủ yếu của bảo đảm hiệu quả mồi là:

- Mồi không quá ngắn (nhỏ hơn 8 nucleotide) hoặc quá dài (lớn hơn 50

nucleotide), mồi quá ngắn kết quả PCR không chính xác, mồi quá dài khó đảm bảo

thành công của phản ứng PCR Khi thiết kế mồi, nên để dư 1-3 nucleotide ở đầu 5, của

mồi, giúp cho đoạn DNA được nhân lên có trình tự nguyên vẹn

- Trình tự của mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ có thể bắt cặp với đầu 3, của mạch

khuôn Các mồi không được bắt cặp với nhau, hoặc bắt cặp ở giữa mạch khuôn

- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi không được chênh lệch nhau quá lớn

Khoảng cách tiến hóa giữa hai loài có thể đo được bằng sự khác biệt trong

nucleotide hay amino acid của phân tử tương đồng từ hai loài bởi vì số lượng khác biệt

trong chuỗi (sequence) trong một phân tử là một tỉ số không đổi cố định trong mã di

truyền ở DNA Chọn rRNA (Ribosomal RNAs) 16S hay 16S-23S để phân loại và xác

định sự tiến hóa vì:

- Nó tham gia trong quá trình tổng hợp protein nên RNA của ribosome được

chọn để nghiên cứu mối liên hệ tiến hóa trong sinh vật

- RNA của ribosome là những phân tử cổ điển, chức năng cố định, đồng nhất và

đặc trưng cho các loài

- Kích thước của nó vừa phải, thuận lợi cho việc xếp hàng (align) để so sánh các

chuỗi

Bản chất ổn định của các chuỗi rRNA cũng dẫn đến sự phát triển các mẫu dò

DNA, để nhận diện chi vi khuẩn Các mẫu dò này được sử dụng để hình dung các

thành phần chuyên biệt trong bộ gen DNA vi khuẩn cắt giới hạn, được tách riêng ra

bởi điện di Kết quả khuôn giới hạn gen rRNA được sử dụng cho sự khác nhau của các

loài và các dòng bên dưới chi sinh ra, như một công cụ cho sự nhận diện vi khuẩn với

biên độ rộng

Trong mỗi ribô thể có 3 phân tử RNA với loài sơ hạch có 5S, 16S và 23S trong

đó 16S có khoảng 1500 nucleotide và 23S có khoảng 2900 nucleotide, 5S chứa khoảng

120 nucleotide (quá nhỏ) nên ít được nghiên cứu, 16S và 23S được nghiên cứu nhiều

hơn, ở loài chân hạch dùng 18S để nghiên cứu

Chuỗi trình tự 16S rRNA được sử dụng như là một công cụ mạnh mẽ để đánh

giá sự đa dạng di truyền của các vi khuẩn ở các mẫu môi trường (Barker et al., 2003)

2.8 Điện di gel agarose

2.8.1 Nguyên tắc của kỹ thuật điện di

Dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic Các đại phân tử tích điện âm

đồng đều trên khắp bề mặt nên dưới sự tác động của một điện trường sẽ di chuyển về

cực dương của điện trường (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Sau phản ứng PCR, các DNA của vi khuẩn được nhuộm với Ethidium bromide

(EtBr) Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác

dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang Tiến hành điện di sản phẩm trên gel

agarose và quan sát kết quả dưới tia UV có bước sóng 260nm

Thang DNA (DNA ladder): “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” dùng để ước

lượng kích thước các trình tự acid nucleic trong gel agarose, đó là một tập hợp nhiều

trình tự DNA có kích thước đã biết (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

2.8.2 Điện di trên gel agarose

Điện di trên gel agarose là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA sử dụng Agarose

từ 0,3-2,0% làm bản gel, tùy theo kích thước của DNA Nếu kích thước đoạn DNA

nhỏ dưới 1kb, hàm lượng agarose sử dụng 1-2%, trong các phòng thí nghiệm thường

sử dụng hàm lượng Agarose khoảng 0,7-0,8%

2.9 Phương pháp giải trình tự DNA

2.9.1 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy

Nguyên tắc cơ bản là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong

quá trình tổng hợp DNA DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide không có nhóm

3,-OH phản ứng tổng hợp bị ngừng lại Kết quả tạo ra các đoạn oligonucleotide dài

ngắn khác nhau một nucleotide

Thực hiện bốn phản ứng trong 4 ống Eppendorf, mỗi ống có chứa DNA, mồi,

bốn loại dNTP có một loại được đánh dấu phóng xạ (S35 – dATP, dGTP, dCTP,

dTTP), enzyme và các điều kiện thích hợp Ống A thêm 1% ddATP, ống G thêm 1%

ddTTP, ống C thêm 1% ddCTP, ống T thêm 1% ddTTP

Sau khi khuếch đại DNA qua PCR khoảng 25-35 chu kỳ, điện di kết quả thu

được trên gel polyacrylamide Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau di

chuyển với tốc độ khác nhau, tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản

ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch

trên bản gel Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình tự các nucleotide

mạch đơn, có thể biết trình tự các nucleotide trong gen

Tùy theo mục đích giữ mẫu, có thể sử dụng đồng vị phóng xạ S35 hoặc P32 đánh

dấu phóng xạ đoạn mạch khuôn Sử dụng S35 thời gian mất hoạt tính khoảng 3 tháng,

còn P32 khoảng 14 ngày (Khuất Hữu Thanh, 2006)

2.9.2 Giải trình tự gen bằng máy tính giải trình tự gen tự động

Nguyên tắc chung: dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy Máy đọc trình tự cả

trên hai mạch đơn nên có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật Có hai loại

mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA Tiến hành biến tính

DNA trong môi trường có urea và nhiệt độ cao (khoảng 55oC), hai mạch đơn DNA

tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau

Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotide, từ đó tổng hợp

được trình tự sắp xếp của gen (Khuất Hữu Thanh, 2006)

2.9.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã

Trong những năm gần đây lượng thông tin liên quan đến trình tự DNA được

xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lý dưới dạng ngân hàng dữ liệu

(EMBL ở Châu Âu, GenBank ở Mỹ), có thể dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thông

tin trên internet

BLAST là một trong những chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin

sinh học BLAST cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein xem đoạn mà ta

quan tâm có tương cận với đoạn của sinh vật nào trong ngân hàng gen không, khi được

cung cấp một thư viện hay dữ liệu các chuỗi đó Để chạy BLAST cần đầu tư hai chuỗi:

chuỗi đích và cơ sở dữ liệu chuỗi Chuỗi đích nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu

Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N,

TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide-Nucleotide BLAST) cho phép so sánh

cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu (Kent, 2002)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực hiện

Thời gian: Tháng 6/2014 – 11/ 2014

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Phòng Thí nghiệm Sinh hóa, Phòng thí

nghiệm Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,

Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Vật liệu

- Rễ, thân và lá của cây Diếp cá thu ở huyện Châu Thành và huyện Lai Vung

thuộc tỉnh Đồng Tháp

- Chủng vi khuẩn Escherichia coli được cung cấp từ phòng thí nghiệm Sinh

học phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường

Đại học Cần Thơ

- Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila được cung cấp từ bộ môn Bệnh học

Thủy sản - Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ

- Máy lắc mẫu – GFL3005 (Đức)

- Kính hiển vi – Meji (Nhật); Trắc vi thị kính – Olympus (Nhật)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt – Pbinternational (Đức)

- Cân điện tử - Startorius (Đức)

- Nước cất hai lần vô trùng

- Chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1)

- Dung dịch TE gồm các thành phần sau: 1% Triton X - 100, 1M Tris HCl -

8,5, 0,5 M EDTA - 8,0, nước cất vô trùng