Nguyên tắc cơ bản là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide không có nhóm 3,-OH phản ứng tổng hợp bị ngừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide.
Thực hiện bốn phản ứng trong 4 ống Eppendorf, mỗi ống có chứa DNA, mồi, bốn loại dNTP có một loại được đánh dấu phóng xạ (S35 – dATP, dGTP, dCTP,
dTTP), enzyme và các điều kiện thích hợp. Ống A thêm 1% ddATP, ống G thêm 1% ddTTP, ống C thêm 1% ddCTP, ống T thêm 1% ddTTP.
Sau khi khuếch đại DNA qua PCR khoảng 25-35 chu kỳ, điện di kết quả thu được trên gel polyacrylamide. Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình tự các nucleotide mạch đơn, có thể biết trình tự các nucleotide trong gen.
Tùy theo mục đích giữ mẫu, có thể sử dụng đồng vị phóng xạ S35 hoặc P32 đánh dấu phóng xạ đoạn mạch khuôn. Sử dụng S35 thời gian mất hoạt tính khoảng 3 tháng, còn P32 khoảng 14 ngày (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.9.2. Giải trình tự gen bằng máy tính giải trình tự gen tự động
Nguyên tắc chung: dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn nên có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Có hai loại mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA. Tiến hành biến tính DNA trong môi trường có urea và nhiệt độ cao (khoảng 55oC), hai mạch đơn DNA tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau.
Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotide, từ đó tổng hợp được trình tự sắp xếp của gen (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.9.3. Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã
Trong những năm gần đây lượng thông tin liên quan đến trình tự DNA được xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lý dưới dạng ngân hàng dữ liệu (EMBL ở Châu Âu, GenBank ở Mỹ), có thể dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thông tin trên internet.
BLAST là một trong những chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học. BLAST cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein xem đoạn mà ta quan tâm có tương cận với đoạn của sinh vật nào trong ngân hàng gen không, khi được cung cấp một thư viện hay dữ liệu các chuỗi đó. Để chạy BLAST cần đầu tư hai chuỗi: chuỗi đích và cơ sở dữ liệu chuỗi. Chuỗi đích nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu.
Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N, TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide-Nucleotide BLAST) cho phép so sánh
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian – Địa điểm thực hiện Thời gian: Tháng 6/2014 – 11/ 2014 Thời gian: Tháng 6/2014 – 11/ 2014
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Phòng Thí nghiệm Sinh hóa, Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Vật liệu
- Rễ, thân và lá của cây Diếp cá thu ở huyện Châu Thành và huyện Lai Vung thuộc tỉnh Đồng Tháp.
- Chủng vi khuẩn Escherichia coli được cung cấp từ phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ.
- Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila được cung cấp từ bộ môn Bệnh học Thủy sản - Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3. Dụng cụ - Thiết bị - Đĩa petri - Đĩa petri - Ống nghiệm - Cối và chày sứ - Eppendorf 2.2mL, Eppendorf 1.5mL - Ống đong 10mL, 100mL - Cốc thủy tinh 10mL, 100mL, 200mL - Kẹp, kim cấy, que trải mẫu
- Đèn cồn
- Lame, Lammelle – Duhan group (Đức). - Máy Vortex
- Tủ cấy vi sinh vật – Biosafe II – ESCO (Singapore). - Tủ ủ vi sinh vật – Binder (Đức).
- Máy lắc mẫu – GFL3005 (Đức).
- Kính hiển vi – Meji (Nhật); Trắc vi thị kính – Olympus (Nhật). - Nồi khử trùng nhiệt ướt – Pbinternational (Đức)
- Cân điện tử - Startorius (Đức) - pH kế - Hanna (Mỹ)
3.1.4. Hóa chất
3.1.4.1.Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn - Crystal violet - Crystal violet - Iod - Fushin - Ethanol 70% - Nước cất vô trùng 3.1.4.2.Hóa chất trích DNA - Ethanol 70% - TE pH (8) - SDS 10% - Isopropanol - CTAB 10%/NaCl 0,7M - Proteinase K (20 mg/mL) - Nước cất hai lần vô trùng
- Chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1)
- Dung dịch TE gồm các thành phần sau: 1% Triton X - 100, 1M Tris HCl - 8,5, 0,5 M EDTA - 8,0, nước cất vô trùng
3.1.4.3.Hóa chất thực hiện phản ứng PCR - Nước cất 2 lần khử trùng. - Nước cất 2 lần khử trùng. - PCR buffer - dNTPs ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - Taq polymerase - DNA vi khuẩn
Để nhận diện vi khuẩn nội sinh sống trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16s rRNA (Lane,1991) được thiết kế với trình tự sau:
27F: 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC - 3’ 1492R: 5’ – TACGGTTACCTTGTTACGACT - 3’ Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) Thành phần Thể tích (μl) Nước cất 2 lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 Mồi xuôi 27F 0,25 Mồi ngược 1492R 0,25 dNTPs 4,0
Taq polymerase (5U/μl) 0,25
DMSO 0,5
DNA vi khuẩn 2,0
Tổng thể tích 25
3.1.4.4.Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh Bảng 2: Môi trường PDA Bảng 2: Môi trường PDA
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Khoai tây 200
Dextrose 20
Agar 20
pH 6,5 ± 0,2
Thêm vừa đủ 1000mL nước cất
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường).
3.1.4.5. Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+Bảng 3: Môi trường NFb (Krieg và Dobereiner, 1984) Bảng 3: Môi trường NFb (Krieg và Dobereiner, 1984)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Acid malic 5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,1 CaCl2 0,02 KOH 4,5 Dung dịch vi lượng 2mL Dung dịch Vitamin 1mL Dung dịch FeEDTA 1,64% 4mL
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2mL
pH 6,8
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường).
Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Na2MoO4.2H2O 1
MnSO4.H2O 1,5
H2BO3 1,4
CuSO4 0,4
ZnSO4.7H2O 0,12
Thêm nước cất vào cho đủ 1000mL
Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin
Hóa chất Liều lượng (mg/l)
Biotin 10
Pyridyoxyl – HCl 20
3.1.4.6.Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Đường ăn 10 MgSO4.7H2O 0,25 Ca3(PO4)2 5 MgCl2.6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 3mL
Agar 20
pH 7,2
3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Thu thập và xử lý mẫu 3.2.1. Thu thập và xử lý mẫu
Thu thập
Hai mẫu Diếp cá được thu ở huyện Châu Thành và một mẫu Diếp cá được thu ở huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp.
Dùng dao đào đất xung quanh cây Diếp cá để có thể thu được toàn bộ cây Diếp cá. Sau đó cho vào bọc nylon và mang về phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật để tiến hành xử lý mẫu và phân lập.
Xử lý mẫu
Tách phần đất bám xung quanh rễ. Cho 20g đất hòa tan vào 80mL nước cất để sử dụng vào việc đo pH của đất vùng rễ.
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá dưới vòi nước chảy. Tách rời rễ, thân và lá cây Diếp cá (để ráo tự nhiên, để riêng từng bộ phận trong bọc nylon buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (5°C) nếu chưa phân lập ngay).
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm rồi làm khô chúng bằng giấy hút ẩm.
Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% (trong 30 giây), rửa sạch lại bằng nước cất, tiếp tục khử trùng bằng dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy trải lên môi trường PDA đặc
để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có khuẩn lạc phát triển thì cần phải xử lý khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật có trong đất.
3.2.2. Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem giã nhuyễn trong cối, sau đó cho thêm 1 - 2mL nước cất vô trùng vào mẫu và trộn đều.
Hút 100µl phần dịch trong cho vào 900µl nước cất đã chuẩn bị sẵn trong Eppendorf (đã được pha loãng 5 lần), đem vortex. Tiến hành pha loãng mẫu 10 lần, 100 lần,… nếu cần thiết.
Hút 100µl dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi trường NFb bán đặc, đậy nắp lại rồi đem ủ ở 30°C để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 2 - 3 ngày ủ, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một vòng màu trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 2 - 6mm. Hút 5µl dung dịch từ vòng pellicle cấy trải sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30°C để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Sau 2-3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, đều và phải nằm trên đường cấy tiến hành cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng. Trữ mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường PDA đặc (thạch nghiêng).
3.2.3. Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và kích thước vi khuẩn
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng, kích thước và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
- Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Khử trùng kim cấy hay kim mũi giáo trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy, lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45°, hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
- Quan sát mẫu vật: quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học từ vật kính 10X sang vật kính 40X, để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
Đo kích thước tế bào vi khuẩn
Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong nước cất vô trùng tiếp tục đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
Cách chuẩn bị mẫu:
- Nhỏ 10µl nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. - Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45°, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính được dùng để đo kích thước tế bào vi khuẩn
- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính.
- Thước trắc vi thị kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm, được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài là 10µm.
Phương pháp đo:
- Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh cho thấy ảnh rõ của thước. - Xê dịch thước trắc vi thị kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với 1 vạch của thước trắc vi thị kính và 1 vạch thứ 2 nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
- Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. - Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau:
m n
N x *10
N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35
- Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. Di chuyển vi mẫu sao cho 1 đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm vạch thứ 2 trùng với đầu kia của mẫu đo.
- Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính nằm trong hai vạch này.
- Tính kích thước của vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của 2 thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.4. Nhuộm Gram vi khuẩn
Sau khi quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn. Quy trình nhuộm Gram được thực hiện như sau:
- Lấy 10µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhầm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để yên 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ từ 1-2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy cà để trong một phút. - Rửa bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ 1-2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để yên 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.5. Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ 3.2.5.1.Nguyên tắc 3.2.5.1.Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982).
3.2.5.2.Hóa chất
- Chuẩn bị dung dịch KCl : Hòa tan 15g KCl vào nước cất để được 100mL. - Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào nước cất để được 1000mL. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 4mL Stock (NH4+) để được 200mL, sau cùng được dung dịch 2µg/mL.
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside vào nước cất để được 500mL.